* これらの著者は同等に貢献しました
このプロトコルは、液体培地を使用して、成虫ショ ウジョウバエメラノガスターの生存率に対する化学毒物の影響を評価する効率的で安価な方法を説明しています。
人間の産業は何十万もの化学物質を生成しますが、その多くは環境の安全性や人間の健康への影響について十分に研究されていません。この化学物質の安全性情報の不足は、高価で労働集約的で時間のかかる哺乳類の現在の試験方法によって悪化しています。最近、科学者と規制当局は、より安価で、より迅速で、動物の苦痛を軽減する化学物質安全性試験のための新しいアプローチ方法論(NAM)の開発に取り組んでいます。出現する重要なNAMの1つは、哺乳類モデルの代替として無脊椎動物を使用して、ヒトを含む遠縁種全体で保存された化学的作用機序を解明することです。これらの取り組みを進めるために、ここではショ ウジョウバエメラノガスターを使用して化学物質の安全性を評価する方法について説明します。このプロトコルは、曝露された成虫のハエの生存率と摂食行動を測定するための単純で迅速で安価な手順を説明しています。さらに、このプロトコルは、ゲノムおよびメタボロミクスアプローチ用のサンプルを生成するために簡単に適合させることができます。全体として、このプロトコルは、ショウ ジョウバエ を精密毒物学で使用するための標準モデルとして確立する上で重要な前進を表しています。
人間は、空気1、食品2、水3,4、医薬品5、洗浄剤6、パーソナルケア製品7、工業用化学物質7、建築材料7など、さまざまなソースからの化学物質に絶えずさらされています。さらに、毎年何千もの新しい化学物質が導入されており8、その多くは健康と環境の安全性について適切に審査されていません。この適切な化学的安全性試験の欠如は、マウスやラットなどの哺乳類モデルへの過度の依存に一部起因しています。このようなげっ歯類モデルは有益であるが、これらのシステムにおける化学的安全性試験は、高価で時間がかかり、しばしば試験動物に許容できないレベルの苦痛を引き起こす9。
哺乳類の化学物質の安全性試験に関連する財政的および倫理的負担、および哺乳類研究の時間のかかる性質は、新しい化学物質を取り巻くデータの不足の主な要因です。この問題に対処するために、米国環境保護庁(EPA)、欧州化学機関(ECHA)、カナダ保健省、およびその他の機関は、新しいアプローチ方法論(NAM)を規制の枠組みに組み込む措置を実施しています10、したがって、北米とヨーロッパの政策を、動物の使用を置き換え、削減、および改善するという国際的な目標に沿っています(3Rの原則)11。 12、13、14。NAMは、主にin vitroおよびin silicoモデルに基づくさまざまなアッセイを網羅しており、哺乳類の試験種に与えられた逆境を観察する代わりに化学的毒性のメカニズムの理解を提供し、それによって化学的リスク評価のためのデータ生成率を高めながら、忠実度の高い出力を生成します15.しかし、これらの方法は、臓器間コミュニケーションや内分泌シグナル伝達を含む重要な生物学的プロセスの混乱など、全身毒性から保護することがまだ証明されていません。さらに、特定の組織内の化学物質の生物蓄積、個々の化合物が吸収および分泌される能力、および行動と化学物質曝露の間の相互作用を説明することはできません。
in vitroおよび計算モデルの制限により、哺乳類モデルを削減または置き換えるためのNAMの使用を成功させるには、ショウジョウバエ、ショウジョウバエメラノガスターなどの無脊椎動物のin vivoモデルも含める必要があります。ハエの以前の研究は、この生物が有毒分子から動物細胞を保護する保存された遺伝的経路を研究するのに適していることを示しています16、17、18、19、20、21、22。さらに、ハエはヒトと顕著な遺伝的類似性を示しており、ヒトの疾患の65%以上の機能的ホモログ23,24,25や、重要な機能的経路のさらに大きな保存26などがある。これらの特徴は、比較的短いライフサイクル、低いメンテナンスコスト、および容易に観察可能な行動反応と相まって、ショウジョウバエを毒物学的モデルとしての使用に適しています27,28,29,30。さらに、ハエはげっ歯類モデルよりもはるかに高いスループットを持ち、他の非生物NAMでは容易に検出できない代謝、生理学、およびホルモンシグナル伝達への影響を捉えます9。
ここで説明するプロトコルは、成虫ショ ウジョウバエに対する化学物質曝露の影響をテストするためのフレームワークを表しています。この方法は、効率的、安価、再現性があると同時に、研究者が試験化学物質と接触し、メタボロミクスやその他のオミクスアプローチのためのサンプル収集に対応する時間を最小限に抑えるように設計されています。このプロトコルは、実験ごとに単一の化学物質をテストするために最適化されていますが、さまざまな溶媒や化学物質の組み合わせなど、他の実験パラメーターに簡単に対応できます。
注意: このプロトコルのすべてのステップでニトリル手袋を着用してください。評価された各化学物質の安全データシートに従って、白衣、目の保護具、および/または呼吸用保護具を着用してください。
1.バイアルおよび湿度チャンバーの準備
注意: 手順1.1〜1.5は、他の実験セクションを開始する前にいつでも完了できます。ニトリル手袋は、汚染を防ぐためにバイアル調製中は常に着用する必要があります。
2.フライ飼育
3.化学物質暴露のためのハエの準備
4. 原液の調製
注:ハエは、酵母-スクロース液体培地でテスト化学物質を与えられます。このセクションでは、濃縮供給媒体とテスト薬品のストック溶液の調製について説明します。
5.露光バイアルの調製:距離探索実験
注:プロトコルのステップ5および6は、100%の致死性を誘発する試験化学物質の最低用量と、致命的な表現型を誘発できない最高用量を特定するように設計されています。これらの濃度が以前の実験によってすでに決定されている場合は、用量反応曲線を計算するためのステップ7および8を参照してください。露光媒体は、露光バイアルにハエを添加する直前に調製する必要があります。
6.フライ化学物質への暴露:距離探索実験
7.曝露バイアルの調製:用量反応曲線の生成
注:ステップ5および6で概説されているプロトコルは、表現型を引き出すために必要な化学物質濃度を広く決定するように設計されています。プロトコルのステップ7および8は、正確な用量反応曲線を計算するために使用される。
8.フライ化学物質曝露:線量反応曲線の生成
9.用量反応曲線の計算
ハエは長い間、亜ヒ酸ナトリウム(NaAsO2)の毒性を測定するための研究のモデルとして役立ってきました35,36,37,38。プロトコルの有効性を実証するために、これらの結果を以前の研究と比較することを目的として、オスおよびメスのハエをNaAsO2に曝露した。 上記の方法論を用いて、成人オレゴン-R(BDSCストック#2057)の雄および雌を、ある範囲のNaAsO2濃度(0、0.01、0.02、0.1、0.2、1、および2mM)に曝露し、曝露開始後48時間で致死率をスコア化した(図1A、B)。
この初期分析の目的は、NaAsO2毒性のより正確な特徴付けを可能にする濃度のおおよその範囲を特定することであった。その後の実験において、NaAsO 2用量反応曲線をより正確に定義する濃度(0、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、および5mM)を選択した(図1C、D)。結果として得られた分析は、100%の致死性を誘発するいくつかの濃度を調べたことに注意してください。データは、環境保護庁の公開されているベンチマーク線量ソフトウェアバージョン3.2.0.125を使用して分析されました。データは「二分」としてモデル化され、二分ヒルモデルはその後の分析に使用されました。このモデルに基づいて、NaAsO2を給餌したオスのハエの最終的なLD10、LD25、およびLD50は、それぞれ0.30 mM、0.50 mM、および0.65 mMでした。メスのハエの場合、これらの値はわずかに高く、LD10は0.30 mM、LD25は0.65 mM、LD50は0.90 mMでした。全体として、この方法を使用して得られた値は、ショウジョウバエメラノガスター35,36,37,38におけるヒ素毒性について以前に報告されたものと同様であり、したがって方法論を検証します。
線量反応曲線の計算に用いた6回の反復に加えて、オスとメスのハエには、光学顕微鏡を使用して消化管で容易に見える1%FD&Cブルーを含むNaAsO2曝露溶液も与えられました。NaAsO 2を給餌したハエの腸内の青色色素の存在に基づいて、液体培地中に存在するNaAsO 2濃度に関係なく、オスとメスの両方のハエが化学物質曝露の開始後24時間摂食し続けました(図2)。 しかし、摂取した食物は、女性で0.2 mM、男性で0.5 mMを超える用量で時折逆流することが観察されました(図2)。これらの知見は、逆流がショウジョウバエのヒ素中毒に対する反応に重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。
図1:NaAsO2で48時間処理した雄と雌のショウジョウバエの用量反応曲線。 全てのグラフは、二分ヒルモデルに基づいて試験された各NaAsO2濃度におけるハエの死骸の推定割合を示す。(A,B)広範囲のNaAsO2濃度を試験して、ハエの各雌雄が死に始める線量を概算した。(A)は男性のデータ、(B)は女性のデータを示す。N = 4バイアル、バイアルあたり20匹のハエ。(C,D)より狭い範囲のNaAsO2濃度を試験して、ハエの各性別の10%、25%、および50%が死亡した正確な用量を決定した。これらの線量は、各グラフの右側に示されています。(C)は男性のデータ、(D)は女性のデータを示す。N = 6バイアル、バイアルあたり20匹のハエ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:NaAsO2で24時間処理した雄および雌ショウジョウバエの青色色素アッセイの代表的な結果。顕微鏡写真は、NaAsO2の濃度が増加しているハエを示しています。行(A)は雄のハエ、行(B)は雌のハエを示し、NaAsO2の濃度は左から右に増加している。腹部は低濃度で胸部の近くに少量の青色を示し、曝露媒体が腸に入ったことを示しています。濃度が高いと、青色染料が口の周りに蓄積し始め、露光媒体が逆流していることを示唆しています。スケールバーは1mmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ショウジョウバエメラノガスターは、NAMの強力なシステムとして浮上しています16,18,19,21。ハエコミュニティが利用できる比類のない遺伝資源を活用し、ゲノミクスとメタボロミクスの最近の進歩と組み合わせることにより、ショウジョウバエを使用した化学的安全性研究は、個々の化合物が代謝、生理学、および細胞シグナル伝達を妨害する分子メカニズムを迅速に特定することができます(たとえば、39を参照)。).この安価なプロトコルは、用量反応曲線を迅速に定義し、その後RNA-seqおよびメタボロミクス分析用のサンプルを生成するように設計されています。さらに、この柔軟なプロトコルは、あらゆる遺伝子型での使用に適合させることができ、多くのクラスの化学物質に対応することができます。
このプロトコルの注目すべき側面は、化学物質曝露に使用される液体食品の選択であり、これは以前の研究に基づいていますが、ショウジョウバエ18,22のほとんどの毒物学的研究で使用される固体培地とは異なります。この特定の液体培地は、ハエが一貫した栄養を確実に受けられるように、このプロトコルでハエも給餌される標準的な固体BDSC培地の栄養含有量を反映するように選択されました。液体供給媒体の単純さには多くの利点があります。液体媒体は、溶融して再固化するか、粉末から再構成する必要がある固形食品よりも取り扱いが簡単です。液体媒体はまた、システムのスループットを向上させ、供給媒体全体に化学物質を均一に分配し、危険な化合物の取り扱いに費やす時間を短縮します。さらに、媒体は溶液を加熱する必要がないため、揮発性試験化合物の試験が容易になります。最後に、食品溶液に含まれる成分が比較的少ないため、試験化学物質と他の食事成分との間の望ましくない副反応が最小限に抑えられます。食品に使用される酵母も不活性であり、摂食培地の反応性をさらに制限します。ただし、この方法は発生毒性や幼虫毒性の試験には適していないことに注意してください。
プロトコルで使用される材料の一部は、ポリプロピレンではなくガラスフライバイアルを使用するなど、代替することができます。ただし、使用される材料は、試薬間の不要な化学反応やガラス製品の洗浄に起因する可能性のある化学物質への暴露を回避するために、不活性で使い捨ての両方になるように選択されました。
液体食品の使用は、食品配達のための車両を必要とする。セルロースアセテート濾紙は、その柔軟性および不活性な性質のためにこの目的のために選択された28。他の研究者も同様のプロトコルを使用しましたが、繊細なタスクワイプやグラスファイバーフィルターなどの他の車両を使用しました29,30。セルロースアセテート濾紙は、紙とバイアルの壁の間に大きな隙間なくフライバイアルの底に収まる理想的な形状に切断できる不活性ビヒクルであり、ハエが媒体や車両自体に詰まることによる死亡を防ぐため、これらのニーズに適合しました。
このシステムの重要な制限は、化学物質の最大試験可能濃度が化学物質の溶解度に結びついていることです。非水溶性化合物は追加の溶媒を必要とし、これは目的の化学物質とのさらなるまたは相乗効果をもたらし得る。これはまた、全ての生物において所望のエンドポイントを達成するのに十分濃縮されたストック溶液を調製することができない状況を作り出すことができ、したがって、結果として得られるデータ31の分析を制限する。これに対処するために、水溶性の低い化学物質は、食品溶液に最大0.5%のジメチルスルホキシドを添加することによってテストできます。他の溶媒も使用できますが、生物への溶媒の影響を最小限に抑えながら溶解度を最大化するために、溶液内の最大許容溶媒濃度を決定するには、関心のある各溶媒について追加の研究が必要です。
ショウジョウバエの嗅覚応答の広範な特徴付けは、ハエが有毒な化合物40,41の消費をどのように回避し、処理された培地への摂食の減少につながるかを説明しています。青色色素アッセイは、研究者が実験化学物質42,43,44の各濃度を与えられたハエの摂食行動を効率的にスクリーニングできるようにすることで、この現象に対処します。ハエの胃腸管の青の有無は、ハエが毒物含有培地を食べていたかどうかを示します。ハエの摂食行動を評価するためのより洗練された方法、例えば、フライ液体食品相互作用カウンター45が存在するが、この定性的方法は、よりハイスループットのスクリーニングにより適している。
このプロトコルの注目すべき側面は、ハエを移したり、露光バイアルに液体を追加したりすることなく、48時間の曝露期間に最適化されていることです。湿度チャンバーを使用し、チャンバーを高湿度に保たれたインキュベーターに置くことで、この期間中に供給媒体を含むろ紙が乾燥するのを防ぎました。プロトコルはより長い暴露時間に適応させることができますが、ろ紙が乾燥して溶液濃度の大幅な変化や乾燥による致死性を引き起こさないように方法を調整する必要があります。
最後に、このプロトコルの重要な特徴は、遺伝的変異に容易に対応できることであり、研究者は ショウジョウバエ の膨大な数の遺伝ツールを利用して、野生型生物に関するこれらの予備研究を拡大し、 in vivoでの化学的作用のメカニズムをよりよく理解することができます。これに関して、上記で概説したプロトコルは、野生のハエの毒物学的分析を可能にするPetersonおよびLongによる前述のJoVEプロトコルを補完するように容易に変更することができる18。
ショウジョウバエ32,33,34,35,36における亜ヒ酸ナトリウムの毒性に関するさまざまな先行研究のため、オレゴンRハエはこの化合物で処理され、システムの有効性が実証されました。オスのハエは0.65 mMのLD50を示し、メスは0.90 mMのLD50を示しました。これは、亜ヒ酸ナトリウムで処理された成体ショウジョウバエの以前の研究と一致しています。例えば、GoldsteinとBabich37は、ハエ(男女混合)の50%が0.5mM NaAsO2に7日間曝露した後に死亡したことを発見した。これは現在観察されているよりもわずかに低い線量ですが、それらの方法とこの方法の違い(固体曝露媒体の使用、より長い時間スケール、および男女混合を含む)がこの違いを説明している可能性があります。重要なことに、両方の方法が全体的に類似したLD50値をもたらした。
このプロトコルを使用した実験からの観察は、その後の行動的または機構的研究のための遺伝的および分子的標的を見つけるために使用することができる。曝露法は、メタボロミクスおよびプロテオミクスのサンプリングのために ショウジョウバエ を治療するためにも使用でき、このプロトコルは、精密毒物学の成長分野(精密医療分野46からモデル化)に適しています。これに関して、曝露されたハエは、その後のゲノムおよびメタボロミクス分析のためにステップ8の後に収集され得る。ステップ8で収集されたサンプルは、ステップ3から始めて、LiおよびTennessen47によって説明されるように、次いで処理され得る。
最終的に、上記の実験から得られたデータ、ならびにその後のメタボロミクスおよびプロテオミクスデータは、理想的には種間の比較に使用されるでしょう。前述のように26、そのような種間研究は強力であり、個々の化学物質が保存された生物学的経路をどのように妨害するかを決定することができます。したがって、上記のプロトコルは、門全体の個々の毒物に応答する進化的共通点を見つけ、化学的安全規制に情報を提供するために使用できます。
開示する利益相反はありません。
このプロトコルのテストと最適化に協力してくれたスタッフに感謝します:アメヤ・ベラムカー、マリリン・クラーク、アレクサンダー・フィット、エマ・ローズ・ギャラント、イーサン・ゴールディッチ、マシュー・ロウ、モーガン・マーシュ、カイル・マクラン、アンディ・プーガ、ダーシー・ローズ、キャメロン・ストックブリッジ、ノエル・ゾルマン。また、精密毒性グループの同僚、特に曝露グループのカウンターパートがプロトコルの目標の特定を支援してくれたことに感謝します。
このプロジェクトは、欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムから、助成金契約第965406号に基づいて資金提供を受けました。このマニュアルで紹介する作業は、ASPIS クラスタの一部として実行されました。この出力は著者の見解のみを反映しており、欧州連合はそこに含まれる情報の使用について責任を負いません。この出版物は、国立衛生研究所、国立トランスレーショナルサイエンス推進センター、臨床およびトランスレーショナルサイエンス賞からの賞番号UL1TR002529によって部分的に資金提供されているインディアナ臨床およびトランスレーショナルサイエンス研究所の支援によっても可能になりました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。このプロジェクトの一部は、JRSとPhyloToxコンソーシアムに授与されたインディアナ大学からの資金によって支援されました。JMHとEMPは、ブルーミントンショウジョウバエストックセンターへのNIH賞P40OD018537によってサポートされました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
Mesh for humidity chamber | |||
Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
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