光ピンセットとデフォーカス顕微鏡を用いた赤血球の粘弾性特性の定量的解析

要約

ここでは、細胞のレオロジー特性を測定するための光ピンセットとデフォーカス顕微鏡に基づく統合プロトコルについて説明します。このプロトコルは、さまざまな生理病理学的条件下での赤血球の粘弾性特性の研究に広く適用できます。

要約

赤血球の粘弾性特性は、さまざまな技術によって研究されています。ただし、報告されている実験データはさまざまです。これは、細胞の正常な変動性だけでなく、細胞応答の方法とモデルの違いにも起因します。ここでは、光ピンセットとデフォーカス顕微鏡を使用した統合プロトコルを使用して、1Hz〜35Hzの周波数範囲で赤血球のレオロジー的特徴を取得します。光ピンセットは赤血球複合体弾性定数の測定に使用されますが、デフォーカス顕微鏡は、複雑な弾性定数を複雑なせん断弾性率に変換できるパラメータである細胞の高さプロファイル、体積、およびそのフォームファクターを取得できます。さらに、軟質ガラス状レオロジーモデルを適用すると、両方の弾性率に対するスケーリング指数が得られる。開発された方法論は、いくつかの生理学的および病理学的条件について、明確に定義された実験条件下で得られたそれらの粘弾性パラメータを特徴付ける、赤血球の機械的挙動を探索することを可能にする。

概要

赤血球としても知られる成熟赤血球(RBC)は、人体の最も狭い毛細血管を通過するときに、そのサイズが2倍以上伸びることができます¹。そのような能力は、外部負荷を受けたときに変形するそれらの独特の能力に起因する。

近年、さまざまな研究がRBC^表面2,3でこの特徴を特徴付けています。外部荷重による材料の弾性応答と粘性応答を記述する物理学の分野は、レオロジーと呼ばれます。一般に、外力が加えられると、結果として生じる変形は材料の特性に依存し、エネルギーを蓄える弾性変形とエネルギーを放散する粘性変形に分けることができます⁴。赤血球を含むすべての細胞は粘弾性挙動を示します。言い換えれば、エネルギーは蓄えられ、散逸されます。したがって、セルの粘弾性応答は、その複素せん断弾性率G*(ω)= G'(ω)+ iG"(ω)によって特徴付けることができ、ここでG'(ω)は弾性挙動に関連する貯蔵弾性率であり、G"(ω)はその粘度⁴に関連する損失弾性率である。さらに、現象....

プロトコル

ヒトの血液サンプルは、リオデジャネイロ連邦大学の研究倫理委員会によって承認されたプロトコル(プロトコル2.889.952)に従って成人男性と女性のボランティアによって提供され、CAAE番号88140418.5.0000.5699でブラジルプラットフォームに登録されました。書面による同意書がすべてのボランティアに発行され、収集されました。ヘモグロビン症および/または管理薬を服用している人は除外されました。.プロセス全体は、研究所の倫理委員会によって承認されたガイドラインに従いました。

1. サンプルホルダーの作製

1. サンプルホルダーごとに2枚のカバーガラス(24 mm x 60 mmおよび24 mm x 32 mm、厚さ= 0.13-0.17 mm)と1つのゴムリング(直径= 10 mm、厚さ= 2 mm)を用意します。
2. 周囲全体を覆うようにゴムリング表面にシリコングリースを注ぎます。
3. グリース側をカバーガラスに向けて、カバーガラスにゴムリングを置きます。適切に取り付けられるまで5分間待つと、サンプルホルダーは細胞培養を受け入れる準備が整います。
   注:さらに、前述のように、市販または自家製のガラス底皿も使用できます¹⁰。

2. 細胞培養<....

結果

図1は、レオロジー測定に使用されるOTシステムの概略図を表しています。図2は、両方の球を用いたマイクロレオロジー実験の概略図を示しており、代表的なRBCも示されています。図3は、圧電ステージによって正弦波運動が発生する時間の関数として、両方の球の振幅の典型的な曲線を示しています。基準球(図3-赤い曲線)は?.......

ディスカッション

このプロトコルでは、赤血球の粘弾性特性を定量的にマッピングするために、光ピンセットとデフォーカス顕微鏡に基づく統合方法が提示されます。 貯蔵および損失せん断弾性率の結果は、RBCの柔らかいガラス状レオロジーを特徴付けるスケーリング指数とともに決定される。生理学的状況⁸ または 熱帯熱マラリア原虫 赤血球内サイクル⁹ の各段階.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm culture dishes	Corning	430165
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Coverslips	Knittel Glass	VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01
Glass-bottom dishes	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Immersion oil	Nikon	MXA22165
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy Software	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Microscope camera	Hamamatsu	C11440-10C
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
Objective lens	Nikon	PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2
Optical table	Thorlabs	T1020CK
OT laser	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
Polystyrene microspheres	Polysciences	17134-15
rubber ring	Forever Seals	NBR O-Ring
Silicone grease	Dow Corning	Z273554
Stage positioning	PI	P-545.3R8S
Pipette	Gilson	P1000