Recuperação de células trofoblásticas do ensaio de formação de tubos de angiogênese para análise de expressão de marcadores de diferenciação

Resumo

O presente protocolo permite a recuperação de estruturas semelhantes a tubos formadas no ensaio clássico de formação de tubos de angiogênese in vitro , onde células, como células trofoblásticas, se organizam em estruturas semelhantes a capilares sobre uma camada de matriz de membrana basal extracelular. As estruturas recuperadas são usadas para isolamento de RNA e proteínas para várias análises bioquímicas.

Resumo

Durante o desenvolvimento da placenta, as células do trofoblasto extraviloso (EVT) invadem a decídua materna para remodelar as artérias espirais uterinas por um processo de transição mesenquimal para endotelial. Tradicionalmente, esse processo é avaliado por um ensaio de formação de tubos in vitro , onde as células se organizam em estruturas semelhantes a tubos quando semeadas sobre uma preparação de membrana basal polimerizada. Embora várias características estruturais possam ser medidas em fotomicrografias das estruturas, para avaliar o real comprometimento do EVT com o fenótipo do tipo endotelial, é necessária a análise bioquímica dos extratos celulares. Raspar as células da placa de cultura para obter extratos de RNA e / ou proteínas não é uma alternativa, uma vez que as estruturas semelhantes a tubos são severamente contaminadas pela maior parte das proteínas da membrana basal polimerizada. Assim, é necessária uma estratégia para separar as células das proteínas da membrana basal antes da preparação dos extratos celulares. Aqui, é apresentado um método simples, rápido e econômico para recuperar as estruturas semelhantes a tubos do ensaio de formação de tubos in vitro e a análise subsequente por técnicas bioquímicas. Estruturas semelhantes a tubos formadas por células HTR8 / SVneo, uma linhagem celular EVT, foram liberadas da membrana basal polimerizada por uma incubação curta com PBS suplementado com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Após lavagens em série, um pellet pronto para uso de estruturas semelhantes a tubos purificados pode ser obtido. Este pellet pode ser posteriormente processado para obter extratos de RNA e proteínas. A análise de qPCR evidenciou a expressão induzida de VE-caderina e alfa_v-integrina, dois marcadores de células endoteliais, em estruturas tubulares derivadas de EVT em comparação com células controle, o que foi consistente com a indução do marcador de células endoteliais, CD31, avaliado por imunofluorescência. A análise de Western blot dos extratos proteicos das estruturas semelhantes a tubos revelou a superexpressão de RECK em células HTR8 / SVneo transfectadas. Assim, este método simples permite obter extratos celulares do ensaio de formação de tubos in vitro para a análise subsequente de RNAs e expressão proteica.

Introdução

O sucesso de uma gravidez depende do desenvolvimento adequado da placenta e do estabelecimento da circulação placentária. Um dos principais eventos associados a esse processo é a remodelação das artérias espirais uterinas (uSA)¹, de um vaso sanguíneo de alta resistência e baixo fluxo para um vaso sanguíneo de baixa resistência e alto fluxo, aumentando a perfusão de sangue materno na placenta².

A remodelação da uSA é alcançada por células trofoblásticas especializadas derivadas do blastocisto. Após a implantação do embrião, o trofoblasto extraviloso fetal (EVTs) migra do local de implantação através da decídua materna e do útero em direção à uSA³. Uma vez lá, os EVTs induzem a migração e apoptose das células musculares lisas associadas aos vasos maternos (VSMC) e células endoteliais (EC)⁴. Posteriormente, os EVTs adquirem um fenótipo semelhante ao endotélio por meio de uma transição mesenquimal para endotelial (MELT)^5,6, substituindo o VSMC e o EC do^vaso7.

A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome específica da gravidez caracterizada pelo aparecimento de hipertensão materna, acompanhada de proteinúria e/ou outros sintomas de disfunção de órgãos-alvo maternos, determinados a partir da^20ª semana de gestação⁸. Embora a etiologia precisa da PE não seja totalmente compreendida, a hipótese mais aceita refere-se a um remodelamento defeituoso da uSA⁹, gerando um estado permanente de fluxo sanguíneo insuficiente para a placenta, acompanhado de dano placentário por isquemia-reperfusão, hipóxia e estresse oxidativo, ativando a liberação de fatores placentários para a circulação materna, desencadeando os sintomas maternos característicos da PE⁹. Assim, é fundamental determinar os principais mecanismos celulares e moleculares envolvidos na remodelação da uSA por células trofoblásticas.

A avaliação do MELT de EVTs é classicamente alcançada pelo ensaio de formação de tubos de matriz de membrana basal in vitro ¹⁰, pelo qual células individuais migram e se organizam em estruturas bidimensionais que se assemelham a vasos sanguíneos. Este protocolo requer a semeadura de linhagens celulares de EVTs em uma fina camada de matriz extracelular polimerizada, geralmente, chamada de matriz de membrana basal, que é uma matriz extracelular disponível comercialmente composta por uma membrana basal solubilizada extraída do sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm, enriquecida por Laminina, bem como Colágeno IV, proteoglicanos de sulfato de heparano e entactina/nidogênio¹⁰. A análise das estruturas tubulares formadas geralmente é realizada pela identificação de características estabelecidas em fotomicrografias (por exemplo, número de ramos ou índice de malha) e a quantificação destas pelo software ImageJ (plug-in do analisador de angiogênese)¹¹. Embora esse método seja amplamente utilizado para descrever a formação das estruturas tubulares 12,13,14, eles se limitam à caracterização da organização das células, uma vez que não é possível coletar essas estruturas para análise bioquímica 12,13,14, em grande parte devido à impossibilidade de separar as células/tubos da matriz da membrana basal, que contém grande quantidade de diferentes proteínas. Assim, não é possível determinar a real contribuição das proteínas derivadas de células, o que é necessário para entender corretamente a expressão das proteínas celulares. Como a maioria das proteínas nesses extratos viria da matriz da membrana basal, a representação das proteínas celulares acaba sendo muito baixa, portanto, uma grande quantidade de proteínas deve ser carregada em um gel de página SDS para análise por Western blot, afetando a resolução e transferência das proteínas. Tornando a análise adequada quase impossível. Esse excesso de proteínas derivadas da matriz da membrana basal também afeta profundamente a extração de RNA com a pureza necessária para análises posteriores.

Neste relatório, descrevemos um método simples, rápido e econômico, baseado no tratamento com PBS-EDTA, que permite a liberação de estruturas semelhantes a tubos da matriz da membrana basal que podem ser processadas para análise bioquímica de extratos celulares. Este método produz grandes quantidades de biomoléculas, RNA e proteínas, e é compatível com a análise bioquímica clássica, qPCR e Western blot. Propomos que essa estratégia possa ser aplicável a outros ensaios, como fracionamento subcelular, determinação de marcadores epigenéticos por pirosequenciamento ou ensaios de precipitação imune à cromatina. Em resumo, o protocolo consiste na incubação das estruturas tubulares na placa de cultura com PBS suplementado com 50 mM de EDTA a 4 °C para dissolver a matriz da membrana basal. Por esta simples incubação, as estruturas tubulares permanecem em suspensão, que após uma série de lavagens com PBS para eliminar o EDTA e o excesso de matriz de membrana basal diluída, pode ser obtida como um pellet pronto para uso de estruturas tubulares e/ou células individuais. As seções subsequentes descrevem os protocolos para o ensaio MELT e a recuperação de estruturas semelhantes a tubos.

Protocolo

1. Preparação para o ensaio

NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas em condições estéreis. Todos os materiais plásticos devem ser estéreis e novos. Os frascos de vidro devem ser esterilizados em autoclavagem. Todos os materiais devem ser esterilizados com solução de etanol a 70% antes de serem usados no gabinete de fluxo laminar. O meio mínimo de cultura celular (RPMI) deve ser esterilizado por filtração com filtro de 0,22 μM antes da suplementação com soro fetal bovino (SFB). Sempre use equipamento de proteção individual ao trabalhar com resíduos de risco biológico (jaleco, luvas, cabelos compridos amarrados para trás, etc.).

1. Prepare o meio RPMI-1640 (5% de meio de crescimento completo FBS) adicionando RPMI 1640 e FBS esterilizados em um frasco de vidro estéril no gabinete de fluxo laminar. Para solução de FBS a 5%, adicione 190 mL de RPMI-1640 e 10 mL de FBS. Aqueça o RPMI-1640 Media-5% FBS em banho-maria com temperatura controlada a 37 °C.
2. Prepare a matriz da membrana basal da seguinte forma. Descongele lentamente a matriz da membrana basal colocando a garrafa a 4 °C por 3 a 4 h e resfrie o prato MW-6 a -20 °C, por 1 h antes do uso. Depois de descongelado, mantenha a matriz da membrana basal no gelo. No gabinete de fluxo laminar, diluir a matriz da membrana basal a 70% com RPMI1640 gelada sem FBS.
   NOTA: A matriz da membrana basal deve ser armazenada a -80 °C até o uso. Após o descongelamento, tudo deve ser trabalhado a 4 °C para evitar a polimerização prematura da matriz.
3. Preparar o PBS-EDTA dissolvendo a quantidade adequada de EDTA no PBS para atingir uma concentração final de 50 mM de EDTA. Manter o PBS-EDTA a 4 °C.

2. Ensaio de formação de tubos

1. Adicionar 60 μL/^cm2 da matriz da membrana basal diluída, conforme indicado no passo 1.2. para os pratos. Evite bolhas, que interferem na microfotografia necessária para a quantificação das estruturas tubulares.
   NOTA: No caso de um multipoço-6 (MW6, com uma área de 9,6 cm²) o volume é de 580 μL de matriz de membrana basal -70%.
2. Transfira os pratos com matriz de membrana basal para uma incubadora de células (5% CO₂ e 37 ° C) por 2 h para promover a polimerização da matriz da membrana basal.
   NOTA: Durante a última 1 h de polimerização, prepare a suspensão celular das células que serão utilizadas para o ensaio, com o objetivo de completar as 2 h de polimerização quando as células estiverem prontas para serem semeadas.
3. Semear 80.000 células/^cm2 de HTR8/SVneo (linhagem celular EVTs) diluída em 2 mL de RPMI-1640-5% FBS sobre a matriz da membrana basal polimerizada e também sobre as placas não revestidas como controle. Semeie cuidadosamente as células ao longo da parede do poço para evitar a destruição da matriz da membrana basal.
   NOTA: Obtenha uma distribuição celular homogênea sobre o Matrigel, caso contrário, os tubos não se formarão em áreas onde há menos células ou onde as células estão superlotadas.
4. Transfira as células semeadas para a incubadora de células e cultive por 12 h, 24 h e 48 h a 5% de CO₂ e 37 ° C.
   NOTA: Normalmente, 24 h é suficiente para analisar a estrutura tubular, no entanto, se for necessária a expressão de proteína cinética ou RNA durante este processo, incubar as células por: 3 h, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h.

3. Recuperação celular da matriz da membrana basal

1. Uma vez atingido o tempo de incubação selecionado (por exemplo, 12 h, 24 h, 48 h), recupere o meio condicionado para realizar a medição de escolha nele.
2. Lave suavemente as células com 1x PBS gelado, pelo menos 3x para eliminar os detritos celulares. Se forem necessárias microfotografias, despeje 1 mL de PBS frio em cada poço e tire fotos em 10 minutos.
3. Remova o PBS e adicione 700 μL de PBS-EDTA a cada poço e incube a placa no gelo por 3-5 min.
   NOTA: O PBS-EDTA dissolverá a matriz da membrana basal, de modo que toda a rede celular permanecerá em suspensão.
4. Recupere suavemente a suspensão da rede tubular com uma micropipeta (p1.000) em um tubo de 1,5 mL.
5. Centrifugar a suspensão a 1.000 x g durante 10 min a 4 °C. No final, uma pelota branca de células deve ser visível.
6. Elimine o sobrenadante por inversão do tubo, tentando deixá-lo o mais seco possível.
7. Adicione 1 ml de PBS a 4 °C e ressuspenda suavemente o sedimento celular com uma micropipeta p.1000 para lavar as células e remover a matriz da membrana basal dissolvida e o EDTA. Repita pelo menos 2x.
   NOTA: Essas etapas de lavagem são críticas. A matriz da membrana basal restante pode ser observada como uma camada viscosa sobre o pellet celular. Repita as lavagens até que a maior parte da camada da matriz da membrana basal seja eliminada.
8. Após a lavagem final, use o pellet celular diretamente para extração de proteínas ou RNA. Alternativamente, ressuspenda o pellet em 1 mL do PBS e distribua em diferentes tubos, dependendo dos requisitos: por exemplo, 300 μL para extração de RNA e os 700 μL restantes para extração de proteínas, etc.
9. Centrifugue os tubos a 1.000 x g por 10 min a 4 ° C para obter o pellet da célula.
   NOTA: A divisão da suspensão celular em PBS pode estar na proporção desejada, por exemplo, 1:1, 1:2 ou 1:3 para RNA:proteína. Aqui, uma proporção de 1:2 RNA:proteínas é usada. Neste ponto, armazene os pellets celulares, se não forem imediatamente necessários, o mais seco possível, a -80 °C até um mês.

Resultados

Para avaliar o protocolo descrito neste relatório, primeiro geramos as estruturas tubulares. Conforme mostrado na Figura 1A, as células HTR8 / SVneo (EVT) geraram estruturas semelhantes a tubos em 12 h, 24 h e 48 h de incubação sobre a matriz da membrana basal. Não foram observadas estruturas tubulares nas placas de controle onde HTR8/SVneo foram semeados em plástico no intervalo de tempo ensaiado. Após a aquisição da fotomicrografia, vários parâm...

Discussão

O ensaio de formação tube-like é uma ferramenta amplamente utilizada para avaliar a interação entre células em processos angiogênicos¹⁹. Aqui descrevemos as propriedades angiogênicas de células não endoteliais, como os EVTs, na remodelação de vasos uterinos vasculares, um evento crítico durante a placentação⁶. Embora a formação em forma de tubo seja muito informativa sobre a interação entre as células, é necessária uma...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Dishes laboratory (100mm)	Nest	704201
Cell Culure 6-Plate	Nest	0917A
Cell Culure Microscope	Olympus	CKX53SF
Centrifuge	Thermo Scientific	Mega Fuge 8R
Circular Analog Magnetic Hotplate Stirrer	SCI Logex	MS-H-S
CO2 Incubator	Thermo Scientific	HERA cell Vios 160i
Cultrex PathClear Basement Membrane Extract (2 x 5 mL)	R&D SYSTEMS	RD.3432-010-01
Dry Heat Incubators	HES	MK 200-1
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Winkler	BM-0680
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated	Capricorn Scientific	FBS-HI-12A
Freezer Vertical	DEAWOO	FF-211VSM
HTR8/SVneo	ATCC	CRL-3271
Laboratory bench rocker	TCL	S2025
Laminar flow cabinet	BIOBASE	BSC-1300
Luminescent Image Analyzer	Health Care	Image Quant LAS 500
Matrigel Matrix Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free 10 ml	R&D SYSTEMS	356231
Micro Centrifuge	SCI Logex	D1008
Micropipete Lambda Plus, P10	Corning	4071
Micropipete Lambda Plus, P1000	Corning	4075
Micropipete Lambda Plus, P2	Corning	4070
Micropipete Lambda Plus, P20	Corning	4072
Micropipete Lambda Plus, P200	Corning	4074
Microscope Camera-Set	MOTIC	Moticam 2300
Pen-strep-amphot b/Antim	Biological Industries	03-029-1B
pHmeter	HANNA	HI2221
Phophate Buffer Saline 10X (PBS10X)	Corning	46-013-CM
Pippete micro tip with filter, sterile, P10	Jetbiofil	PMT231010
Pippete micro tip with filter, sterile, P1000	Jetbiofil	PMT252000
Pippete micro tip with filter, sterile, P200	Jetbiofil	PMT231200
PowerPac	BIO-RAD	E0203
Radwag	TCL	WTB 200
Remote water Purification System	Millipore	Direct-Q 5 UV
RPMI 1640 Medium, powder	Gibco	31800-022
Thermal Cycler	Bioer Technology	TC-96/G/H(b)C
Thermoregulated bath	Thermo Scientific	TSGP10
Trypsin EDTA 10X	Capricorn Scientific	TRY-1B10
Ultrasonic Processors	SONICS	VCX130PB
Vacuum Pump	HES	ROCKER 300
Vortex Mixer	Thermo Scientific	LP Vortex Mixer