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要約

本プロトコルは、外膜小胞のバイオエンジニアリングを、生産、精製、バイオコンジュゲーション、および特性評価を含む「プラグアンドディスプレイ」ワクチンプラットフォームとして説明しています。

要約

細菌またはウイルスから得られる生体模倣ナノ粒子は、ワクチンの研究開発において大きな関心を集めている。外膜小胞(OMV)は、平均的な成長中に主にグラム陰性菌によって分泌され、ナノサイズの直径と自己アジュバント活性を持ち、ワクチンの送達に理想的である可能性があります。OMVは、タンパク質、核酸、および低分子の多面的な送達システムとして機能してきました。OMVの生物学的特性を最大限に活用するために、バイオエンジニアリングされた 大腸菌由来のOMVをキャリアとして、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン(RBD)を抗原として利用して、「プラグアンドディスプレイ」ワクチンプラットフォームを構築しました。 化膿レンサ 球菌のスパイキャッチャー(SC)ドメインとスパイタグ(ST)ドメインをコンジュゲートOMVとRBDに適用しました。Cytolysin A(ClyA)遺伝子は、プラスミドトランスフェクション後に融合タンパク質としてSC遺伝子とともに翻訳され、OMVの表面に反応部位を残しました。従来のバッファーシステムでRBD-STを一晩混合した後、OMVとRBDの間に共有結合を形成しました。このようにして、多価表示OMVワクチンが達成された。OMVワクチンプラットフォームは、多様な抗原に置き換えることで、さまざまな不均一な抗原を効率的に表示できるため、感染症の流行を迅速に防ぐことができます。このプロトコルは、生産、精製、バイオコンジュゲーション、および特性評価を含む、OMVワクチンプラットフォームを構築するための正確な方法を説明しています。

概要

潜在的なワクチンプラットフォームとして、外膜小胞(OMV)は近年ますます注目を集めています1,2。主にグラム陰性菌3によって自然に分泌されるOMVは、通常20〜300nmのサイズの脂質二重層で構成される球状のナノスケール粒子です4。OMVには、細菌抗原や病原体関連分子パターン(PAMP)など、固形免疫増強因子として機能するさまざまな親細菌成分が含まれています5。OMVは、そのユニークな成分、自然な小胞構造、および優れた遺伝子工学修飾部位の恩恵を受けて、細菌ワクチン6、アジュバント7、癌免疫療法薬8、薬物送達ベクター9、および抗菌接着剤10を含む多くの生物医学分野で使用するために開発されてきました。

2020年以降世界中に広がったSARS-CoV-2のパンデミックは、グローバル社会に大きな打撃を与えました。スパイクタンパク質(Sタンパク質)の受容体結合ドメイン(RBD)は、ヒトアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)と結合することができ、次いで、細胞へのウイルスの侵入を媒介する11、12、13。したがって、RBDはワクチン発見の主要な標的であるように思われます14,15,16。しかし、単量体RBDは免疫原性が低く、分子量が小さいため免疫系が認識しにくいため、アジュバントが必要になることがよくあります17。

RBDの免疫原性を高めるために、多価RBDを示すOMVを構築した。RBDを表示するためにOMVを使用する既存の研究は、通常、RBDをOMVと融合させて細菌で発現させます18。しかし、RBDはウイルス由来のタンパク質であり、原核生物の発現はその活性に影響を与える可能性があります。この問題を解決するために、 化膿レンサ球菌由来のSpyTag(ST)/SpyCatcher(SC)系を用いて、従来の緩衝系においてOMVおよびRBDと共有結合性イソペプチドを形成した19。SCドメインは、バイオエンジニアリングされた 大腸菌による融合タンパク質としてCytolysin A(ClyA)で発現し、STはHEK293F細胞発現系を介してRBDで発現しました。OMV-SCとRBD-STを混合し、一晩インキュベートしました。超遠心またはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による精製後、OMV-RBDが得られた。

プロトコル

1. プラスミド構築

  1. SpyCatcher配列をコードするDNA(補足ファイル1)を、BamH IサイトとSal Iサイトの間のアンピシリン耐性pThioHisA-ClyAプラスミド(材料表を参照)に挿入し、以前に発表された第20相に続いてプラスミドpThioHisA ClyA-SCを構築します。
  2. 合成したSpyTag-RBD-Histag融合遺伝子(補足ファイル1)を、BamH IサイトとEcoR Iサイトの間のpcDNA3.1プラスミド( 材料表を参照)にリゲートし、以前に発表された第19報告に従ってプラスミドpcDNA3.1 RBD-STを構築しました。

2. OMV-SCの準備

  1. 以下の手順に従ってClyA-SC変換を実行します。
    1. 5 μLのpThioHisA ClyA-SCプラスミド溶液(50 ng/μL)を50 μLのBL21コンピテント株に加え、穏やかに吹き付け、氷上で30分間冷却します。
    2. 溶液を42°Cの水浴に90秒間入れ、次に混合溶液を氷上に3分間置く。
    3. 細菌懸濁液に500 μLのLB培地を加え、混合後、220 rpm、37°Cで1時間培養します。
    4. すべての形質転換をアンピシリン(100 μg/mL、 材料の表を参照)を含むLB寒天プレートにプレートし、37°Cで一晩培養します。
      注:その後の実験では、アンピシリンは培地中で同じ濃度に保たれました。そうでない場合、これは細菌のプラスミドの損失を引き起こす可能性があります。
  2. OMV-SC 実動の場合は、以下のステップを実行します。
    1. プレートから単一コロニーを単離し(ステップ2.1.4.)、20 mLのLB(アンピシリン耐性)培地に、37°Cで220 rpmで一晩培養します。
    2. 細菌溶液(ステップ2.2.1から)を2L培地に植菌し、対数増殖段階(OD600nm は0.6〜0.8の間)まで220rpm、37°Cで5時間培養する。
    3. 細菌溶液の600 nmでのODが0.6〜0.8に達したら、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG、 材料表を参照)を加えて細菌溶液の最終濃度を0.5 mMにし、25°Cで220 rpmで一晩培養します。
  3. OMV-SC 精製を実行します。
    1. 細菌溶液を7,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
    2. 上清を0.22 μmメンブレンフィルターでろ過し、100 kD限外ろ過膜または中空糸カラムを使用して濃縮します( 材料表を参照)。
    3. 濃縮液を0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過し、超遠心分離機(材料の表を参照)を使用して4°Cで2時間150,000 x gで遠心分離し、ピペットで上清を廃棄します。
    4. 沈殿をPBSで再懸濁し、-80°Cで保存します。 この溶液は、-80°Cで長期安定性を維持できます。

3. RBD-STの準備

  1. 以下の手順に従ってRBD-STトランスフェクションを実行します。
    1. 適切な真核生物発現系(例えば、HEK293F)を選択し、回収後に細胞を37°Cで130rpmで一晩培養する。
    2. 20 μLのHEK293F細胞溶液を自動セルカウンター( 材料表を参照)に加え、細胞数を記録し、濃度を1 x 106 細胞/mLに調整してから、細胞を130 rpm、37°C、4時間培養します。
    3. RBD-STプラスミドを0.22 μmメンブレンフィルターでろ過し、最終容量が10 mLになるまで300 μgのプラスミドを細胞培養培地( 材料の表を参照)に加えます。10秒間振とうします。
    4. PEI(1 mg/mL、 材料表参照)をウォーターバスで65°Cに加熱し、0.7 mLのPEIと9.3 mLの細胞培養培地を混合し、10秒間間欠的に振とうします。
      注意: 溶液を激しく振らないでください。そうしないと、結果として生じる気泡がトランスフェクション効率に影響を与える可能性があります。
    5. プラスミド溶液をPEI溶液に加え、混合物を断続的に10秒間振とうし、37°Cで15分間インキュベートします。
    6. この混合物を280 mLの細胞培養培地に加え、37°Cで130 rpmで5日間培養します。
  2. RBD-ST精製を実行します。
    1. 細胞を6,000 x g で25°Cで20分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を回収します。
    2. カラムに2 mLのNi-NTAアガロース( 材料表を参照)を満たし、3x PBSで3回洗浄します。
    3. 細胞上清にイミダゾール( 材料表参照)を加えて最終濃度を20mMにし、細胞上清を2倍負荷します。
    4. 洗浄用に20 mMのイミダゾールを含むPBSを3カラム容量(CV)添加し、洗浄画分を回収します。
    5. 低濃度から高濃度(例:.、0.3 M、0.4 M、0.5 M)のイミダゾールを含む3 CVのPBSでグラジエント溶出します。各濃度で2倍に溶出します。
    6. SDS-PAGE21 を使用して、異なる濃度勾配でRBD-STを特定します。

4. OMV-RBDバイオコンジュゲーションと精製

  1. BCA法によりタンパク質濃度を測定します( 材料表を参照)。
    1. 標準BSAタンパク質溶液を2 mg/mLから0.0625 mg/mLに連続希釈し、精製したOMV-SCとRBD-STを10倍に希釈してから、BCA作業溶液AとB(アッセイキットに付属)を50:1(v/v)の比率で混合します。
    2. 希釈したタンパク質溶液(25 μL/ウェル)を加え、BCA作業溶液(200 μL/ウェル)と混合します。37°Cで30分間インキュベートします。
    3. 各ウェルの562 nmにおける吸光度(OD)を測定し、標準曲線22からタンパク質濃度を算出する。
  2. 以下の手順に従って、OMV-SCおよびRBD-STのバイオコンジュゲーションを実行します。
    1. OMV-SCとRBD-STをPBSで40:1(w / w)の比率で混合します。
    2. 垂直回転させて、混合物を4°Cで15rpmで一晩ブレンドします。
      注:異なる抗原は異なる比率で反応する可能性があります。抗原の特性に基づいて異なる反応比を試すことができます。
  3. 反応効率を検証します。
    1. 10 μLのOMV-SC、RBD-ST、および反応生成物を準備します(ステップ4.2)。2.5 μLの5xローディングバッファー( 材料表を参照)を加え、サンプルを100°Cで5分間加熱します。サンプルをゲル(10 μL/ウェル)にロードします。60Vで20分間電気泳動を行い、条件を120Vに1時間変更します。
    2. タンパク質をゲルからPVDFウェスタンブロッティングメンブレン( 材料の表を参照)に100 Vで70分間移します。
    3. メンブレンを5%の無脂粉ミルク/ TBSTに入れ、1時間振とうします。その後、TBSTで3回、振とうしながら1回の洗浄につき5分間洗浄します。
    4. メンブレンを0.1%His-Tag抗体/ TBST( 材料の表を参照)に入れて1時間振とうした後、振とうしながら洗浄ごとにTBSTで5分間3回洗浄します。
    5. メンブレンを0.02%抗マウスIgG1抗体(HRP)/TBST( 材料表参照)に入れて40分間振とうした後、振とうしながら1回洗浄するごとにTBSTで3回5分間洗浄します。
    6. 強化された化学発光溶液( 材料の表を参照)を追加し、膜を露出させます。
  4. OMV-RBDの精製を行います。
    1. 反応したOMV-RBD溶液1 mLを10 mLに希釈し、希釈液を150,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。
    2. ピペットを使用して上清を捨て、残渣を10 mLのPBSで懸濁します。懸濁液を150,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。
    3. 上清を捨て、残渣を1 mLのPBSで懸濁します。
      注:抗原の溶解度がはるかに低い場合、サイズ排除クロマトグラフィー19によって同じ分離効果を達成することができる。

5.特性評価

  1. 動的光散乱(DLS)を実行します。
    1. サンプルを100 μg/mLの濃度に希釈し、1 mLのサンプルをサンプルセルに加えます。
    2. 「測定タイプ」に「サイズ」、「試料材料」に「タンパク質」、「分散剤」に「水」、「温度」に「25°C」を選択し、試料をロードして自動測定します23。
  2. 透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して画像をキャプチャします。
    1. サンプルを100 μg/mLに希釈します。200メッシュの銅グリッドを取り、それに20μLのサンプルを加え、10分間吸収させます。
    2. ろ紙を使用して溶液を吸い取り、20 μLの3%酢酸ウラニルをサポートフィルムに加え、30秒間染色します。
    3. 酢酸ウラニルを吸い取り、フィルムを室温で1時間自然乾燥させます。
    4. サンプルをTEMシステム( 材料表を参照)にロードし、80kVで画像をキャプチャします。

結果

このプロトコルのフローチャートを 図 1 に示します。このプロトコルは、OMVをワクチンプラットフォームとして利用するための一般的なアプローチである可能性があります。抗原の種類に基づいて適切な発現システムを選択するだけで済みます。

図2は、実現可能なプラスミド設計スキームを示しています。SC遺伝子はフレキ?...

ディスカッション

「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォームを作成するために、SC融合ClyAは、タンパク質発現24の利点のために組換えタンパク質生産に最も広く使用されているモデルの1つであるBL21(DE3)株で発現され、細菌増殖の過程でOMVの表面に十分なSCフラグメントが表示されます。同時に、抗原とOMVの間の化学的カップリングのためにST融合標的抗原を調製した。...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この作業は、重慶自然科学基金会の主要プログラム(No.cstc2020jcyj-zdxmX0027)および中国国家自然科学財団プロジェクト(第31670936号、82041045)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin sodiumSangon BiotechA610028
Automated cell counterCountstarBioTech
BCA protein quantification Kitcwbiocw0014s
ChemiDoc Touching Imaging SystemBio-rad
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatusCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
Goat pAb to mouse IgG1Abcamab97240
High speed freezing centrifugeBioridgeH2500R
His-Tag mouse mAbCell signaling technology2366s
ImidazoleSangon BiotechA600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosideSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Non-fat powdered milkSangon BiotechA600669
OPM-293 cell culture mediumOpm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmidWuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer salineZSGB-bioZLI-9061
Polyethylenimine LinearPolysciences23966-1
Prestained protein ladderThermo26616
pThioHisA ClyA-SC plasmidWuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting MembranesRoche03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x)BeyotimeP0015
Sodium chlorideSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)Thermo34577
Suspension instrumentLife TechnologyHula Mixer
Transmission Electron MicroscopeHitachiHT7800
TryptoneOxoidLP0042B
UltracentrifugeBeckman coulterXPN-100
Ultraviolet spectrophotometerHitachiU-3900
Yeast extractSangon BiotechA610961

参考文献

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