マーモセットの卵巣周期の病期を決定するための採血とホルモン測定

要約

このプロトコルは、プロゲステロン/エストラジオールおよび絨毛性ゴナドトロピンのレベルを測定して卵巣周期の段階を決定するための血液および尿のサンプリングについて説明します。ホルモンレベルは排卵のタイミングを予測および決定するために使用され、ホルモンは卵巣周期と卵子の成長を調節するために注射されます。

要約

一般的なマーモセットは小さな新世界のサルです。マーモセットの生物学的メカニズムの多くはヒトと似ているため、マーモセットは神経科学、再生医療、開発など、さまざまな分野の医学研究やヒト生物学の研究に役立つ可能性があります。しかし、多くの基本的な実験や手順の方法を説明する文献は不足しています。ここでは、マーモセット中の性ホルモン(プロゲステロン、エストラジオール、および絨毛性ゴナドトロピン)のレベルを決定するための詳細な方法について説明します。これらのホルモンの測定により、マーモセットでは通常26〜30日である卵巣周期の段階を予測できます。正確な測定は、正しい時点で卵子/受精卵を捕獲し、遺伝子組み換えマーモセットを生成するための宿主雌の準備に不可欠です。

さらに、性ホルモンレベルの測定は、内分泌学、動物行動学、初期発生、および生殖生物学の研究に役立ちます。このプロトコルは、大腿静脈からの採血、ホルモン測定のための血漿の分離、尿と血漿を使用した絨毛性ゴナドトロピンレベルの測定、プロスタグランジンF2αアナログの注射を使用して卵巣周期をリセットして周期を短縮し同期する方法、および卵胞刺激ホルモンと絨毛性ゴナドトロピンを注射することにより卵胞の成長と排卵を促進する方法の詳細な説明を提供します。これらのプロトコルを使用して、卵子/受精卵のタイムリーな収集のために卵巣周期の段階を決定できます。

概要

一般的なマーモセット(Callithrix jacchus)は、人間と同様の多くの特徴を持つ小さな新世界サルであり、その卵巣周期の期間は26-30日^です1,2。遺伝子組み換えマーモセットの初期発生と生成に関する研究では、卵巣周期の特定の段階で卵子と受精卵を採取する必要があります。したがって、病期の正確な決定は非常に重要であり、ホルモンのプロゲステロン(P4)とエストラジオール(E2)^2,3の血中濃度を測定することによって推定できます。これらのホルモンは、着床に必要な子宮内膜の成長を促進します。P4は黄体から産生され、黄体は排卵直後に卵巣に形成されます。E2は、脳の視床下部-下垂体複合体からの卵胞刺激ホルモン(FSH)に応答して卵巣卵胞から分泌されます。E2レベルは、卵胞が成熟するにつれて増加し、排卵前にピークに達します³。E2レベルが高いと、ヒトでは視床下部-下垂体複合体を介して黄体形成ホルモン(LH)がパルス放出されます。このLHサージは排卵を誘発します。しかし、マーモセットでは、LH遺伝子は進化の過程で変性し、代わりにLHと同様の構造を持つ絨毛性....

プロトコル

マーモセットを用いたすべての方法は、高い倫理観と福祉基準を活用し、国立成育医療研究センターの動物施設管理委員会によって承認されました。ここで使用された動物は、1日あたり12時間の光で、シングルハウスまたはペアハウス(雌1匹と雄1匹)でした。

1.大腿静脈の採血

1. 1mLのシリンジ(ショートタイプが使いやすい)を用意し、25Gの針をブレード面を上にして取り付けます。血液の詰まりを防ぐため、200 μLの原液ヘパリンナトリウム溶液をシリンジに引き込んでシリンジをヘパリン化します。シリンジを数回上下に引っ張って、シリンジの内側を均等にコーティングします。次に、シリンジからヘパリン溶液を排出します。
   注:新しいシリンジへの交換がしばしば必要になるため、いくつかの追加のヘパリン添加シリンジを準備します。
2. 吸収性の綿棒とアルコール綿棒を準備します。調整可能なランプのスイッチを入れて、採血のためにマーモセットが置かれる領域を照らします。
3. 市販の拘束装置(420 x 85 x 85 mm、 図1A)を準備します(詳細については 、資料の表 を参照)。マーモセットを装置にセットするには、マーモセットを固定するスポンジベルトで保持部を開きま....

結果

本研究で使用した動物に関する詳細は 、表1に示す。

大腿静脈の解剖学的分析
大腿静脈の解剖学的分析は、安楽死中の2歳のオスのコモンマーモセット(I 7713M)を使用して行われました。大腿静脈と動脈は大腿骨の三角形にあります。大腿骨三角形は、腹壁と大腿筋の境界に形成されます(図1B-D

ディスカッション

静脈の位置を特定することは、採血の最も重要なステップです。解剖学的観察に基づいて、このプロトコルは、マーモセットの採血の容易な場所として大腿骨三角形の近位領域を導入します。このエリアを利用することで、大静脈からの採血が容易に行えます。しかし、このプロトコルを使用しても、動脈の損傷が発生することがあります。動脈を損傷した場合、血.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIA-360	Tosoh Corporation	0019945	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020956	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET II	Tosoh Corporation	0020968	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020955	Hormone measurement (P4/E2)
CMS-1	CLEA Japan		Marmoset food
Estrumate	MSD Animal Health		PGF2alpha analog (cloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150	Merck Biopharma Co., Ltd.		FSH
Gonatropin for intramuscular injection 1000	ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.	872413	hCG
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL	Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.	224122458	Blood collection
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker)	CLEA Japan, Inc.		Determining CG level
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD	SHIOKAZE GIKEN		Desk lamp for blood collection
Marmoset blood collection restraint device	JIC Japan	JM-1006	Blood collection http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05%	Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.		Hematoma treatment
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag	Globe Scientific	110913	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2	Tosoh Corporation	0025224	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025324	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025524	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII	Tosoh Corporation	0025240	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025340	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025540	Hormone measurement (P4/E2)
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle	TERUMO	SS-01T2525	Blood collection
Tensolvet 5.000 I.E. gel.	Dechra Pharmaceuticals	14033492	Hematoma treatment
TOSOH MULTI-CONTROL SET	Tosoh Corporation	0015965	Hormone measurement (P4/E2)