Küçük Hayvan Modellerinde Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Subkonjonktival Uygulaması

Özet

Bu yazıda, subkonjonktival enjeksiyon, mikroenjeksiyon iğneleri ile birlikte infüzyon/geri çekilme şırınga pompası ve gaz geçirmez çıkarılabilir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak farelerde oküler dokular için geçerli bir vektör dağıtım yöntemi olarak gösterilmiştir. Bu enjeksiyon sistemi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir.

Özet

Oküler hastalıklar, çoklu uygulama yolları üzerinden göreceli olarak erişilebilirliklerinin kolaylığı nedeniyle lokal ilaç dağıtımı için cazip hedefler olan çok çeşitli kalıtsal genetik ve edinsel bozuklukları içerir. Subkonjonktival (SCJ) enjeksiyonlar, basit, güvenli ve genellikle ayakta tedavi ortamında gerçekleştirildikleri için diğer göz içi uygulama yollarına göre avantajlar sunar. Küçük hayvanlarda SCJ enjeksiyonları genellikle gözün büyüklüğü nedeniyle ameliyat mikroskobunun yardımını gerektirir. Önceki çalışmalar, spesifik adeno ilişkili virüs (AAV) serotiplerinin SCJ enjeksiyonunun, oküler yüzeyin, göz kasının ve optik sinirin hedeflenen transdüksiyonu için geçerli bir gen dağıtım stratejisi olduğunu ve birçok oküler hastalığın tedavisi için potansiyel bir yaklaşım sağladığını göstermiştir.

Burada, programlanabilir bir infüzyon / geri çekilme şırınga pompasından (tutarlı ve hassas enjeksiyon hızı ve basıncına izin veren) ve mikroenjeksiyon iğneleriyle birleştirilmiş gaz geçirmez çıkarılabilir bir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak bir fare modelinde SCJ enjeksiyonları için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Enjeksiyon sistemi, küçük hayvanlarda intrastromal, intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir. Oküler gen terapisi çalışmaları için adeno ilişkili viral vektörlerin verilmesi tarif edilmesine rağmen, buradaki protokol küçük hayvan modellerinde çeşitli oftalmik çözeltiler için de uyarlanabilir. Uygulama yolundaki temel pratik adımlar, enjeksiyon platformu için kurulum, enjeksiyonun hazırlanması ve doğrudan deneyimden elde edilen ipuçları ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Ek olarak, istenen dokulara AAV doğum onayı için yaygın doğrulama teknikleri de kısaca tartışılacaktır.

Giriş

Oküler hastalıklar hem genetik hem de edinsel bozuklukların geniş bir yelpazesini kapsar. 2015 yılında, dünya çapında tahmini 36 milyon insan yasal olarak kördü ve 1 milyardan fazla insan en azından bir miktar görme bozukluğundan muzdaripti ve bu da hafifletme çabalarını her seviyede ölçeklendirme ihtiyacını vurguladı¹. Oküler ilaçların verilmesi için ana yöntemler, göz damlası veya subkonjonktival (SCJ), intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi hem topikal hem de lokal uygulamayı içerir. Noninvaziv topikal tedavi oftalmik ilaçlar için en yaygın dağıtım yöntemi olmasına ve birçok ön segment bozukluğunda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kornea anatomik bariyerlerinin varlığı, topikal olarak uygulanan maddelerin biyoyararlanımı, biyodağılımı ve etkinliği için bir zorluk teşkil etmekte ve bu da iç gözün birçok hastalığı için en iyi aday tedavi yolu olmayabileceğini düşündürmektedir. Hastalıktan etkilenen spesifik oküler kompartmana lokal enjeksiyonun daha etkili ve hedefe yönelik bir ilaç dağıtım yaklaşımı olması muhtemeldir². Bununla birlikte, tekrarlanan enjeksiyonlardan kaynaklanan olumsuz etkiler uygulama stratejilerini karmaşıklaştırabilir. İdeal olarak, bir terapi tek bir uygulamayı takiben uzun süreli terapötik etkinliği korumalıdır. Bu nedenle, gen tedavisi, gerekli enjeksiyon sayısını en aza indirmek ve oküler hastalığın tedavisi için sürekli transgen ekspresyonu sağlamak için umut verici bir seçenektir ^3,4.

Gen tedavisi için çok sayıda viral ve viral olmayan vektör mevcuttur; Bununla birlikte, AAV vektörleri mükemmel güvenlik profilleri nedeniyle yüksek ilgi görmektedir. AAV, başlangıçta 1965 yılında Atchison ve ark. tarafından bir adenovirüs preparatının kirleticisi olarak keşfedilen küçük, tek sarmallı, zarfsız bir DNA virüsüdür.5,6 AAV daha sonra 1980'lerde gen iletimi için etkili bir viral vektör olarak tasarlanmış ve oküler bozukluklar da dahil olmak üzere birçok hastalık için tercih edilen gen terapisi vektörü haline gelmiştir. son birkaç on yılda. Bunlardan en önemlisi, nadir görülen bir arka göz hastalığı olan Leber'in Konjenital Amaurosis'ini tedavi etmek için Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanan ilk ticari olarak temin edilebilen gen terapisi ilacı voretigene neparvovec'tir. Voretigene neparvovec, klinik gelişimin önündeki engelleri başarıyla aşmış olsa da, ek oküler gen tedavilerinin ticarileştirilmesi için zorluklar devam etmektedir. Örneğin, voretigene neparvovec, subretinal enjeksiyon yoluyla canlı retinal hücreleri tutan hastalara uygulanır. Bu nedenle, canlı retinal hücrelerden yoksun olan hastalığın daha ileri formlarına sahip hastalar, klinik fayda sağlamayacağı için tedavi için uygun değildir. Ek olarak, göz iltihabı, katarakt, retina yırtılması, makülopati ve ağrı dahil olmak üzere subretinal enjeksiyon prosedürü ile ilişkili bilinen komplikasyonlar gözlenmiştir ^7,8. Bu prosedürle ilgili diğer endişeler arasında kanama, retina dekolmanı, endoftalmi ve göz^{dokusu yıkımı} yoluyla oküler immün ayrıcalıklı durumun iptal edilmesi olasılığı 9,10,11,12 sayılabilir. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonu gibi daha az invaziv gen dağıtım yollarını keşfetme çabaları giderek daha önemli hale gelmiştir 13,14,15,16,17.

Konjonktiva, 3-5 kat hücre içeren ve ön gözü iç göz kapağına bağlayan ince bir zardır. SCJ enjeksiyonları klinik olarak yaşa bağlı makula dejenerasyonu, glokom, retinit ve posterior üveit gibi oküler hastalıkların tedavisinde gözün hem ön hem de / veya arka segmentlerine oftalmik ilaç verilmesi için kullanılır^18,19. Uygulanması nispeten basittir, ayaktan^tedavi ortamında oftalmik ilaç dağıtımı için rutin olarak kullanılırlar, biraz ağrısızdırlar, oküler immün ayrıcalıktan ödün vermezler ve uygulanan ilaçların optik siniri kapsayan geniş bir periorbital bölgeye yayılmasına izin verirler. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonları AAV gen terapisi uygulamaları için cazip bir uygulama yoludur. Farelerde SCJ enjeksiyonu ile uygulanan doğal AAV serotipleri daha önce güvenlik, transdüksiyon etkinliği, serum immünojenisitesi, biyodağılım ve doku özgüllüğü ^13,16,21 ile karakterize edilmiştir. Bu veriler, SCJ uygulaması yoluyla bireysel oküler dokulara gen iletiminin resmi bir olasılık olduğunu göstermiştir.

Bu yazıda, bir fare modelinde AAV vektörleri sunmak için SCJ enjeksiyonu için basit ve uyarlanabilir bir protokol açıklanmaktadır. Bu yaklaşımın tekrarlanabilirliğini sağlamak için, bir stereomikroskop, programlanabilir bir infüzyon / geri çekilme şırınga pompası (tutarlı ve hassas enjeksiyon hızı ve basıncı sağlayan) ve mikroenjeksiyon iğneleri ile birleştirilmiş gaz geçirmez çıkarılabilir bir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi tanımlanmıştır. Bu sistem, küçük hayvanlarda intrastromal, intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi diğer göz içi uygulama yolları için uyarlanabilir. Ek olarak, AAV enjeksiyon bölgesinin görselleştirilmesine izin vermek için sıklıkla bir floresein boyası kullanılır. Uygulama yolundaki temel pratik adımlar, enjeksiyon platformu için kurulum, enjeksiyonun hazırlanması ve doğrudan deneyimden elde edilen ipuçları ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Son olarak, istenen dokulara AAV iletiminin doğrulanması için yaygın validasyon teknikleri kısaca tartışılacaktır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirildi. AAV vektörlerinin kullanımı Biyogüvenlik Seviye 1 biyolojik tehlike riskidir. AAV'yi kullanırken laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Burada açıklanan deney için, serotip 8 kapsid ile paketlenmiş ve yeşil floresan proteininin (GFP) ekspresyonunu kontrol eden jenerik bir ubiquitous sitomegalovirüs (CMV) promotörünü kodlayan bir rekombinant AAV vektörü kullanılmıştır.

1. AAV vektör işleme ve depolama

1. Virüsü -80 °C'lik bir dondurucuda, silikonize veya düşük retansiyonlu mikrosantrifüj tüplerinde 100 μL alikotlarda saklayın.
2. Kullanmadan önce tüm vektör stok çözümlerini buz üzerinde çözün.
   NOT: Sodyum floresein çözeltisi (% 0.1-2'lik bir son konsantrasyonda) gibi boyalar, enjekte edilen çözeltiyi görselleştirmek için genellikle AAV vektörleri ile karıştırılır. Ek olarak, enjekte edilen çözeltilerin görselleştirilmesi, hava kabarcıklarının tespit edilmesine ve enjeksiyondan sonra AAV dağılımının ve / veya sızıntının izlenmesine yardımcı olur.

2. Subkonjonktival (SCJ) enjeksiyon

1. Enjeksiyon sistemini monte edin.
   1. Enjeksiyon sistemini monte etmek için, bir biyogüvenlik kabinine bir stereomikroskop ve bir şırınga pompası yerleştirin.
      NOT: Enjeksiyonları yüksek hassasiyetle gerçekleştirmek için bir infüzyon pompası gereklidir. Burada, 0,5 μL ila 60 mL arasında değişen hacimlerde şırıngalar için sıkı bir kavrama ve güvenli bir şırınga kelepçesi içeren Standart bir İnfüze / Geri Çekme Programlanabilir Şırınga Pompası kullanılmıştır ( Malzeme Tablosuna bakınız). Bu pompa aynı zamanda 1,28 pl/dk'dan 88,28 ml/dk'ya kadar yüksek doğruluk ve pürüzsüz akış hızları ile gelişmiş akış performansı sunar.
   2. Polietilen boruyu yaklaşık 50 cm uzunluğa kadar kesin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   3. 36 G'lik bir iğnenin göbek ucunu borunun uçlarından birine yerleştirin.
      NOT: Sızıntı olmadığından emin olmak için iğne göbeği ucunu ~ 3 mm boyunca boruya kaydırın. 36 G iğne, sonraki SCJ enjeksiyonu için kullanılır. 32 G ile 36 G arasında değişen iğneler, SCJ enjeksiyonları için en yaygın kullanılan boyutlardır. Bu adıma yardımcı olmak için bir hemostat kullanılması, potansiyel keskin yaralanma riskini önlemek için şiddetle tavsiye edilir.
   4. Tek kullanımlık 3 mL'lik bir şırıngayı steril suyla doldurun; Bu tek kullanımlık şırıngayı tüpün iğnenin karşısındaki tarafına yerleştirin ve suyu boru/iğne boyunca yıkayın. Bu adımı% 70 alkolle tekrarlayın.
   5. Boruyu dezenfekte etmek ve boru boyunca sızıntı, tıkanma veya hasar gözlenmemesini sağlamak için 2.1.4 adımını steril su ve% 70 alkol ile dönüşümlü olarak üç kez daha tekrarlayın.
   6. Boruyu steril suyla doldurmak için tek kullanımlık 3 mL şırıngayı kullanın ve boruyu tek kullanımlık şırıngaya bağlı bırakın.
   7. Tezgah yüzeyine bir parça parafilm yerleştirin ve üzerine bir steril su havuzu ekleyin (~ 1 mL). İğneye bağlı borunun bir kısmını steril su havuzuna batırın. Şırınganın çıkarılmasından sonra herhangi bir havanın boru/iğne sistemine girmesini önlemek için tek kullanımlık şırıngayı karşı uçtaki tüp açıklığından dışarı çekin. Borunun iğneye bağlı kısmını su havuzuna batırılmış halde bırakın.
      NOT: Laminer başlıkta 2.1.4 ila 2.1.7 arasındaki prosedürleri uygulayın.
   8. 10 μL Hamilton şırınga/iğnesini steril suyla doldurun ve şırıngadaki havayı önleyin. Hamilton şırıngasının tüpünü ve iğne ucunu parafilm üzerindeki steril su havuzuna batırarak Hamilton şırıngasını / iğnesini borunun kalan açık ucuna bağlayın.
   9. İtici bloğu şırınganın yaklaşık uzunluğuna taşımak için pompa ekranındaki hızlı geri vites düğmesine basın. İtici ve şırınga tutucu bloklar üzerindeki tutucu braketleri gevşetmek için braket sıkıştırma düğmelerini sökün. Hamilton şırıngasını şırınga tutucu bloğuna yükleyin ve üreticinin talimatlarını izleyerek şırıngayı sabitleyin.
      NOT: Şırıngayı sabitlemek için, şırınga namlu kelepçesi şırınga namlusuna sıkıca tutturulmalıdır; Bununla birlikte, özellikle cam şırıngaları kullanırken aşırı sıkmayın. Şırınga pistonu, itici blok tutma braketi ile sabitlenmelidir.
   10. Pompa ayarları ekranından parametreleri ayarlayın.
       1. Kuvvet düğmesine basın ve kuvvet seviyesini %30 olarak ayarlayın. Ayarlar ekranına geri dönmek için değişiklikleri kabul edin.
       2. Hızlı başlat düğmesine basın ve Yöntem | Demleyin/çekin.
       3. Şırınga için Hamilton 1700, cam, 10 μL'yi seçin. İnfüzyon ve geri çekilme hızını ve enjeksiyon hacmini seçin.
          NOT: Kuvvet seviyesi , şırınga tipine / malzemesine / kapasitesine / üreticilerine bağlı olarak ayarlanır; Her şırınga için önerilen kuvvet için fabrika üreticisinin talimatlarına bakın. Bu deneyde kullanılan enjeksiyon hızı 200 nL / s idi. SCJ enjeksiyonları nispeten güvenlidir ve enjeksiyondan kaynaklanan yüksek göz içi basıncının (IOP) indüksiyonu için daha az endişe vardır. İğneye reflüyü önlemek ve hayvanlar arasındaki enjeksiyonlarda tutarlılığı korumak için bazı uygulamalar için daha yavaş bir enjeksiyon hızı genellikle arzu edilir.
   11. Suyu Hamilton şırıngasından çıkarın, ancak boru ve enjeksiyon iğnesini suyla dolu bırakın. Boruya/iğneye küçük bir hava kabarcığı sokmak için Geri düğmesine basarak Hamilton şırıngasını hafifçe geri çekin.
       NOT: Hava kabarcığı, tüpteki su ile terapötik ilaç (bu durumda, AAV) arasında bir bariyer görevi görecek ve uygulanan dozun doğruluğunu sağlayacaktır.
   12. Enjeksiyon iğnesini virüs stoğunun bir aliquot'una yerleştirerek virüsü geri çekin. Virüs ile tüpteki su arasında görünür bir hava kabarcığı kaldığından emin olun.
       NOT: AAV vektörleri plastik boru ve metal iğneye bağlanabilir, bu da virüs kaybına ve / veya yanlış dozaj rejimlerine neden olabilir. Bu nedenle, titizlik, tekrarlanabilirlik ve doğru bir AAV dozu sağlamak için, daha sonra AAV ile temas eden yüzeylerin önceden kaplanması önerilir. Tüp/iğne sistemini virüsle kaplamak için, viral vektör solüsyonunu tüp/iğnenin içine çekin ve iğne ve/veya tüpün duvarına virüs bağlanmasının doygunluğuna izin vermek için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Virüsü atın.
2. Virüs enjeksiyonu
   1. Fareyi inhale anestezi (izofluran) veya intraperitoneal ketamin / ksilazin / asepromazin enjeksiyonu ile anestezi yapın. Anestezinin cerrahi düzlemini, sert ayak parmağı sıkışmalarına yanıt eksikliği ile onaylayın.
      NOT: En az 6 haftalık dişi ve/veya erkek C57BL/6J veya BALB/c fareleri kullanın. Ketamin / ksilazin / asepromazin dozları aşağıdaki gibidir: 70 mg / kg'da ketamin, 7 mg / kg'da ksilazin ve 1.5 mg / kg'da asepromazin.
   2. Enjeksiyonu alacak göze topikal anestezi uygulayın.
      NOT: Topikal anestezi için %0.1 proparakain hidroklorür ve/veya tetrakain hidroklorür oftalmik solüsyon (%0.5) kullanın.
   3. Kuruluk ve yaralanmayı önlemek için enjeksiyon almayacak diğer göze topikal merhem uygulayın.
   4. Fareyi mikroskobik sahneye yerleştirin ve fare gözünü stereomikroskop altında ortaya çıkarın.
   5. İki parmağınızı göz kapağına yerleştirin ve göz kapağını skleraya bağlayan iç zar olan konjonktivayı ortaya çıkarmak için farenin gözünden hafifçe çekin.
   6. Konjonktivayı forseps ile tutun.
   7. Göz kapağını serbest bırakın ve iğneyi baskın eli kullanarak eğim yukarı bakacak şekilde tutun.
   8. İğneyi konjonktivaya yerleştirin. İğneyi, konik konjonktiva zarı tarafından tamamen kaplanana kadar yerleştirin. İğneyi dünyaya yaslayın.
      NOT: Konjonktiva şeffaf bir membran olduğundan, iğne ucu / eğimi kolayca görülebilir.
   9. Ayak pedalını kullanarak Başlat düğmesine basarak enjeksiyonu başlatın.
      NOT: Havanın hareketi ve Hamilton pistonu senkronize edilir; herhangi bir gecikme, enjeksiyon sistemindeki aşırı havayı veya muhtemelen boru, iğne ve / veya şırınga bileşenleri arasında gevşek bir bağlantıyı gösterir.
   10. Enjeksiyon bittikten sonra, geri akış olasılığını azaltmak için iğneyi konjonktivadan çekmeden önce iğneyi 10 s yerinde tutun.
       NOT: SCJ enjeksiyonunun yapıldığı yerde bir bleb'in görünmesi yaygındır. Bu tür lekeler normalde enjeksiyondan sonraki birkaç saat içinde tamamen çözülür.
   11. Oküler kuruluk/yaralanmayı önlemek için topikal yağlayıcı jeli farenin gözlerine bir damla koyun ve ardından iyileşmek için fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin.
   12. Enjeksiyon sonrası oküler anormallikleri değerlendirmek için gözyaşı üretimi, GİB ve yarık lamba muayenesi gibi oküler muayeneleri kornea floresein boyama ile birlikte yapın.
       NOT: Gözyaşı üretimi bir Fenol Kırmızı İplik testi ile ölçülür ve fare gözünün IOP'sini incelemek için genellikle bir tonometre kullanılır. İntravitreal enjeksiyonlar gibi bazı göz içi enjeksiyonların GİB'de anlamlı bir artışa neden olabileceği bildirilmektedir; Bununla birlikte, SCJ enjeksiyonundan sonra GİB değişiklikleri belirgin değildir 13,22,23,24.
3. Subkonjonktival enjeksiyon sonrası AAV biyodağılım ve transdüksiyon etkinliği incelemesi
   1. SCJ ile iletilen AAV vektörlerinin viral genom biyodağılımını ve / veya transdüksiyon profilini araştırmak için, fareleri AVMA onaylı yöntemle ötenazileştirin.
      NOT: Bu deneyde, fareler enjeksiyondan 8 hafta sonra kurban edildi.
   2. Hedeflenen oküler kompartmanlarda biyodağılım ve transgen ekspresyonu için, göz kapakları, kornea, konjonktiva, göz kası, retina ve optik sinir gibi ilgili dokuları diseke edin. Tüm dokuları flaşla dondurun ve -80 °C'de saklayın. Tüm vücut AAV biyodağılımını incelemek için, submandibuler lenf düğümleri ve karaciğer gibi organları toplayın ve flaş dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
   3. Bir DNA / RNA ekstraksiyon kiti kullanarak, sırasıyla transgen ekspresyonunu ve AAV biyodağılımını incelemek için aynı örnekten gDNA ve RNA toplayın. Sadece vektör biyodağılımı isteniyorsa, gDNA'yı çıkarmak için bir DNA ekstraksiyon kiti kullanın.
   4. AAV vektör biyodağılımını ve cDNA bolluğunu belirlemek için vektör transgenine özgü primerler/problar^13,25 kullanarak standart qPCR ve RT-qPCR gerçekleştirin.
   5. Histoloji analizi için gözleri sabitleyin, parafine gömün ve 5 μm kalınlığında kesin. Transgen ekspresyonu^26'yı ortaya çıkarmak için standart immünofloresan boyama işlemini gerçekleştirin.

Sonuçlar

Subkonjonktival boşluğa enjekte edilen çözelti, enjeksiyon hacmine bağlı olarak bir bleb olarak ortaya çıkar.
Bu deneyde,% 0.1'lik son konsantrasyonda floresein ile karıştırılmış 7 μL AAV (7 × 10⁹ viral genom (vg) / göz), stereomikroskop altında 36 G'lik bir iğne ile enjekte edildi ve enjeksiyon hızı / basıncı, 1 μL / s'de programlanabilir bir şırınga pompası kullanılarak sabit tutuldu. Enjeksiyon sırasında bir bleb görünebilir (ok). Murin SCJ bölmesine AAV...

Tartışmalar

AAV aracılı gen tedavisi, oküler hastalıkların tedavisinde büyük potansiyele sahiptir. Günümüzde oküler gen tedavisi intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar olmak üzere iki ana lokal uygulama yoluna dayanmaktadır. Ne yazık ki, her iki yol da invazivdir ve retina dekolmanı, katarakt oluşumu ve endoftalmi gibi ciddi komplikasyonlara neden olabilir. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonu gibi nispeten daha az invaziv yolların araştırılması büyük ilgi çekicidir.

Bu teknik nispeten ba...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
36 G NanoFil Needles	World Precision Instruments	NF36BV-2
AAV vector	University of North Carolina at Chapel Hill	/
Acepromazine	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
anti-GFP antibody	AVES labs Inc.
Digital camera	Cannon	Cannon EOS T5i
DNA/RNA extraction kit	Qiagen	80204
Forceps	Fine Science Tools	F6521
Hamilton syringe	Hamilton	7654-01
India ink	StatLab	NC9903975
Ketamine hydrochloride injection solution	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
Moisture-resistant film	Parafilm	807-6
Polyethylene tubing	Becton Dickinson and Company	427401
Proparacaine 0.1%	Bausch Health US	NDC 24208-730-06
Rebound tonometer	Tonovet	/
Sodium fluorescein solution	Sigma-Aldich	46960
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Bioscience	70-4504
Stereo microscopye	Leica	Mz6
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch and Lomb	Rx only
Topical ointment	GenTeal	NDC 0078-0429-47
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads	ZONE-QUICK	PO6448