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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Bioengineering von äußeren Membranvesikeln als "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Zusammenfassung

Biomimetische Nanopartikel, die aus Bakterien oder Viren gewonnen werden, haben großes Interesse an der Impfstoffforschung und -entwicklung geweckt. Äußere Membranvesikel (OMVs) werden hauptsächlich von gramnegativen Bakterien während des durchschnittlichen Wachstums mit einem Durchmesser in Nanogröße und selbstadjuvanter Aktivität sezerniert, was ideal für die Impfstoffabgabe sein kann. OMVs haben als facettenreiches Liefersystem für Proteine, Nukleinsäuren und kleine Moleküle funktioniert. Um die biologischen Eigenschaften von OMVs voll auszuschöpfen, wurden biotechnologisch hergestellte Escherichia coli-abgeleitete OMVs als Träger und SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne (RBD) als Antigen verwendet, um eine "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform zu konstruieren. Die Domänen SpyCatcher (SC) und SpyTag (ST) in Streptococcus pyogenes wurden angewendet, um OMVs und RBD zu konjugieren. Das Cytolysin A (ClyA)-Gen wurde nach Plasmidtransfektion mit dem SC-Gen als Fusionsprotein übersetzt, wobei eine reaktive Stelle auf der Oberfläche der OMVs zurückblieb. Nach dem Mischen von RBD-ST in einem konventionellen Puffersystem über Nacht wurde eine kovalente Bindung zwischen den OMVs und RBD gebildet. Somit wurde ein multivalent anzeigender OMV Impfstoff erreicht. Durch den Ersatz durch verschiedene Antigene kann die OMVs Impfstoffplattform eine Vielzahl heterogener Antigene effizient darstellen und so Epidemien von Infektionskrankheiten schnell verhindern. Dieses Protokoll beschreibt eine präzise Methode zum Aufbau der OMV Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Einleitung

Als potenzielle Impfstoffplattform haben äußere Membranvesikel (OMVs) in den letzten Jahren immer mehr Aufmerksamkeit erregt 1,2. OMVs, die hauptsächlich auf natürliche Weise von gramnegativen Bakterien3 sezerniert werden, sind kugelförmige nanoskalige Partikel, die aus einer Lipiddoppelschicht bestehen, normalerweise in der Größe von 20-300nm4. OMVs enthalten verschiedene bakterielle Ausgangskomponenten, einschließlich bakterieller Antigene und pathogenassoziierter molekularer Muster (PAMPs), die als feste Immunpotentiatoren dienen5. OMVs profitieren von ihren einzigartigen Komponenten, ihrer natürlichen Vesikelstruktur und ihren großartigen gentechnischen Modifikationsstellen und wurden für den Einsatz in vielen biomedizinischen Bereichen entwickelt, darunter bakterielle Impfstoffe6, Adjuvantien7, Krebsimmuntherapeutika8, Wirkstoffabgabevektoren9 und antibakterielle Klebstoffe10.

Die SARS-CoV-2-Pandemie, die sich seit 2020 weltweit ausbreitet, hat die globale Gesellschaft stark belastet. Die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) im Spike-Protein (S-Protein) kann an das humane Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) binden, das dann den Eintritt des Virus in die Zellevermittelt 11,12,13. Daher scheint RBD ein Hauptziel für die Impfstoffentdeckungzu sein 14,15,16. Monomere RBD ist jedoch schlecht immunogen, und ihr kleines Molekulargewicht erschwert es dem Immunsystem, sie zu erkennen, so dass häufig Adjuvantien erforderlich sind17.

Um die Immunogenität von RBD zu erhöhen, wurden OMVs mit polyvalenten RBDs konstruiert. Bestehende Studien, die OMV zur Darstellung von RBD verwenden, verschmelzen in der Regel RBD mit OMV, um in Bakterien exprimiert zu werden18. RBD ist jedoch ein vom Virus abgeleitetes Protein, und die prokaryotische Expression beeinflusst wahrscheinlich seine Aktivität. Um dieses Problem zu lösen, wurde das von Streptococcus pyogenes abgeleitete SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC)-System verwendet, um ein kovalentes Isopeptid mit OMV und RBD in einem konventionellen Puffersystem19 zu bilden. Die SC-Domäne wurde mit Cytolysin A (ClyA) als Fusionsprotein durch biotechnologisch hergestellte Escherichia coli exprimiert, und ST wurde mit RBD über das HEK293F-Zellexpressionssystem exprimiert. OMV-SC und RBD-ST wurden über Nacht gemischt und inkubiert. Nach Reinigung durch Ultrazentrifugation oder Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde OMV-RBD erhalten.

Protokoll

1. Plasmidaufbau

  1. Fügen Sie DNA, die die SpyCatcher-Sequenz (Supplementary File 1) kodiert, in ein Ampicillin-resistentes pThioHisA-ClyA-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Stellen BamH I und Sal I ein, um das Plasmid pThioHisA ClyA-SC nach einem zuvor veröffentlichten Bericht zu konstruieren20.
  2. Ligate das synthetisierte SpyTag-RBD-Histag-Fusionsgen (Supplementary File 1) in ein pcDNA3.1-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Standorten BamH I und EcoR I, um das Plasmid pcDNA3.1 RBD-ST nach einem zuvor veröffentlichten Bericht zu konstruieren19.

2. OMV-SC Vorbereitung

  1. Führen Sie die ClyA-SC-Transformation mit den folgenden Schritten durch.
    1. 5 μL pThioHisA ClyA-SC Plasmidlösung (50 ng/μL) zu 50 μL BL21 kompetentem Stamm geben, vorsichtig blasen und 30 min auf Eis abkühlen lassen.
    2. Die Lösung für 90 s in das Wasserbad bei 42 °C geben und dann sofort die gemischte Lösung für 3 min auf Eis legen.
    3. 500 μL LB-Medium in die Bakteriensuspension geben und nach dem Mischen bei 220 U/min bei 37 °C für 1 h kultivieren.
    4. Die gesamte Umwandlung wird auf eine LB-Agarplatte mit Ampicillin (100 μg/ml, siehe Materialtabelle) und Kultur über Nacht bei 37 °C gelegt.
      HINWEIS: In nachfolgenden Experimenten wurde das Ampicillin in der gleichen Konzentration im Medium gehalten. Wenn nicht, kann dies zum Verlust von Plasmiden in den Bakterien führen.
  2. Führen Sie für die OMV-SC-Produktion die folgenden Schritte aus.
    1. Eine einzelne Kolonie wird von der Platte isoliert (Schritt 2.1.4.) auf 20 ml LB (ampicillinresistentes) Medium und Kultur über Nacht bei 220 U/min bei 37 °C.
    2. Die Bakterienlösung (ab Schritt 2.2.1.) wird in 2 L Medium geimpft, bei 220 U/min, 37 °C für 5 h bis zum logarithmischen Wachstumsstadium kultiviert (der OD600nm liegt zwischen 0,6 und 0,8).
    3. Wenn der OD bei 600 nm der Bakterienlösung 0,6-0,8 erreicht, wird Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG, siehe Materialtabelle) hinzugefügt, um die Endkonzentration der Bakterienlösung auf 0,5 mM zu bringen, und dann über Nacht bei 220 U/min bei 25 °C kultiviert.
  3. Führen Sie eine OMV-SC-Reinigung durch.
    1. Zentrifugieren Sie die Bakterienlösung bei 7.000 x g bei 4 °C für 30 min.
    2. Filtern Sie den Überstand mit einem 0,22 μm Membranfilter und konzentrieren Sie ihn dann mit einer 100 kD Ultrafiltrationsmembran oder Hohlfasersäule (siehe Materialtabelle).
    3. Filtern Sie das Konzentrat durch einen 0,22-μm-Membranfilter, zentrifugieren Sie es dann bei 150.000 x g bei 4 °C für 2 h mit einer Ultrazentrifuge (siehe Materialtabelle) und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
    4. Resuspendieren Sie den Niederschlag mit PBS und lagern Sie ihn bei −80 °C. Die Lösung kann bei −80 °C langzeitstabil bleiben.

3. RBD-ST Vorbereitung

  1. Führen Sie die RBD-ST-Transfektion durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Wählen Sie ein geeignetes eukaryotisches Expressionssystem (z. B. HEK293F) und kultivieren Sie die Zellen nach der Genesung über Nacht bei 130 U/min bei 37 °C.
    2. 20 μL HEK293F-Zelllösung in den automatisierten Zellzähler geben (siehe Materialtabelle), die Anzahl der Zellen aufzeichnen, die Konzentration auf 1 x 106 Zellen/ml einstellen und dann die Zellen bei 130 U/min bei 37 °C für 4 h kultivieren.
    3. RBD-ST-Plasmid durch einen 0,22 μm Membranfilter filtern und 300 μg Plasmide in das Zellkulturmedium geben (siehe Materialtabelle), bis das Endvolumen 10 ml beträgt; 10 s schütteln.
    4. PEI (1 mg/ml, siehe Materialtabelle) im Wasserbad auf 65 °C erhitzen, 0,7 mL PEI mit 9,3 ml Zellkulturmedium mischen und 10 s intermittierend schütteln.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Lösung nicht kräftig. Andernfalls können die entstehenden Blasen die Transfektionseffizienz beeinträchtigen.
    5. Plasmidlösung in die PEI-Lösung geben, die Mischung intermittierend 10 s schütteln und 15 min bei 37 °C inkubieren.
    6. Die Mischung in 280 ml Zellkulturmedium geben und 5 Tage lang bei 130 U/min bei 37 °C kultivieren.
  2. Führen Sie eine RBD-ST-Reinigung durch.
    1. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.000 x g bei 25 °C für 20 min und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand aufzufangen.
    2. Füllen Sie die Säule mit 2 ml Ni-NTA-Agarose (siehe Materialtabelle) und waschen Sie sie 3x mit 3x PBS.
    3. Fügen Sie Imidazol (siehe Materialtabelle) in den Zellüberstand hinzu, um die Endkonzentration von 20 mM zu erreichen, und laden Sie den Zellüberstand 2x.
    4. Fügen Sie 3 Säulenvolumina (CV) PBS hinzu, die 20 mM Imidazol zum Waschen enthalten, und sammeln Sie die Waschfraktion.
    5. Gradientenelue mit 3 CV PBS mit niedrigen bis hohen Konzentrationen (z. B. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) Imidazol; Elue 2x für jede Konzentration.
    6. Verwenden Sie SDS-PAGE21 , um den RBD-ST in verschiedenen Konzentrationsgradienten zu identifizieren.

4. OMV-RBD Biokonjugation und Reinigung

  1. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der BCA-Methode (siehe Materialtabelle).
    1. Die BSA-Standardproteinlösung wird in Serie von 2 mg/ml auf 0,0625 mg/ml verdünnt, die gereinigten OMV-SC und RBD-ST 10x verdünnt, und dann BCA-Arbeitslösungen A und B (im Assay-Kit enthalten) im Verhältnis 50:1 (v/v) gemischt.
    2. Verdünnte Proteinlösung (25 μL/Well) hinzufügen und mit BCA-Arbeitslösung mischen (200 μL/Well); Bei 37 °C 30 min inkubieren.
    3. Messen Sie die Absorption (OD) bei 562 nm jeder Vertiefung und berechnen Sie die Proteinkonzentration aus der Standardkurve22.
  2. Führen Sie eine Biokonjugation von OMV-SC und RBD-ST durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Mischen Sie OMV-SC und RBD-ST in PBS im Verhältnis 40:1 (w/w).
    2. Vertikal drehen, um die Mischung über Nacht bei 15 U/min bei 4 °C zu mischen.
      HINWEIS: Verschiedene Antigene können in unterschiedlichen Anteilen reagieren. Man könnte verschiedene Reaktionsverhältnisse basierend auf den Eigenschaften des Antigens ausprobieren.
  3. Überprüfen Sie die Reaktionseffizienz.
    1. Bereiten Sie 10 μL OMV-SC, RBD-ST und das Reaktionsprodukt vor (Schritt 4.2.). Fügen Sie 2,5 μL 5x Ladepuffer hinzu (siehe Materialtabelle) und erhitzen Sie die Proben bei 100 °C für 5 min. Laden Sie die Proben in das Gel (10 μL/Well). Führen Sie die Elektrophorese bei 60 V für 20 min durch und ändern Sie den Zustand für 1 h auf 120 V.
    2. Übertragen Sie das Protein aus dem Gel auf PVDF-Western-Blotting-Membranen (siehe Materialtabelle) bei 100 V für 70 min.
    3. Die Membran in 5% fettfreies Milchpulver/TBST geben und 1 h schütteln. Dann 3x mit TBST für 5 min pro Waschgang mit Schütteln waschen.
    4. Legen Sie die Membran in 0,1% His-Tag-Antikörper/TBST (siehe Materialtabelle) und schütteln Sie sie für 1 h, dann waschen Sie 3x mit TBST für 5 min pro Waschgang mit Schütteln.
    5. Legen Sie die Membran in 0,02% Anti-Maus-IgG1-Antikörper (HRP)/TBST (siehe Materialtabelle) und schütteln Sie sie für 40 min, dann waschen Sie 3x mit TBST für 5 min pro Waschgang mit Schütteln.
    6. Fügen Sie eine verbesserte Chemilumineszenzlösung hinzu (siehe Materialtabelle) und legen Sie die Membran frei.
  4. Führen Sie eine Reinigung von OMV-RBD durch.
    1. 1 ml der umgesetzten OMV-RBD-Lösung auf 10 ml verdünnen und die Verdünnung bei 150.000 x g bei 4 °C für 2 h zentrifugieren.
    2. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu verwerfen und den Rückstand mit 10 ml PBS aufzuheben. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 150.000 x g bei 4 °C für 2 h.
    3. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie den Rückstand mit 1 ml PBS.
      ANMERKUNG: Wenn die Löslichkeit des Antigens viel geringer ist, kann der gleiche Trenneffekt durch Größenausschlusschromatographie19 erreicht werden.

5. Charakterisierung

  1. Führen Sie dynamische Lichtstreuung (DLS) durch.
    1. Die Proben werden auf eine Konzentration von 100 μg/ml verdünnt und 1 ml Probe in die Probenzelle gegeben.
    2. Wählen Sie "Größe" für "Messtyp", "Protein" für "Probenmaterial", "Wasser" für "Dispergiermittel", "25 °C" für "Temperatur", laden Sie dann Proben und messen Sie automatisch23.
  2. Nehmen Sie Bilder mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) auf.
    1. Die Proben werden auf 100 μg/ml verdünnt. Nehmen Sie ein Kupfergitter mit 200 Mesh, fügen Sie 20 μL Probe hinzu und lassen Sie es 10 Minuten lang absorbieren.
    2. Verwenden Sie Filterpapier, um die Lösung abzuleiten, fügen Sie 20 μL 3% Uranylacetat zum Trägerfilm hinzu und färben Sie für 30 s.
    3. Das Uranylacetat ableiten und die Folie auf natürliche Weise bei Raumtemperatur 1 h trocknen.
    4. Laden Sie die Proben in das TEM-System (siehe Materialtabelle) und erfassen Sie Bilder bei 80 kV.

Ergebnisse

Das Flussdiagramm für dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll könnte ein allgemeiner Ansatz zur Nutzung von OMVs als Impfstoffplattform sein. Man muss nur die geeigneten Expressionssysteme basierend auf der Art der Antigene auswählen.

Abbildung 2 zeigt ein realisierbares Plasmid-Design-Schema. Das SC-Gen ist über einen flexiblen Linker mit dem ClyA-Gen verbunden, während ST mit dem 5'-Terminal des RBD-Ge...

Diskussion

Um eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform zu schaffen, wurde SC-fusioniertes ClyA in BL21(DE3)-Stämmen exprimiert, die aufgrund ihrer Vorteile bei der Proteinexpression24 eines der am weitesten verbreiteten Modelle für die rekombinante Proteinproduktion sind, so dass während des Prozesses der Bakterienproliferation genügend SC-Fragmente auf der Oberfläche der OMVs angezeigt werden. Gleichzeitig wurde ein ST-fusioniertes Zielantigen für die chemische Kopplung zwischen den Ant...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Key Program der Chongqing Natural Science Foundation (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) und das Chinese National Natural Science Foundation Project (Nr. 31670936, 82041045).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin sodiumSangon BiotechA610028
Automated cell counterCountstarBioTech
BCA protein quantification Kitcwbiocw0014s
ChemiDoc Touching Imaging SystemBio-rad
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatusCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
Goat pAb to mouse IgG1Abcamab97240
High speed freezing centrifugeBioridgeH2500R
His-Tag mouse mAbCell signaling technology2366s
ImidazoleSangon BiotechA600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosideSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Non-fat powdered milkSangon BiotechA600669
OPM-293 cell culture mediumOpm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmidWuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer salineZSGB-bioZLI-9061
Polyethylenimine LinearPolysciences23966-1
Prestained protein ladderThermo26616
pThioHisA ClyA-SC plasmidWuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting MembranesRoche03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x)BeyotimeP0015
Sodium chlorideSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)Thermo34577
Suspension instrumentLife TechnologyHula Mixer
Transmission Electron MicroscopeHitachiHT7800
TryptoneOxoidLP0042B
UltracentrifugeBeckman coulterXPN-100
Ultraviolet spectrophotometerHitachiU-3900
Yeast extractSangon BiotechA610961

Referenzen

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