JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает биоинженерию везикул наружной мембраны как платформу вакцины "Plug-and-Display", включая производство, очистку, биоконъюгацию и характеристику.

Аннотация

Биомиметические наночастицы, полученные из бактерий или вирусов, привлекли значительный интерес к исследованиям и разработкам вакцин. Наружные мембранные везикулы (OMV) в основном секретируются грамотрицательными бактериями во время среднего роста, с наноразмерным диаметром и самоадъювантной активностью, которая может быть идеальной для доставки вакцины. OMV функционируют как многогранная система доставки белков, нуклеиновых кислот и малых молекул. Чтобы в полной мере использовать биологические характеристики OMV, биоинженерные OMV, полученные из Escherichia coli, были использованы в качестве носителя, а SARS-CoV-2 рецептор-связывающий домен (RBD) в качестве антигена для создания платформы вакцины «Plug-and-Display». Домены SpyCatcher (SC) и SpyTag (ST) в Streptococcus pyogenes применялись для сопряжения OMV и RBD. Ген cytolysin A (ClyA) транслировался с геном SC в виде белка слияния после трансфекции плазмиды, оставляя реактивный сайт на поверхности OMV. После смешивания RBD-ST в обычной буферной системе в течение ночи между OMV и RBD образовалось ковалентное связывание. Таким образом, была получена мультивалентная вакцина OMV. Заменяя их различными антигенами, платформа вакцин OMV может эффективно отображать различные гетерогенные антигены, тем самым потенциально быстро предотвращая эпидемии инфекционных заболеваний. Этот протокол описывает точный метод построения платформы вакцины OMV, включая производство, очистку, биоконъюгацию и характеристику.

Введение

В качестве потенциальной платформы вакцины везикулы наружной мембраны (OMV) привлекают все больше и больше внимания в последние годы 1,2. OMV, в основном секретируемые естественным образом грамотрицательными бактериями3, представляют собой сферические наноразмерные частицы, состоящие из липидного бислоя, обычно размером 20-300 нм4. OMV содержат различные родительские бактериальные компоненты, включая бактериальные антигены и патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), которые служат твердыми иммунными потенциаторами5. Используя свои уникальные компоненты, естественную структуру пузырьков и отличные участки модификации генной инженерии, OMV были разработаны для использования во многих биомедицинских областях, включая бактериальные вакцины6, адъюванты7, препараты иммунотерапии рака8, векторы доставки лекарств9 и антибактериальные адгезивы10.

Пандемия SARS-CoV-2, которая распространилась по всему миру с 2020 года, нанесла тяжелый урон глобальному обществу. Рецептор-связывающий домен (RBD) в спайковом белке (S-белок) может связываться с человеческим ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2), который затем опосредует проникновение вируса в клетку 11,12,13. Таким образом, RBD, по-видимому, является основной целью для открытия вакцин 14,15,16. Однако мономерный RBD плохо иммуногенен, а его малая молекулярная масса затрудняет распознавание иммунной системой, поэтому часто требуются адъюванты17.

С целью повышения иммуногенности RBD были построены OMV, отображающие поливалентные RBD. Существующие исследования с использованием OMV для отображения RBD обычно сплавляют RBD с OMV для экспрессии в бактериях18. Тем не менее, RBD является белком, полученным из вируса, и прокариотическая экспрессия, вероятно, влияет на его активность. Чтобы решить эту проблему, система SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), полученная из Streptococcus pyogenes, была использована для формирования ковалентного изопептида с OMV и RBD в обычной буферной системе19. Домен SC экспрессировали с помощью цитолизина А (ClyA) в виде белка слияния биоинженерной кишечной палочкой, а ST экспрессировали RBD через систему клеточной экспрессии HEK293F. OMV-SC и RBD-ST смешивали и инкубировали в течение ночи. После очистки ультрацентрифугированием или размерно-эксклюзионной хроматографией (SEC) получали OMV-RBD.

протокол

1. Плазмидная конструкция

  1. Вставьте ДНК, кодирующую последовательность SpyCatcher (дополнительный файл 1), в плазмиду pThioHisA-ClyA, устойчивую к ампициллину (см. Таблицу материалов) между сайтами BamH I и Sal I для построения плазмиды pThioHisA ClyA-SC после ранее опубликованного отчета20.
  2. Синтезированный ген слияния SpyTag-RBD-Histag (дополнительный файл 1) превращается в плазмиду pcDNA3.1 (см. Таблицу материалов) между сайтами BamH I и EcoR I для построения плазмиды pcDNA3.1 RBD-ST после ранее опубликованного отчета19.

2. Подготовка к OMV-SC

  1. Выполните преобразование ClyA-SC, выполнив следующие действия.
    1. Добавьте 5 мкл плазмидного раствора pThioHisA ClyA-SC (50 нг/мкл) к 50 мкл компетентного штамма BL21, осторожно продуть и дать остыть на льду в течение 30 мин.
    2. Поместите раствор на 90 с на водяную баню при 42 °C, а затем сразу же положите смешанный раствор на лед на 3 мин.
    3. Добавить 500 мкл среды LB к бактериальной суспензии и после смешивания культивировать при 220 об/мин при 37 °C в течение 1 ч.
    4. Нанесите всю трансформацию на агаровую пластину LB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл, см. Таблицу материалов) и культивируйте на ночь при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В последующих экспериментах ампициллин держали в той же концентрации в среде. Если нет, это может привести к потере плазмид в бактериях.
  2. Для производства OMV-SC выполните следующие действия.
    1. Выделяют одну колонию из пластины (стадия 2.1.4.) до 20 мл LB (ампициллин-резистентной) среды и культивируют в течение ночи при 220 об/мин при 37 °C.
    2. Инокулируют бактериальный раствор (со стадии 2.2.1.) в 2-литровую среду, культивируют при 220 об/мин, 37 °C в течение 5 ч до логарифмической стадии роста (OD600 нм составляет от 0,6 до 0,8).
    3. Когда ОД при 600 нм бактериального раствора достигнет 0,6-0,8, добавляют изопропилбета-D-тиогалакопиранозид (IPTG, см. Таблицу материалов), чтобы конечная концентрация бактериального раствора составляла 0,5 мМ, а затем культивируют на ночь при 220 об/мин при 25 °C.
  3. Выполните очистку OMV-SC.
    1. Центрифугируют бактериальный раствор при 7000 х г при 4 °C в течение 30 мин.
    2. Отфильтруйте супернатант мембранным фильтром 0,22 мкм, затем сконцентрируйте его с помощью ультрафильтрационной мембраны 100 кД или колонны из полого волокна (см. Таблицу материалов).
    3. Отфильтруйте концентрат через мембранный фильтр 0,22 мкм, затем центрифугируйте его при 150 000 х г при 4 °C в течение 2 ч с помощью ультрацентрифуги (см. Таблицу материалов) и выбросьте супернатант пипеткой.
    4. Повторно суспендируйте осадки с помощью PBS и храните их при −80 °C. Раствор может поддерживать долгосрочную стабильность при −80 °C.

3. Подготовка RBD-ST

  1. Выполните трансфекцию RBD-ST, выполнив следующие действия.
    1. Выберите подходящую систему эукариотической экспрессии (например, HEK293F) и культивируйте клетки в течение ночи при 130 об/мин при 37 °C после восстановления.
    2. Добавьте 20 мкл клеточного раствора HEK293F в автоматизированный счетчик клеток (см. Таблицу материалов), запишите количество клеток, отрегулируйте концентрацию до 1 х 106 клеток/мл, а затем культивируйте клетки при 130 об/мин при 37 °C в течение 4 ч.
    3. Фильтровать плазмиду RBD-ST через мембранный фильтр 0,22 мкм и добавлять 300 мкг плазмид в питательную среду клеток (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока конечный объем не составит 10 мл; встряхивать в течение 10 с.
    4. Нагреть PEI (1 мг/мл, см. Таблицу материалов) до 65 °C на водяной бане, смешать 0,7 мл PEI с 9,3 мл клеточной питательной среды и периодически встряхивать в течение 10 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не встряхивайте раствор энергично. В противном случае образовавшиеся пузырьки могут повлиять на эффективность трансфекции.
    5. Добавьте плазмидный раствор в раствор PEI, периодически встряхивайте смесь в течение 10 с и инкубируйте ее при 37 °C в течение 15 мин.
    6. Добавляют смесь в 280 мл клеточной культуральной среды и культивируют при 130 об/мин при 37 °C в течение 5 дней.
  2. Выполняют очистку RBD-ST.
    1. Центрифугируйте клетки при 6000 х г при 25 °C в течение 20 мин и используйте пипетку для сбора супернатанта.
    2. Заполните столбик 2 мл Агарозы Ni-NTA (см. Таблицу материалов) и промыть его в 3 раза 3x PBS.
    3. Добавьте имидазол (см. Таблицу материалов) в супернатант ячейки, чтобы получить конечную концентрацию 20 мМ, и нагрузите супернатант ячейки в 2 раза.
    4. Добавьте 3 колонных объема (CV) PBS, содержащих 20 мМ имидазола для промывки, и соберите промывочную фракцию.
    5. Градиент элюируют с 3 CV PBS, содержащими низкие и высокие концентрации (например, 0,3 М, 0,4 М, 0,5 М) имидазола; элюировать 2x для каждой концентрации.
    6. Используйте SDS-PAGE21 для идентификации RBD-ST в различных градиентах концентрации.

4. Биоконъюгация и очистка OMV-RBD

  1. Определяют концентрацию белка методом BCA (см. Таблицу материалов).
    1. Последовательно разбавляют стандартный белковый раствор BSA от 2 мг/мл до 0,0625 мг/мл, разбавляют очищенные OMV-SC и RBD-ST 10x, затем смешивают рабочие растворы BCA A и B (предоставляются в наборе для анализа) в соотношении 50:1 (v/v).
    2. Добавить разбавленный белковый раствор (25 мкл/лунку) и смешать с рабочим раствором БЦА (200 мкл/лунка); инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
    3. Измерьте абсорбцию (OD) при 562 нм каждой лунки и рассчитайте концентрацию белка по стандартной кривой22.
  2. Выполните биоконъюгацию OMV-SC и RBD-ST, выполнив следующие действия.
    1. Смешайте OMV-SC и RBD-ST в PBS в соотношении 40:1 (w/w).
    2. Вертикально повернуть, чтобы смешать смесь в течение ночи при 15 об/мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные антигены могут реагировать в разных пропорциях. Можно попробовать различные соотношения реакций, основанные на характеристиках антигена.
  3. Проверьте эффективность реакции.
    1. Готовят 10 мкл OMV-SC, RBD-ST и продукт реакции (стадия 4.2.). Добавьте 2,5 мкл 5-кратного нагрузочного буфера (см. Таблицу материалов) и нагревайте образцы при 100 °C в течение 5 мин. Загрузите образцы в гель (10 мкл/лунка). Выполняют электрофорез при 60 В в течение 20 мин и изменяют состояние до 120 В в течение 1 ч.
    2. Перенос белка из геля в PVDF вестерн-блоттинговые мембраны (см. Таблицу материалов) при 100 В в течение 70 мин.
    3. Поместите мембрану в 5% обезжиренное сухое молоко / TBST и встряхните в течение 1 ч. Затем промыть 3x TBST в течение 5 мин на одну стирку с встряхиванием.
    4. Поместите мембрану в 0,1% антитела His-Tag/TBST (см. Таблицу материалов) и встряхните в течение 1 ч, затем промывайте 3 раза TBST в течение 5 мин на каждую промывку с встряхиванием.
    5. Поместите мембрану в 0,02% антимышечное антитело IgG1 (HRP)/TBST (см. Таблицу материалов) и встряхните в течение 40 минут, затем промывайте 3 раза TBST в течение 5 минут на стирку с встряхиванием.
    6. Добавляют усиленный хемилюминесцентный раствор (см. Таблицу материалов) и обнажают мембрану.
  4. Выполняют очистку OMV-RBD.
    1. Разбавить 1 мл прореагировавшего раствора OMV-RBD до 10 мл и центрифугировать разбавление при 150 000 х г при 4 °C в течение 2 ч.
    2. Используйте пипетку, чтобы выбросить супернатант и суспендировать остаток с 10 мл PBS. Центрифугировать суспензию при 150 000 х г при 4 °C в течение 2 ч.
    3. Выбрасываем супернатант и суспендируем остаток с 1 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если растворимость антигена значительно ниже, то такой же эффект разделения может быть достигнут с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии19.

5. Характеристика

  1. Выполняйте динамическое рассеяние света (DLS).
    1. Разбавьте образцы до концентрации 100 мкг/мл и добавьте 1 мл образца в ячейку образца.
    2. Выберите «Размер» для «Тип измерения», «Белок» для «Образец материала», «Вода» для «Диспергатора», «25 °C» для «Температуры», а затем загрузите образцы и автоматически измерьте23.
  2. Захват изображений с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM).
    1. Разбавить образцы до 100 мкг/мл. Возьмите 200-сетчатую медную сетку, добавьте к ней 20 мкл образца и дайте ему впитаться в течение 10 минут.
    2. Используйте фильтровальную бумагу для удаления раствора, добавьте 20 мкл 3% уранилацетата в опорную пленку и окрашивайте в течение 30 с.
    3. Отсоедините уранилацетат и высушите пленку естественным путем при комнатной температуре в течение 1 ч.
    4. Загрузите образцы в систему ТЕА (см. Таблицу материалов) и захватите изображения при напряжении 80 кВ.

Результаты

Блок-схема для этого протокола показана на рисунке 1. Этот протокол может быть общим подходом к использованию OMV в качестве платформы вакцин; нужно только выбрать соответствующие системы экспрессии на основе типа антигенов.

На рисунке 2 пр?...

Обсуждение

Для создания платформы вакцины против наночастиц «Plug-and-Display» SC-сплавленный ClyA был экспрессирован в штаммах BL21(DE3), который является одной из наиболее широко используемых моделей для производства рекомбинантного белка из-за его преимуществ в экспрессии белка24, так что на по...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Ключевой программой Чунцинского фонда естественных наук (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) и проект Китайского национального фонда естественных наук (No 31670936, 82041045).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin sodiumSangon BiotechA610028
Automated cell counterCountstarBioTech
BCA protein quantification Kitcwbiocw0014s
ChemiDoc Touching Imaging SystemBio-rad
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatusCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
Goat pAb to mouse IgG1Abcamab97240
High speed freezing centrifugeBioridgeH2500R
His-Tag mouse mAbCell signaling technology2366s
ImidazoleSangon BiotechA600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosideSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Non-fat powdered milkSangon BiotechA600669
OPM-293 cell culture mediumOpm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmidWuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer salineZSGB-bioZLI-9061
Polyethylenimine LinearPolysciences23966-1
Prestained protein ladderThermo26616
pThioHisA ClyA-SC plasmidWuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting MembranesRoche03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x)BeyotimeP0015
Sodium chlorideSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)Thermo34577
Suspension instrumentLife TechnologyHula Mixer
Transmission Electron MicroscopeHitachiHT7800
TryptoneOxoidLP0042B
UltracentrifugeBeckman coulterXPN-100
Ultraviolet spectrophotometerHitachiU-3900
Yeast extractSangon BiotechA610961

Ссылки

  1. Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
  2. Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
  3. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  4. Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
  5. Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
  6. Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
  7. Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
  8. Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
  9. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
  10. Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
  11. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  12. Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
  13. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
  14. Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
  15. Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
  16. Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
  17. Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
  18. Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
  19. Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
  20. Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
  21. Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
  22. Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
  23. Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
  24. Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
  25. Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
  26. Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
  27. Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  28. Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
  29. van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
  30. Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
  31. Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
  32. Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
  33. Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
  34. Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
  35. Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены