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要約

本プロトコルは、栄養膜細胞などの細胞が細胞外基底膜マトリックスの層上に毛細血管様構造に組織化する古典的な in vitro 血管新生チューブ形成アッセイで形成されたチューブ様構造の回復を可能にする。回収された構造は、さまざまな生化学分析のためのRNAおよびタンパク質の単離に使用されます。

要約

胎盤の発達中、絨毛外栄養膜(EVT)細胞が母体の脱落膜に浸潤し、間葉系から内皮様への移行のプロセスによって子宮螺旋動脈を再構築します。従来、このプロセスはin vitro チューブ形成アッセイによって評価され、重合した基底膜調製物の上に播種されると、細胞はチューブ状構造に組織化されます。構造の写真顕微鏡写真ではいくつかの構造的特徴を測定できますが、EVTが内皮型の表現型に真に関与しているかどうかを評価するには、細胞抽出物の生化学的分析が必要です。RNAおよび/またはタンパク質抽出物を得るために培養皿から細胞を掻き取ることは、重合基底膜からのタンパク質の大部分によってチューブ状構造がひどく汚染されているため、代替手段ではありません。したがって、細胞抽出物を調製する前に、基底膜タンパク質から細胞を分離する戦略が必要です。ここでは、 in vitro チューブ形成アッセイからチューブ様構造を回収し、その後の生化学的手法による分析を行うための、シンプルで迅速かつ費用対効果の高い方法を紹介します。EVT細胞株であるHTR8/SVneo細胞によって形成されたチューブ状構造は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加したPBSとの短時間のインキュベーションにより、重合基底膜から遊離しました。連続洗浄後、精製されたチューブ状構造のすぐに使用できるペレットを得ることができます。このペレットは、その後、RNAおよびタンパク質抽出物を得るために処理することができます。qPCR解析では、コントロール細胞と比較して、EVT由来のチューブ状構造における2つの内皮細胞マーカーであるVE-カドヘリンとα-vインテグリンの誘導発現が証明されました。これは、免疫蛍光法で評価した内皮細胞マーカーCD31の誘導と一致していました。チューブ状構造のタンパク質抽出物のウェスタンブロット分析により、トランスフェクションされたHTR8/SVneo細胞におけるRECKの過剰発現が明らかになりました。したがって、この簡単な方法により、 in vitro チューブ形成アッセイから細胞抽出物を得ることができ、その後のRNAおよびタンパク質発現の分析が可能になります。

概要

妊娠の成功は、胎盤の適切な発達と胎盤循環の確立にかかっています。このプロセスに関連する重要なイベントの 1 つは、子宮螺旋動脈 (uSA)1 のリモデリングであり、高抵抗で低流量の血管から低抵抗で高流量の血管へ移行し、胎盤2 への母体血液の灌流を増加させます。

uSAのリモデリングは、胚盤胞に由来する特殊な栄養膜細胞によって達成されます。胚の着床後、胎児の絨毛外栄養膜(EVT)は、着床部位から母体の脱落膜と子宮を通ってuSAに向かって移動します3。そこに到達すると、EVTは母体の血管関連平滑筋細胞(VSMC)と内皮細胞(EC)の遊走とアポトーシスを誘導します4。その後、EVTは、間葉系から内皮様への移行(MELT)5,6を通じて内皮様表現型を獲得し、血管のVSMCおよびECを置き換えます7。

子癇前症(PE)は、妊娠20週目 以降に発症した母体高血圧症、タンパク尿および/または母体末端器官機能障害の他の症状を特徴とする妊娠特異的症候群です。PEの正確な病因は完全には理解されていませんが、最も受け入れられている仮説は、虚血再灌流、低酸素症、および酸化ストレスによる胎盤の損傷を伴う、胎盤への不十分な血流の永続的な状態を生成する欠陥のあるuSAリモデリング9に関連しており、母体循環への胎盤因子の放出を活性化し、PE9の特徴的な母体症状を引き起こします.したがって、栄養膜細胞によるuSAリモデリングに関与する主要な細胞および分子メカニズムを決定することが重要です。

EVTのMELTの評価は、古典的には、個々の細胞が移動し、血管に似た二次元構造に組織化するin vitro基底膜マトリックスチューブ形成アッセイ10によって達成されます。このプロトコルでは、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫から抽出された可溶化基底膜からなる市販の細胞外マトリックスである重合細胞外マトリックス(通常は基底膜マトリックスと呼ばれる)の薄層にEVT細胞株を播種する必要があります。これは、ラミニン、コラーゲンIV、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン/ニドゲン10によって濃縮された可溶化基底膜で構成される細胞外マトリックスです.形成されたチューブ状構造の解析は、通常、顕微鏡写真で確立された特性(例えば、枝の数またはメッシュインデックス)の同定およびImageJソフトウェア(血管新生分析装置プラグイン)11によるこれらの定量化によって達成される。この方法は、チューブ状構造12,13,14の形成を記述するために広く使用されているが、生化学的分析12,13,14のためにこれらの構造を収集することは不可能であるため、細胞の組織化の特性評価に限定される。これは主に、異なるタンパク質を大量に含む基底膜マトリックスから細胞/チューブを分離することが不可能であるためです。したがって、細胞由来タンパク質の真の寄与を決定することは不可能であり、これは細胞タンパク質の発現を正しく理解するために必要なことです。これらの抽出物中のタンパク質のほとんどは基底膜マトリックスに由来するため、細胞タンパク質の発現は非常に低いことが判明し、ウェスタンブロットによる解析のために大量のタンパク質をSDSページゲルにロードする必要があり、タンパク質の分解能と転写に影響を与えます。適切な分析をほとんど不可能にします。この過剰な基底膜マトリックス由来タンパク質は、さらなる分析に必要な純度のRNAの抽出にも大きく影響します。

このレポートでは、PBS-EDTA処理に基づく、細胞抽出物の生化学的分析のために処理できる基底膜マトリックスからのチューブ状構造の放出を可能にする、シンプルで迅速、かつ費用対効果の高い方法について説明します。この分析法では、生体分子、RNA、タンパク質が大量に得られ、従来の生化学分析、qPCR、ウェスタンブロットに適合します。この戦略は、細胞内分画、パイロシーケンシングによるエピジェネティックマーカーの決定、またはクロマチン免疫沈殿アッセイなどの他のアッセイにも適用できる可能性があることを提案します。簡単に言うと、このプロトコールは、培養皿中のチューブ状構造をPBSとインキュベートし、4°Cで50mMのEDTAを添加して基底膜マトリックスを溶解することで構成されています。この単純なインキュベーションにより、管状構造は懸濁液のままであり、PBSによる一連の洗浄後にEDTAおよび希釈された基底膜マトリックスの過剰を除去した後、管状構造および/または個々の細胞のすぐに使用できるペレットとして得ることができる。次のセクションでは、MELTアッセイのプロトコルとチューブ状構造の回収について説明します。

プロトコル

1. アッセイの準備

注:すべてのステップは無菌条件下で実行する必要があります。すべてのプラスチック材料は無菌で新品でなければなりません。ガラス瓶はオートクレーブ滅菌する必要があります。すべての材料は、層流キャビネットで使用する前に70%エタノール溶液で滅菌する必要があります。最小細胞培養培地(RPMI)は、ウシ胎児血清(FBS)を補給する前に、0.22 μMフィルターによるろ過により滅菌する必要があります。バイオハザード廃棄物(白衣、手袋、後ろに結んだ長い髪など)を扱うときは、常に個人用保護具を着用してください。

  1. 滅菌したRPMI 1640とFBSを滅菌ガラス瓶に添加し、層流キャビネットにRPMI-1640培地(5% FBS完全増殖培地)を調製します。5% FBS溶液の場合、190 mLのRPMI-1640と10 mLのFBSを加えます。RPMI-1640 Media-5% FBSを温度制御された水浴で37°Cで温めます。
  2. 次のように基底膜マトリックスを準備します。ボトルを4°Cで3〜4時間置いて基底膜マトリックスをゆっくりと解凍し、MW-6ディッシュを-20°Cで1時間冷却してから使用してください。解凍後、基底膜マトリックスを氷上に維持します。層流キャビネットで、基底膜マトリックスを氷冷RPMI1640 FBSなしで70%に希釈します。
    注:基底膜マトリックスは、使用するまで-80°Cで保存する必要があります。解凍後、マトリックスの早期重合を避けるために、すべてを4°Cで操作する必要があります。
  3. PBSに適切な量のEDTAを溶解してPBS-EDTAを調製し、最終濃度50 mMのEDTAに到達します。PBS-EDTAを4°Cに維持します。

2. チューブ形成アッセイ

  1. ステップ1.2に示すように、希釈した基底膜マトリックス60 μL/cm2 を添加します。お皿に。チューブ状の構造の定量に必要な顕微鏡写真に干渉する気泡を避けてください。
    注:マルチウェル-6(MW6、面積9.6 cm2)の場合、容量は580 μLの基底膜マトリックス-70%です。
  2. 基底膜マトリックスを含む皿を細胞インキュベーター(5%CO2 および37°C)に2時間移し、基底膜マトリックスの重合を促進します。
    注:重合の最後の1時間の間に、アッセイに使用される細胞の細胞懸濁液を準備し、細胞を播種する準備ができたときに2時間の重合を完了することを目指します。
  3. 2 mLのRPMI-1640-5% FBSで希釈したHTR8/SVneo(EVT細胞株)80,000細胞/cm2 を、重合基底膜マトリックス上および対照としてコーティングされていない皿の上に播種します。基底膜マトリックスが破壊されないように、ウェルの壁に沿って細胞を慎重に播種します。
    注:Matrigel上で均一な細胞分布を確保してください、そうでなければ、細胞が少ない領域や細胞が過密な領域ではチューブが形成されません。
  4. 播種した細胞を細胞インキュベーターに移し、5% CO2 および37°Cで12時間、24時間、および48時間培養します。
    注:通常、管状構造を分析するには24時間で十分ですが、このプロセス中に速度論的タンパク質またはRNAの発現が必要な場合は、細胞を3時間、6時間、12時間、24時間、および48時間インキュベートします。

3. 基底膜マトリックスからの細胞回収

  1. 選択したインキュベーション時間(例えば、12時間、24時間、48時間)に達したら、馴化培地を回収して、選択した測定を行います。
  2. 氷冷した1x PBS、少なくとも3xで細胞を優しく洗浄し、細胞の破片を取り除きます。顕微鏡写真が必要な場合は、各ウェルに1 mLの冷たいPBSを注ぎ、10分以内に写真を撮ります。
  3. PBSを取り出し、700μLのPBS-EDTAを各ウェルに加え、プレートを氷上で3〜5分間インキュベートします。
    注:PBS-EDTAは基底膜マトリックスを溶解するため、細胞ネットワーク全体が懸濁したままになります。
  4. 1.5mLチューブ内のマイクロピペット(p1.000)で管状ネットワークの懸濁液を静かに回収します。
  5. 懸濁液を1,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 最後に、細胞の白いペレットが見えるはずです。
  6. チューブを反転させて上清を取り除き、できるだけ乾燥させようとします。
  7. 4°CでPBS1 mLを添加し、p.1000マイクロピペットで細胞ペレットを穏やかに再懸濁して細胞を洗浄し、溶解した基底膜マトリックスとEDTAを除去します。少なくとも2回繰り返します。
    注意: これらの洗浄手順は重要です。残りの基底膜マトリックスは、細胞ペレット上の粘性層として観察することができました。基底膜マトリックス層のほとんどが除去されるまで、洗浄を繰り返します。
  8. 最終洗浄後、細胞ペレットを直接タンパク質またはRNAの抽出に使用します。あるいは、ペレットをPBSの1 mLに再懸濁し、要件に応じて異なるチューブに分配します(たとえば、RNA抽出用に300 μL、タンパク質抽出用に残りの700 μLなど)。
  9. チューブを1,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、細胞ペレットを得ます。
    注:PBS中の細胞懸濁液の分割は、所望の比率、例えば、1:1、1:2または1:3をRNA:タンパク質に対して行うことができる。ここでは、1:2のRNA:タンパク質の比率が使用されます。この時点で、セルペレットがすぐに必要でない場合は、-80°Cで最大1か月までできるだけ乾燥させて保管してください。

結果

このレポートに記載されているプロトコルを評価するために、まずチューブ状構造を生成しました。 図1Aに示すように、HTR8/SVneo細胞(EVT)は、基底膜マトリックス上のインキュベーションの12時間、24時間、および48時間でチューブ状構造を生成しました。アッセイされた時間間隔でHTR8/SVneoをプラスチックに播種した対照皿では、チューブ状の構?...

ディスカッション

チューブ状形成アッセイは、血管新生過程における細胞間の相互作用を評価するために広く使用されているツールである19。ここでは、EVTなどの非内皮細胞の血管新生特性を、胎盤形成中の重要なイベントである血管子宮血管のリモデリングに示しています6。チューブ状形成は細胞間の相互作用について非常に有益ですが、血管新...

開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

資金調達元 FONDECYT 1221362, ANID, for JG.Convocatoria Nacional Subvención a la Instalación en la Academia, ANID, No.ICWのSA77210087。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Dishes laboratory (100mm)Nest704201
Cell Culure 6-PlateNest0917A
Cell Culure MicroscopeOlympusCKX53SF
CentrifugeThermo ScientificMega Fuge 8R
Circular Analog Magnetic Hotplate StirrerSCI LogexMS-H-S
CO2 IncubatorThermo ScientificHERA cell Vios 160i
Cultrex PathClear Basement Membrane Extract (2 x 5 mL) R&D SYSTEMSRD.3432-010-01
Dry Heat IncubatorsHESMK 200-1
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)WinklerBM-0680
Fetal Bovine Serum Heat InactivatedCapricorn ScientificFBS-HI-12A
Freezer VerticalDEAWOOFF-211VSM
HTR8/SVneoATCCCRL-3271
Laboratory bench rockerTCLS2025
Laminar flow cabinetBIOBASEBSC-1300
Luminescent Image AnalyzerHealth CareImage Quant LAS 500
Matrigel Matrix Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free 10 ml R&D SYSTEMS356231
Micro CentrifugeSCI LogexD1008
Micropipete Lambda Plus, P10Corning4071
Micropipete Lambda Plus, P1000Corning4075
Micropipete Lambda Plus, P2Corning4070
Micropipete Lambda Plus, P20Corning4072
Micropipete Lambda Plus, P200Corning4074
Microscope Camera-SetMOTICMoticam 2300
Pen-strep-amphot b/AntimBiological Industries03-029-1B
pHmeterHANNAHI2221
Phophate Buffer Saline 10X (PBS10X)Corning46-013-CM
Pippete micro tip with filter, sterile, P10JetbiofilPMT231010
Pippete micro tip with filter, sterile, P1000JetbiofilPMT252000
Pippete micro tip with filter, sterile, P200JetbiofilPMT231200
PowerPacBIO-RADE0203
RadwagTCLWTB 200
Remote water Purification SystemMilliporeDirect-Q 5 UV
RPMI 1640 Medium, powderGibco31800-022
Thermal CyclerBioer TechnologyTC-96/G/H(b)C
Thermoregulated bathThermo ScientificTSGP10
Trypsin EDTA 10XCapricorn ScientificTRY-1B10
Ultrasonic ProcessorsSONICSVCX130PB
Vacuum PumpHESROCKER 300
Vortex MixerThermo ScientificLP Vortex Mixer

参考文献

  1. Cartwright, J. E., Fraser, R., Leslie, K., Wallace, A. E., James, J. L. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140 (6), 803-813 (2010).
  2. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. P. Rheological and Physiological Consequences of Conversion of the Maternal Spiral Arteries for Uteroplacental Blood Flow during Human Pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  3. Huppertz, B. The anatomy of the normal placenta. J Clin Pathol. 61 (12), 1296-1302 (2008).
  4. Bulmer, J. N., Innes, B. A., Levey, J., Robson, S. C., Lash, G. E. The role of vascular smooth muscle cell apoptosis and migration during uterine spiral artery remodeling in normal human pregnancy. FASEB J. 26 (7), 2975-2985 (2012).
  5. Paul, M., Chakraborty, S., Islam, S., Ain, R. Trans-differentiation of trophoblast stem cells: implications in placental biology. Life Sci Alliance. 6 (3), 202201583 (2023).
  6. Pollheimer, J., Vondra, S., Baltayeva, J., Beristain, A. G., Knöfler, M. Regulation of placental extravillous trophoblasts by the maternal uterine environment. Front Immunol. 9, 1-18 (2018).
  7. Sato, Y. Endovascular trophoblast and spiral artery remodeling. Mol Cell Endocrinol. 503, 110699 (2020).
  8. Huppertz, B. The critical role of abnormal trophoblast development in the etiology of preeclampsia. Curr Pharm Biotechnol. 19 (10), 771-780 (2018).
  9. Khong, T. Y., et al. Sampling and definitions of placental lesions Amsterdam placental workshop group consensus statement. Arch Pathol Lab Med. 140 (7), 698-713 (2016).
  10. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Can Biol. 15, 378-386 (2005).
  11. Carpentier, G., et al. Angiogenesis analyzer for ImageJ - A comparative morphometric analysis of "Endothelial Tube Formation Assay" and "Fibrin Bead Assay.". Sci Rep. 10 (1), 1-13 (2020).
  12. Arderiu, G., Peña, E., Aledo, R., Badimon, L. Tissue factor-Akt signaling triggers microvessel formation. J Thrombosis Haemostasis. 10 (9), 1895-1905 (2012).
  13. Leung, K. W., et al. Ginsenoside Rb1 inhibits tube-like structure formation of endothelial cells by regulating pigment epithelium-derived factor through the oestrogen β receptor. British J Pharmacol. 152 (2), 207-215 (2007).
  14. Xue, L., Greisler, H. P. Angiogenic effect of fibroblast growth factor-1 and vascular endothelial growth factor and their synergism in a novel in vitro quantitative fibrin-based 3-dimensional angiogenesis system. Surgery. 132 (2), 259-267 (2002).
  15. Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Asp Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
  16. Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition ancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
  17. Kolesnichenko, O. A., et al. Endothelial progenitor cells derived from embryonic stem cells prevent alveolar simplification in a murine model of bronchopulmonary dysplasia. Front Cell Dev Biol. 11, 1209518 (2023).
  18. Gutiérrez, J., et al. Preeclampsia associates with RECK-dependent decrease in human trophoblasts migration and invasion. Placenta. 59, 19-29 (2017).
  19. Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. In vitro models of angiogenesis. World J Surg. 31 (4), 654-663 (2007).
  20. Rand, M. D., et al. Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric Notch receptors. Mol Cell Biol. 20 (5), 1825-1835 (2000).

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