光ピンセットとデフォーカス顕微鏡を用いた赤血球の粘弾性特性の定量的解析

要約

ここでは、細胞のレオロジー特性を測定するための光ピンセットとデフォーカス顕微鏡に基づく統合プロトコルについて説明します。このプロトコルは、さまざまな生理病理学的条件下での赤血球の粘弾性特性の研究に広く適用できます。

要約

赤血球の粘弾性特性は、さまざまな技術によって研究されています。ただし、報告されている実験データはさまざまです。これは、細胞の正常な変動性だけでなく、細胞応答の方法とモデルの違いにも起因します。ここでは、光ピンセットとデフォーカス顕微鏡を使用した統合プロトコルを使用して、1Hz〜35Hzの周波数範囲で赤血球のレオロジー的特徴を取得します。光ピンセットは赤血球複合体弾性定数の測定に使用されますが、デフォーカス顕微鏡は、複雑な弾性定数を複雑なせん断弾性率に変換できるパラメータである細胞の高さプロファイル、体積、およびそのフォームファクターを取得できます。さらに、軟質ガラス状レオロジーモデルを適用すると、両方の弾性率に対するスケーリング指数が得られる。開発された方法論は、いくつかの生理学的および病理学的条件について、明確に定義された実験条件下で得られたそれらの粘弾性パラメータを特徴付ける、赤血球の機械的挙動を探索することを可能にする。

概要

赤血球としても知られる成熟赤血球(RBC)は、人体の最も狭い毛細血管を通過するときに、そのサイズが2倍以上伸びることができます¹。そのような能力は、外部負荷を受けたときに変形するそれらの独特の能力に起因する。

近年、さまざまな研究がRBC^表面2,3でこの特徴を特徴付けています。外部荷重による材料の弾性応答と粘性応答を記述する物理学の分野は、レオロジーと呼ばれます。一般に、外力が加えられると、結果として生じる変形は材料の特性に依存し、エネルギーを蓄える弾性変形とエネルギーを放散する粘性変形に分けることができます⁴。赤血球を含むすべての細胞は粘弾性挙動を示します。言い換えれば、エネルギーは蓄えられ、散逸されます。したがって、セルの粘弾性応答は、その複素せん断弾性率G*(ω)= G'(ω)+ iG"(ω)によって特徴付けることができ、ここでG'(ω)は弾性挙動に関連する貯蔵弾性率であり、G"(ω)はその粘度⁴に関連する損失弾性率である。さらに、現象論的モデルは細胞応答を記述するために使用されており、最も使用されているものの1つは、負荷周波数に対する複素せん断弾性率のべき乗則依存性を特徴とする軟質ガラス状レオロジーモデル⁵と呼ばれる。

単細胞ベースの方法は、力を加え、課せられた荷重の関数として変位を測定することにより、RBCの粘弾性特性を特徴付けるために採用されています^2,3。しかし、複素せん断弾性率については、文献にはほとんど結果がありません。動的光散乱を用いて、RBC貯蔵および損失弾性率の値は、1〜100Hzの周波数範囲で0.01〜1Paの範囲で変化して報告^{された6。}光磁気ツイストサイトメトリーを用いることにより、見かけの複素弾性^{率が得られ7}、比較のために、おそらく不一致を明らかにするために乗法係数が主張されました。

最近では、時間依存的な負荷に対するヒト赤血球のせん断弾性率の貯蔵と損失を定量的にマッピングするための統合ツールとして、光ピンセット(OT)とデフォーカス顕微鏡(DM)に基づく新しい方法論が確立されました^8,9。さらに、柔らかいガラス状のレオロジーモデルを使用して結果を適合し、赤血球^8,9を特徴付けるべき乗則係数を取得しました。

全体として、以下に詳細に説明するプロトコルである開発された方法論^8,9は、力と変形をRBC表面の応力とひずみに関連付けるフォーム_{ファクターFf}の測定値を使用して以前の不一致を明らかにし、異なる血液を持つ個人から得られたRBCの粘弾性パラメータと柔らかいガラスの特徴を定量的に決定できる新しい診断方法として利用できます病理。以下に説明するプロトコルを用いたこのような特性評価は、メカノバイオロジーの観点から赤血球の挙動を理解するための新しい可能性を開く可能性があります。

プロトコル

ヒトの血液サンプルは、リオデジャネイロ連邦大学の研究倫理委員会によって承認されたプロトコル(プロトコル2.889.952)に従って成人男性と女性のボランティアによって提供され、CAAE番号88140418.5.0000.5699でブラジルプラットフォームに登録されました。書面による同意書がすべてのボランティアに発行され、収集されました。ヘモグロビン症および/または管理薬を服用している人は除外されました。.プロセス全体は、研究所の倫理委員会によって承認されたガイドラインに従いました。

1. サンプルホルダーの作製

1. サンプルホルダーごとに2枚のカバーガラス(24 mm x 60 mmおよび24 mm x 32 mm、厚さ= 0.13-0.17 mm)と1つのゴムリング(直径= 10 mm、厚さ= 2 mm)を用意します。
2. 周囲全体を覆うようにゴムリング表面にシリコングリースを注ぎます。
3. グリース側をカバーガラスに向けて、カバーガラスにゴムリングを置きます。適切に取り付けられるまで5分間待つと、サンプルホルダーは細胞培養を受け入れる準備が整います。
   注:さらに、前述のように、市販または自家製のガラス底皿も使用できます¹⁰。

2. 細胞培養

注:以下の手順では、ヒトの血液から健康な赤血球を採取する方法について説明します。各実験の前にサンプルを新たに調製することが重要です。

1. 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2 HPO 4、1.8 mM KH₂PO₄、10 mM グルコースを含む250 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で20 μLの血液を希釈し、1 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を添加します。
2. 200 x g で室温で2分間遠心分離した後、ピペットを使用して上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLの1x PBS/BSA溶液に再懸濁します。バッファー中の細胞を2倍洗浄します。
3. 血球計を使用して細胞密度を計算し、ステップ1で調製したサンプルホルダーに50,000〜100,000個の細胞をシードします。カバーガラスへの非特異的細胞の付着を10〜15分待ちます。待機時間はセルに影響しません。
4. さらなるOT実験のために、10%v/vポリスチレン球溶液(半径= 1.52 ± 0.02 μm)をサンプル0.2 μLに加えます。顕微鏡でサンプルを見て、適切な混合を確認します。
5. 細胞播種後、2枚目のカバーガラスをゴムリングの上に置き(取り付け用にグリースを追加する必要はありません)、セットアップを閉じて、サンプル調製を終了します。サンプルは顕微鏡分析と操作の準備ができています。

3.光学ピンセット顕微鏡のセットアップ

注:OTは、高度に集束されたレーザービームを使用して微細な物体をトラップし、ピコネウトン範囲の力とナノメートルスケールの変位を測定するツールです。使用するOTレーザー(波長1064 nm)は、前述のように適切に位置合わせする必要があります¹⁰。

1. 簡単に説明すると、数センチメートル(少なくとも10〜20cm)の距離で離れた少なくとも2つのミラーを使用して、直線偏光レーザービームを倒立顕微鏡の後口に向けます。レーザービームを正確に位置合わせして、顕微鏡に直線で入射します(図1)。
2. 次に、顕微鏡に設置したダイクロイックミラーを用いてレーザー光を反射させ、対物レンズの軸線と平行に進み、その後方入口の中央付近にレンズを入射させる。これにより、レーザーの焦点が合って光学トラップが作成されます(図1)。
3. 次に、OTで力を測定するために、システムを較正してトラップ剛性(_κOT)を取得します。OTキャリブレーション手順の詳細については、¹⁰を参照してください。κ OTが見つかると、_OTシステムはレオロジー実験の準備が整います。

4. DMの設定

注:DMは明視野ベースの光学顕微鏡技術であり、顕微鏡の焦点がわずかにずれている場合に透明な物体が見えるようになります^11,12。このような技術が適用され、RBC形状¹³が得られる。OTシステムに採用されているのと同じ顕微鏡をDMに使用して、3D再構成によって高さプロファイルを取得できます。

1. ケーラー照明¹⁴ を実行して顕微鏡照明システムを調整し、解像度を上げるためにコンデンサーダイアフラムを完全に開いて実験を実行します。
2. 圧電位置決めシステムを使用して、z軸にナノメートル精度ですべての座標でサンプルを変位させます。すべての軸で圧電システムの自動校正を実行します。すべての手順が実行されると、顕微鏡システムはDM実験の準備が整います。

5. OTベースのレオロジー実験と分析

注:レオロジー実験は、さまざまな周波数の小さな振動に対する細胞の応答を観察することで構成されます。

1. 実験
   1. OTシステムを使用して、OTレーザーで球をトラップし、球を上面近く、細胞の端に近い細胞表面に押し付けてRBCに取り付けます。このステップでは顕微鏡を使用します。次に、別の球体をトラップし、同じ取り付け手順を繰り返しますが、セルの近くのカバーガラスに取り付けます。カバーガラスに取り付けられた球は基準ビード(図2)であり、ピエゾ変位を追跡し、RBC球と比較するために必要です。
   2. 測定を開始する前に、選択したセルがカバーガラスにしっかりと取り付けられていること、およびRBCと参照球がそれぞれRBC表面とカバーガラスに付着していることを確認してください。接着率が高い(約80%〜90%)にもかかわらず、時間の経過とともに移動する非接着細胞を視覚的に識別します。
   3. 振幅 ξ 0 = 0.500 ± 0.001 μm の正弦波関数と、1 Hz、7 Hz、14 Hz、21 Hz、28 Hz、および 35 Hz の可変周波数と、それぞれの角周波数 ω ω を 6.3 rad/s、169 rad/s、88 rad/s、132 rad/s、176 rad/s、および 220 rad/s の圧電ステージソフトウェアに追加します。 圧電ソフトウェアを使用して、前に示した^ように8,9。
   4. 圧電ステージを使用して、スタートボタンを押して圧電変位を可能にし、RBC球をトラップに保持し、以前に設定した正弦波関数を使用してサンプルを動きのサイクルに提出します。790フレーム/秒以上の画像を生成できるカメラを使用して、サンプルの動きを記録します。実験の概略図を 図2に示します。
   5. サンプルが正弦波運動にサブミットされている間に、OTをアクティブにして、RBC表面に付着した球をトラップします。実験を行うために選択した温度、室温、37°C、またはその他の温度に関係なく、測定中の変動を避けるために温度を注意深く監視してください。OTの作成に使用される赤外線(1064 nm)レーザーは、細胞の損傷や加熱をほとんど引き起こしません。
2. 解析
   1. ImageJを使用して正弦波運動中に得られた画像を解析し、時間の経過に伴う各球の重心位置を見つけます。
      注:これらのデータにより、両方の球間の位相と振幅の差を示すことができるプロットを生成できます。このような情報は、赤血球の粘弾性応答を得るために重要です。
   2. 各球の重心を取得するには、ImageJ ソフトウェアを開きます。正弦波運動中に得られたムービー全体をインポートします。
   3. [ 画像 ] タブで [ 調整] をクリックし、[ しきい値] を選択します。しきい値ウィンドウが開きます。 [白黒] を選択します。これにより、背景が白くなり、球が黒になります。
   4. ヒストグラムの下にある両方のスクロールバーでしきい値を調整して、両方の球体が最大ピクセル数で表示されるようにします。
   5. 参照球を選択するには 、[ファイル]>[長方形]をクリックします。四角形を描画して球を選択します。1つの画像で参照球を選択した後、長方形がムービーの他のすべての画像で同じ球も正しく選択していることを確認してください。
   6. 次に、[ 分析] タブで、[ 測定値の設定 ]をクリックし、[ 重心 ]オプションを選択します。
   7. [解析]タブをもう一度クリックし、[パーティクルの解析]を選択します。新しいウィンドウが開きます。サイズと真円度を定義します(球の半径によって異なります)。次の[結果の表示] と [結果のクリア] チェックボックスをオンにします。最後に、[OK]をクリックしてすべての画像を処理します。
   8. 質量の中心のxy座標を含むテーブルを含む新しいウィンドウが表示されます。これらの座標値を.txtファイルとして保存します。RBC サーフェスに接続されている他の球についても、この手順を繰り返します。
   9. 両方の球の振幅と位相差を取得するには、解析ソフトウェアを開きます。以前に取得した.txtファイルをインポートします。
   10. 3 つの列を持つ新しいテーブルを作成します。最初の列(c0)にフレーム数を追加し、2番目の列(c1)に参照球のx座標を追加し、3番目の列(c2)にRBCサーフェスにアタッチされた球のx座標を追加します。
       注: この例では、正弦波の動きは x 軸でのみ実行されたため、両方の球に x 座標を使用するだけで済みます。
   11. 次に、フレームを時間と関連付けます。 クリック ウィンドウ>式エントリ.数式入力と呼ばれる新しいウィンドウが開きます。このウィンドウでは、8つの異なる方程式を設定し、それぞれを特定のキー(F1からF8まで)に設定できます。
   12. F1 を選択し、次の数式を入力します。
       c 3 = c0 / (カメラの fps)
       [実行]をクリックします。これにより、テーブル(列4)にしばらくの間新しい列が作成されます。
   13. 各フレームの x 座標値をそれぞれの平均値で減算します。これを行うには、数式エントリで任意の2つのキーを指定し、キーごとに次の式を入力します。
       c 4 = (c 1 - 平均(c 1)) および c 5 = (c 2 - 平均(c2))
       [ 実行 ]ボタンをクリックします。結果は、参照球とRBC球の列5と6にそれぞれ表示されます。
   14. 重心の値をピクセルからマイクロメートルに変換します。このためには、数式エントリで別のキーを使用して、次の式を入力します。
       c 4 = c 4 / 変換数
       列5についても同じプロセスを繰り返します。
       注意: 変換は、マイクロメートルスケール/定規を使用して取得され、測定に使用されたのと同じ顕微鏡セットアップ(同じ対物レンズを含む)で画像を取得します。この手順は、顕微鏡のキャリブレーション中に実行できます。このようにして、ピクセル/マイクロメートルの関係が得られます。
   15. 両方の球の重心をy軸に、時間をx軸にしたプロットを生成します。このためには、[ ギャラリー]>[線形]と[散布図]をクリックします。新しいウィンドウが開きます。X 軸の時間列を選択し、Y 軸で、参照球と赤血球の両方の重心の列をマイクロメートル単位で選択します。
   16. プロットで、最初の角周波数(6.3 rad/s)に関連するデータのみを選択します。 図 3 に示すツールを使用します。
   17. 参照球のデータ曲線を調整する方程式を定義します。このためには、[ 一般]および[Fit1]>[カーブフィット]をクリックし、参照球の位置に関連するデータのボックスを選択して、[ 定義]をクリックします。方程式を定義するための新しいウィンドウが開きます。基準球の位置 ξ(t) は次式で表されます。
       ξ(t) = ξ₀cos(ωt)
       ここで、ξ はサンプルの正弦波運動、ω は角周波数、 t はs単位の時間です。この方程式を解析ソフトウェアに置き換えると、次のようになります。
       ここで、m1はξ、m2はf、m0は時間t、m3はt = 0の余弦関数の位相です。
   18. プロットからm1、m2、およびm3の値を推定します。方程式を定義したら、[ OK]をクリックします。データは方程式に基づいて適合され、曲線と小さな正方形がm1、m2、およびm3の値とともにグラフに表示されます。
   19. RBC 球のデータ曲線を調整する方程式を定義します。このためには、[ 曲線フィット]>[一般 ]をクリックして、データの曲線を調整する方程式を定義します。RBC 球の位置 ρ(t) は次式で与えられます。
       
       ここで、ξ' は位相振幅の外れ、φ は位相のずれ角です。この式を分析ソフトウェアに置き換えると、次のようになります。
       ここで、m1、m2、および m3 は、参照球のカーブフィットで取得された値です。m4 は ξ' であり、m5 は φ です。
   20. プロットからm4とm5の値を推定します。数式を定義したら、[ OK]をクリックします。データは方程式に基づいて適合され、小さな正方形と一緒に曲線がm4とm5の値でグラフに表示されます。
   21. 次に、新しいテーブルを作成して、カーブフィットから取得したデータをそれぞれの列に追加します。角周波数、振幅(基準球)、初期時間、振幅(RBC球)、および位相差角の5つの異なる列を定義します。他のすべての周波数についても同じ手順を実行します。
   22. 次の式を使用して、ストレージ定数(K')と損失定数(K")を求めます。
       
       
       ここで、κ OTは_OT弾性定数、βはストークス抗力係数です。方程式を解析ソフトウェアに転置すると、次のようになります。
       そして
       
        ここで、βと_κOTは、システムで見つかった値に置き換える必要があります。
   23. K " のx軸と K' のy軸を使用して、結果をグラフにプロットします(図4)。

6.全体的な細胞フォームファクターを取得するためのDM実験と分析

1. ビデオ・アクイジション
   1. ソフトウェアを使用して圧電ステージをxy方向に動かし、カバーガラスに取り付けられた孤立したセルを検索します。既知の直径のポリスチレン球をトラップしてRBC表面に取り付けます。圧電ステージを使用して、同じくRBC表面に取り付けられているトラップされたビーズをわずかに動かしてセルを変形させ、次にビーズをカバーガラスに取り付けます。
      注:OT測定と同じセルを使用することもできます。
   2. z軸の位置を変更して、フォーカスされた画像を見つけます。フォーカス面は、選択したセルの中央にあります。この画像は、セルの中央のグレーレベルがセルの外側のグレーレベル(背景)に等しいコントラストが小さいことを示しています。
   3. 位置が固定されたら、カメラソフトを使用して、8bit、256ピクセル×256ピクセルで約5,000枚の画像をフレームレート25fpsでセル全体の動画を作成します。次に、z軸の位置を2μm下または上に移動して、選択したセルの焦点が合っていない画像を取得します。パラメータを繰り返して、この状況のムービーを作成します。
   4. 最後に、z軸の位置を変更せずに、セルのない領域を検索して同じ手順を繰り返し、画像の背景のムービーを作成します。
2. コントラスト画像取得
   1. 3つのムービーのそれぞれを3つの平均的な画像に変換します。ImageJを使用して、ムービーの1つを選択し、[ Zプロジェクト>スタック>画像 ]をクリックして、[ 平均強度 ]オプションを選択します。他のムービーに対してこの手順を繰り返して、それぞれの画像を取得します。
   2. 取得したすべての画像を8ビットから浮動小数点32ビットに変更します。ImageJを使用して、32ビット>画像>タイプをクリックします。次に、[分析]>[測定値の設定]をクリックし、[平均グレー値]オプションを選択します。最後に、[分析>測定]をもう一度クリックします。
   3. 次に、[ プロセス>画像計算機 ]をクリックして、フォーカスされた画像を背景画像で分割します。この結果に、フォーカス画像のグレーレベルの平均値を掛けます。 [処理>数学]をクリックして平均値を取得し>乗算します。
   4. 平均値を取得するには、焦点を合わせた画像を選択し、[ 分析>測定]をクリックします。代表的な画像では、グレーレベルの平均値は69,199です。焦点が合っていない画像に対して上記の手順を繰り返します。この場合、グレーレベルの平均値は69,231です。 図5 は、手順の前後で焦点が合った画像と焦点が合っていない画像を示しています。
   5. 操作中に画像の視覚的なコントラストが失われる場合があります。画像をよりよく視覚化するには、[ 画像]>[明るさ/コントラストの調整]> [ 自動 ]オプションを選択します。
   6. 次に、画像のコントラストを見つけるには、次の関係を使用します。
      ここで、N _Img はセルのグレーレベルであり、N₀はセル外のグレーレベルであり、カメラに依存するゼロ光強度のグレーレベルに対応する定数パラメータである。
   7. 値 Bを見つけるには、パワーメーターを使用して光強度を測定します。光の強度の値ごとに、ビデオを録画する必要があります。したがって、異なる強度値を異なるレベルのグレーに関連付けることができます。最後に、線形フィットを取得し、Bをゼロ光強度¹⁵に関連付けます。
   8. N₀の値を見つけ、ポリゴン選択アイコンをクリックして、図6のようなポリゴンを描画します。次に、[分析] タブをクリックし、[測定] を選択して、選択した領域の平均グレー レベルを見つけます。各画像はピクセルのセットによって形成され、各ピクセルには特定のグレーレベルがあります。画像を構成するすべてのピクセルによるすべてのグレーレベルのセットは、N_Imgに対応します。
   9. コントラスト式を使用してN _Img - N_oを決定し、処理>数学>減算を選択してこれを実行します。結果をN₀ - Bで割ります。最後に、焦点が合った画像(C0)と焦点が合っていない画像(C1)のコントラストを求める。
3. 高さプロファイルの取得
   1. 高さプロファイルを取得するには、すでに説明した方法¹³を使用します。簡単に言うと、ハートレー変換(FHT)を使用してRBCの厚さを取得します。ImageJ で、[ FFT >プロセス] > [FFT オプション] をクリックし、[FHT] を選択します。
   2. [プロセス>数学] > [減算] を使用して ImageJ の画像 C0 と C1 を減算し、次の手順 C= C0 - C1 の画像を取得します。
   3. 画像 C の場合は、[ FFT オプション] > [FFT >処理] をクリックし、[ FHT ] を選択して画像のハートレー変換を実行します。次に、カスタムメイドのプラグインDivideQ2を使用して空間周波数^q2 で除算します。 プラグインをクリックして分割Q2>。
      注: ファイル DivideQ2.class は、ImageJ がインストールされているプラグイン ディレクトリにコピーする必要があります。プラグインは、ImageJのプラグインフォルダに含まれる.classファイル(補足ファイル1)として提供されています。
   4. 次に、 FFT>FFT>処理を用いて逆変換FHTを行い、セルの高さに比例したグレーレベルの画像を得る。
   5. 最後に、[ プロセス>数学]>[乗算 ]をクリックして、次の定数を使用して結果の画像を乗算します。
      
      これは、画像、サンプル、および実験セットアップ¹³の特性に基づいて定義される。ここで、n=1.51は油屈折率、p=0.0721μmはマイクロメートルと画像の画素との関係、Δn=0.058はRBCと水性媒体屈折率との差、フォーカシング画像とデフォーカス画像の間の距離(Zf1-Zf2)=2μm、画像のサイズ、 N 2 = 256 pxl²。
   6. 結果の画像を使用して、高さプロファイルを取得します(図7)。結果の画像は、さまざまな高さプロファイルを観察するために ImageJ で使用されます。黄色の垂直線がセル内のどこに配置されているかによって異なりますが、たとえば、 図7 では垂直線によって制限された高さプロファイルが得られ、Ctrl + Kを押してこれを観察します。
4. フォームファクター
   1. 赤血球の高さプロファイルを含む画像を見つけたら、2 μm の焦点の合ったコントラストを使用して、ImageJ で 2 つの画像のセットを作成します。 [画像>スタック]をクリックし、[ スタックする画像]オプションを選択します。フォーム ファクターを見つけるには、ImageJ でカスタマイズされたマクロを使用してスタックを分析します。ImageJ のカスタマイズされたマクロは、 補足ファイル 2 としてダウンロードできます。
      メモ: プログラムは、デフォーカス画像を使用してセルの端を決定します。次に、高さプロファイルを含む画像を使用して、水平位置ごとに周囲長を決定します。エッジに加えて、それは周囲と周囲の逆を決定します。逆周長値の合計にピクセルの厚さを掛けたものは、フォーム ファクターの逆数に対応します。
   2. プログラムにピクセル/マイクロメートルの関係を挿入します。この値は、顕微鏡の対物校正実験から取得します。この例では、値は 13.87 ピクセル/μm です。
   3. 水平方向の開始位置を選択して、スタックの最初の画像に黄色の線を配置します。セルの先頭の前に線を開始し、セルの垂直方向の制限を超えて描画します。この例では、黄色の線の長さは 153 ピクセルで、初期位置は i = 70、y1 = 80 から i = 70、y2 = 195 の間です。次に、最終位置がf = 245、y1 = 80、f = 245、y2 = 195になるまで黄色の線を水平に移動します。
   4. 最後に、セルの端、周囲、および周囲の逆を見つけるには、[マクロ]タブを選択し、[マクロの実行]をクリックします。 マクロは、エッジの位置、周囲の周囲と逆、および分析されたセルの画像を含むテーブルを提供します。この画像の端が図 7 の端と似ているかどうかを確認し、そうでない場合は、手順を繰り返します。
   5. 周囲の逆数の合計を使用して、フォーム^{ファクター8}を見つけます。

7. 軟質ガラスレオロジーモデルと実験解析

1. 実験データを表に整理する
   1. [ ファイル ]タブをクリックして、分析ソフトウェアで新しいテーブルを作成します。次のパラメータに対して10個の異なる列(c0からc9まで)を決定します:使用される角周波数(rad / s):c0;各角周波数について得られた K' (pN/μm)値:c1; ErrK': c2;各角周波数について得られた K" (pN/μm)値:c3; ErrK": c4;各角周波数について得られた G'(Pa)値:c5; エラーG': c6; G" (Pa)各角周波数について得られた値:c7; ErrG": c8 および F_f とそれぞれの誤差: c9 (図 8)。次の数式を使用して、次の列にデータを入力します。
      c5 = (3 x c1) / (8 x 1.28 x 0.087)
      c6 = (3 / (8 x 0.087 x 1.28)) x sqrt (c2^2 + (c1 x 0.01 / 1.28)^2 + (c1 x 0.008 / 0.087) ^ 2)
      c7 = (3 x c3) / (8 x 1.28 x 0.087)
      c8 = (3 / (8 x 0.087 x c4)) x sqrt (c4^2 + (c3 x 0.01 / 1.28)^2 + (c3 x 0.008 / 0.087)^2)
2. 曲線 G' (ω) 対 G" (ω) のプロット
   1. 解析ソフトウェアで曲線G'(ω)対G"(ω)を生成するには、前の表のデータを使用します。[ギャラリー>線形] をクリックし、[散布図] 形式を選択します。
   2. 新しいウィンドウが開きます。X 軸として G " 列を選択し、Y 軸として G' 列を選択します。最後に、[ プロット ]ボタンをクリックしてグラフを取得します。
   3. プロットにエラーバーを追加するには、プロットウィンドウをクリックし、プロット>エラーバーをクリックします。 新しいウィンドウが開きます。まず、Y Errオプションをマークします。エラーバー設定と呼ばれる別のウィンドウが開きます。
   4. [値の%]をクリックし、[データ列]を選択してから、[ErrG']列をクリックします。最後に、[OK]>[プロット]をクリックすると、y値のエラーバーが表示されます。X軸の値に対して同じ手順を繰り返し、Xエラーの正方形とErrGの正しい列を選択します。最終的なプロットは、図9のようになります。
3. 柔らかいガラス状レオロジーモデルへのパラメータのフィッティング
   注:データ分析は2つの部分に分かれています:1)G'(ω)対G"(ω)プロットをカーブフィッティングして、パラメータΓと_Gmを取得します。2)カーブフィッティングG'(ω)とG"(ω)を周波数ωの関数として、べき乗則指数αを得る。
   1. G'(ω)対G"(ω)プロットをカーブフィッティングして、パラメータΓと_Gmを取得します。
      1. カーブフィットタブをクリックし、フィット1を選択します。新しいウィンドウが開きます。正方形を選択し、[定義]ボタンをクリックします。一般的なカーブフィット定義と呼ばれるウィンドウが表示されます。次の式を入力します。
         m1 + m0/m2
         ここで、m1 = 61.576;m2 = 1、許容誤差は1 x ^10-5です。ここで、m0はG"を表し、m1は_Gmを表し、m2はΓを表します。
         注: m1 と m2 については、カーブフィットの定義中にそれぞれの値を推定する必要があります。上記の推定は、示された実験例に基づいています。実験では、プロットで観察された値に従って数を推定します。
      2. 両方のウィンドウで [OK ]ボタンをクリックすると、 図10 に示すように、継ぎ手が表示されます-黒い曲線。プロットとともに表示されたカーブフィットテーブルにリストされているm1とm2の正しい値を確認します。
   2. 角周波数ωの関数としてのカーブフィッティングG'およびG"。
      1. 次に、他の2つのプロット、すなわち、ωの関数としてのG'とωの関数としてのG'を作成します。前に示したように、エラーバーはy軸にのみ配置します。
      2. カーブフィット手順を繰り返しますが、[ カーブフィットの選択]で [G ]オプションを選択し、[ 一般フィット]>[カーブ定義]で次の式を記述します。
         
         この場合、m1は、ω = 6.3 rad/sのとき、G"(ω)= 23.683 Paの値であると推定されました。m2は0.5と推定されました(m2は指数αであり、0から1の間で変化することに注意してください)。図 10 の m2 の結果に従って、Γ = 2.0293 の値を挿入します。
      3. [データの重み付け]オプションをマークします。これらすべての手順が終了したら、[OK]をクリックすると、図11のようなカーブフィッティング(青いカーブ)が表示されます。α α = 0.63 ± 0.02 および G 0, G 0 = (3.7 ± _0.3)Pa の値が表示されます。これらの値を使用して、次の曲線 G' (ω) をフィットさせます。
      4. 次のカーブをクリックし、カーブフィット手順を繰り返しますが、 一般フィットカーブ定義で次の式を記述します。
         
         この場合、m3は、以前に得られた値を確認するためのαの推定値にすぎません。ω = 6.3 rad/s の場合、G ₀ = 3.703 および G' (ω) = 23.683 Pa の値を使用します。
      5. ここでも、許容誤差として1 x ^10-5 を追加し、オプションを 重み付けデータとしてマークします。これらすべての手順が終了したら、[ OK]をクリックすると、 図11 のようなカーブフィッティング(緑色のカーブ)が表示されます。

結果

図1は、レオロジー測定に使用されるOTシステムの概略図を表しています。図2は、両方の球を用いたマイクロレオロジー実験の概略図を示しており、代表的なRBCも示されています。図3は、圧電ステージによって正弦波運動が発生する時間の関数として、両方の球の振幅の典型的な曲線を示しています。基準球(図3-赤い曲線)は?...

ディスカッション

このプロトコルでは、赤血球の粘弾性特性を定量的にマッピングするために、光ピンセットとデフォーカス顕微鏡に基づく統合方法が提示されます。 貯蔵および損失せん断弾性率の結果は、RBCの柔らかいガラス状レオロジーを特徴付けるスケーリング指数とともに決定される。生理学的状況⁸ または 熱帯熱マラリア原虫 赤血球内サイクル⁹ の各段階...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm culture dishes	Corning	430165
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Coverslips	Knittel Glass	VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01
Glass-bottom dishes	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Immersion oil	Nikon	MXA22165
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy Software	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Microscope camera	Hamamatsu	C11440-10C
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
Objective lens	Nikon	PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2
Optical table	Thorlabs	T1020CK
OT laser	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
Polystyrene microspheres	Polysciences	17134-15
rubber ring	Forever Seals	NBR O-Ring
Silicone grease	Dow Corning	Z273554
Stage positioning	PI	P-545.3R8S
Pipette	Gilson	P1000