Blutentnahme und Hormonmessung zur Bestimmung des Stadiums im Eierstockzyklus bei Weißbüschelaffen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Blut- und Urinproben zur Messung des Progesteron-/Östradiol- und Choriongonadotropinspiegels zur Bestimmung des Stadiums des Eierstockzyklus. Der Hormonspiegel wird verwendet, um den Zeitpunkt des Eisprungs vorherzusagen und zu bestimmen, und Hormone werden injiziert, um den Eierstockzyklus und das Eizellwachstum zu regulieren.

Zusammenfassung

Weißbüschelaffen sind kleine Neuweltaffen. Da viele ihrer biologischen Mechanismen denen des Menschen ähneln, sind Weißbüschelaffen potenziell nützlich für die medizinische und humanbiologische Forschung in einer Reihe von Bereichen, wie z. B. Neurowissenschaften, regenerative Medizin und Entwicklung. Es fehlt jedoch an Literatur, die Methoden für viele grundlegende Experimente und Verfahren beschreibt. Im Folgenden werden detaillierte Methoden zur Bestimmung des Spiegels von Sexualhormonen (Progesteron, Östradiol und Choriongonadotropin) bei Weißbüschelaffen beschrieben. Die Messung dieser Hormone ermöglicht die Vorhersage des Stadiums im Eierstockzyklus, das bei Weißbüschelaffen typischerweise 26-30 Tage beträgt; Eine genaue Bestimmung ist unerlässlich für die Entnahme von Eizellen/Zygoten zum richtigen Zeitpunkt und für die Vorbereitung der Wirtsweibchen auf die Erzeugung von gentechnisch veränderten Weißbüschelaffen.

Darüber hinaus ist die Messung des Sexualhormonspiegels nützlich für endokrinologische und ethlogische, frühe Entwicklungs- und reproduktionsbiologische Studien. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Verfahren zur Blutentnahme aus der Oberschenkelvene, zur Trennung von Plasma zur Hormonmessung, zur Messung des Choriongonadotropinspiegels mittels Urin und Plasma, zum Zurücksetzen des Eierstockzyklus durch Injektion eines Prostaglandin-F2α-Analogons zur Verkürzung und Synchronisierung des Zyklus und zur Förderung des Follikelwachstums und des Eisprungs durch Injektion von follikelstimulierendem Hormon und Choriongonadotropin. Mit Hilfe dieser Protokolle können die Stadien des Eierstockzyklus für die rechtzeitige Entnahme von Eizellen/Zygoten bestimmt werden.

Einleitung

Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) ist ein kleiner Neuweltaffe mit vielen ähnlichen Merkmalen wie der Mensch, und die Dauer seines Eierstockzyklus beträgt 26-30 Tage ^1,2. Studien über die frühe Entwicklung und die Erzeugung von gentechnisch veränderten Weißbüschelaffen erfordern die Entnahme von Eizellen und Zygoten in bestimmten Stadien des Eierstockzyklus. Daher ist eine genaue Bestimmung des Stadiums von entscheidender Bedeutung und kann durch Messung der Blutspiegel der Hormone Progesteron (P4) und Östradiol (E2)^2,3 abgeschätzt werden. Diese Hormone fördern das Wachstum der Gebärmutterschleimhaut, das für die Einnistung notwendig ist. P4 wird aus dem Gelbkörper hergestellt, der sich unmittelbar nach dem Eisprung in den Eierstöcken bildet. E2 wird von den Eierstockfollikeln als Reaktion auf das follikelstimulierende Hormon (FSH) aus dem Hypothalamus-Hypophysen-Komplex im Gehirn sezerniert. Der E2-Spiegel steigt mit zunehmender Reife des Follikels an und erreicht vor dem Eisprung^{seinen Höhepunkt 3}. Hohe E2-Spiegel verursachen beim Menschen die pulsierende Freisetzung des luteinisierenden Hormons (LH) über den Hypothalamus-Hypophysen-Komplex; Dieser LH-Anstieg induziert den Eisprung. Bei Weißbüschelaffen erfuhr das LH-Gen jedoch im Laufe der Evolution eine Degeneration, und der Eisprung wird stattdessen durch die Freisetzung von Choriongonadotropin (CG) aus der Hypophyse induziert, das eine ähnliche Struktur wie LH hat ^4,5.

Der Eierstockzyklus kann durch Hormoninjektionen gesteuert werden. FSH-Injektionen wirken beim Menschen auf die FSH-Rezeptoren der Eierstöcke und werden zur Förderung der Östrogensynthese und des Follikelwachstums eingesetzt⁶. Die Injektion von humanem CG (hCG) als Ersatz für LH am Ende der Follikelphase wird verwendet, um den Eisprung beim Menschen zu stimulieren⁷. CG-Injektionen werden auch zur Behandlung von menschlicher Unfruchtbarkeit eingesetzt, da CG das Corpus luteum in der Frühschwangerschaft stimuliert, was zu einer erhöhten P4-Produktion führt. Prostaglandin F2α (PGF2α) Injektionen setzen den Eierstockzyklus zurück⁸. Bei Hausrindern wird die PGF2α-Injektion verwendet, um die Lutealphase zu verkürzen und den Brunstzyklus für das Reproduktionsmanagement zu synchronisieren.

Obwohl Weißbüschelaffen und Menschen ähnliche biologische Mechanismen haben und damit ideale Modelltiere sind, fehlt es an Literatur, die grundlegende Methoden für viele häufig verwendete Techniken beschreibt. Die Blutentnahme ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken 9,10,11,12. Anfänger haben jedoch manchmal Schwierigkeiten, die Vene zu finden. Daher wurden in dieser Studie anatomische Analysen der Venenregion femoralis durchgeführt. Basierend auf anatomischen Beobachtungen führt dieses Protokoll die proximale Region des Femurdreiecks als eine einfache Stelle für die Venenpunktion ein.

Protokoll

Alle Methoden, bei denen Weißbüschelaffen eingesetzt werden, basieren auf hohen ethischen und tierschutzrechtlichen Standards und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des National Center for Child Health and Development genehmigt. Die Tiere, die hier eingesetzt wurden, waren Einzel- oder Paarställe (ein Weibchen und ein Männchen) mit 12 Stunden Licht pro Tag.

1. Blutentnahme der Oberschenkelvene

1. Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze vor (der kurze Typ ist einfach zu verwenden) mit einer 25-G-Nadel, die mit der Klinge nach oben befestigt ist. Um Blutverstopfungen zu vermeiden, heparinisieren Sie die Spritze, indem Sie 200 μl unverdünnte Heparinnatriumlösung in die Spritze ziehen. Beschichten Sie die Innenseite der Spritze gleichmäßig, indem Sie sie mehrmals auf und ab ziehen; Stoßen Sie dann die Heparinlösung aus der Spritze aus.
   HINWEIS: Da der Wechsel auf eine neue Spritze oft notwendig ist, bereiten Sie einige zusätzliche heparinisierte Spritzen vor.
2. Bereiten Sie saugfähige Watte- und Alkoholtupfer vor. Schalten Sie eine verstellbare Lampe ein, um den Bereich zu beleuchten, in den der Weißbüschelaffe für die Blutentnahme gesetzt wird.
3. Bereiten Sie die Rückhaltevorrichtung (420 x 85 x 85 mm, Bild 1A) vor, die im Handel erhältlich ist (siehe Materialtabelle für Details). Um einen Weißbüschelaffen in das Gerät zu setzen, öffnen Sie das Retentionsteil mit dem Schwammgurt, der die Weißbüschelaffen sichert. Setzen Sie den Weißbüschelaffen mit der Vorderseite nach oben in die Rückhaltevorrichtung ein.
   HINWEIS: Weißbüschelaffen sind in der Regel ruhig in Rückhaltevorrichtungen, was die Notwendigkeit einer Rückhaltegewöhnung oder eines Trainings zunichte machen kann.
4. Fangen Sie den Weißbüschelaffen; Setzen Sie den Weißbüschelaffen in den zylindrischen Teil ein; und sichern Sie es, indem Sie den Schwammgurt nach unten drücken. Legen Sie das Bein, von dem Blut entnommen werden soll, auf das andere (Abbildung 1A). Halten Sie die Beine mit der nicht dominanten Hand; Lege den Mittel- und Ringfinger in jedes Bein, um sie zu befestigen, und die anderen Finger außerhalb jedes Beins, um sie zu fixieren.
   HINWEIS: Beim Fangen von Weißbüschelaffen werden Beißhandschuhe empfohlen. Wenn keine Rückhaltevorrichtung vorhanden ist, führen Sie die Blutentnahme unter Narkose oder mit einer anderen Person durch, die den Weißbüschelaffen festhält.
5. Prüfen Sie, ob die Oberschenkelvene in der Nähe der Basis des Oberschenkels sichtbar ist. Wenn nicht, tasten Sie ab, um die pulsierende Arterie zu finden, und verwenden Sie sie als Orientierungspunkt, um zu überprüfen, ob die Vene in ihr verläuft (Abbildung 1B-D).
   HINWEIS: Schreibtischbeleuchtung und Haarrasur werden empfohlen, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Die Sichtbarkeit kann auch durch Reiben mit Alkoholtupfern verbessert werden. Lymphknoten im Dreieck befinden sich oft in der Nähe der Vene und zeigen eine dunkelblaue Farbe als Vene. Wie man sie unterscheidet, wird im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse beschrieben.
6. Desinfizieren Sie die Einstichstelle mit einem Alkoholtupfer. Führen Sie die Nadelklinge mit der Klingenseite nach oben in einem Winkel von 15°-20° ein. Um zu verhindern, dass die Nadel bei der Blutentnahme aus dem Blutgefäß rutscht, stabilisieren Sie die Hand, die die Spritze hält, indem Sie sie zum anderen auflegen.
7. Ziehen Sie den Kolben vorsichtig zurück, um Unterdruck auszuüben (Abbildung 1E). Schiebe die Nadelspitze nach vorne. Sobald das Blut in die Spritze gelangt ist, halten Sie die Position der Nadelspitze aufrecht, bis das erforderliche Volumen (500-700 μl) entnommen wurde.
   1. Wenn kein Blut in die Spritze eindringt, wechseln Sie die Einstichstelle. Wenn beim Herausziehen der Nadel Blut austritt, stoppen Sie die Blutung, indem Sie 3 Minuten lang Druck auf die Einstichstelle ausüben. Nachdem Sie die Blutung gestoppt haben, starten Sie die Venenpunktion neu.
   2. Wenn das Blut, das in die Spritze gezogen wird, während des Entnahmevorgangs nicht mehr fließt, schieben Sie die Nadelspitze langsam nach vorne und ziehen Sie sie dann zurück, um das Blutgefäß zu finden. Dadurch kann der Blutfluss in die Spritze wiederhergestellt werden. Wenn nicht, ziehen Sie die Nadel heraus und führen Sie eine Venenpunktion mit einer neuen Spritze durch.
      HINWEIS: Verwenden Sie den Oberschenkel am anderen Bein, wenn es schwierig ist, Blut von derselben Seite zu sammeln.
8. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig heraus und drücken Sie mit dem kleinen Finger leicht auf die Einstichstelle. Üben Sie dann mit einem saugfähigen Wattestäbchen sofort 3 Minuten lang Druck auf die Einstichstelle aus, um die Blutung zu stoppen. Drehen Sie die Spritze um, um Blut und Heparin zu mischen.
   HINWEIS: Üben Sie während des Abkühlens einen längeren Zeitraum (5 Minuten) Druck aus, wenn arterielles Blut entnommen wird, und bestätigen Sie sorgfältig das Nachlassen der Blutung, um die Bildung von Hämatomen zu verhindern, die manchmal zu einem tödlichen Ausgang führen können.
9. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Blutung aufgehört hat, entfernen Sie den Schwammgurt, halten Sie die Taille des Tieres mit einer Hand fest und drehen Sie das Tier so, dass man den Unterarm des Tieres mit einer anderen Hand von hinten halten kann.
10. Setze den Weißbüschelaffen in seinen Käfig zurück. Um Stress abzubauen und wiederholte Blutabnahmen zu erleichtern, versorgen Sie den Weißbüschelaffen mit seiner Lieblingsnahrung (z. B. Kekse, Marshmallows oder Biskuitkuchen). Überprüfen Sie gelegentlich das Auftreten von Hämatomen.
    HINWEIS: Wenn ein Hämatom in einem frühen Stadium festgestellt wird, legen Sie einen Druckverband an, um das Fortschreiten des Hämatoms zu verhindern. Wenn es nach längerer Zeit gefunden wird, kann eine chirurgische Entfernung des Hämatoms mit Ligatur der Oberschenkelarterie und Bluttransfusion erforderlich sein ^9,13.
11. Lösen Sie die Nadel von der Spritze, um eine Hämolyse zu verhindern. Stoßen Sie dann das gesammelte Blut langsam entlang der Innenwand eines 1,5-ml-Mikroröhrchens aus.
    HINWEIS: Das entnommene Blut kann bis zu 24 Stunden lang bei 4 ^°C gelagert werden, bevor es zur Messung des P4/E2-Spiegels im Plasma getrennt wird.

2. Abtrennung des Plasmas und Bestimmung des Hormonspiegels

1. Zentrifugieren Sie das Blut in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 1.100 × g für 5 min bei 4 ^°C.
2. Übertragen Sie das abgetrennte Plasma (Überstand) aus dem 1,5-ml-Röhrchen in ein neues Röhrchen/einen neuen Becher, wobei der Einschluss von Blutzellen (Sediment) sorgfältig vermieden wird.
3. Messen Sie die P4- und E2-Werte mit einem ELISA-Kit oder einem automatischen Analysator. Wenn die Plasmamenge für den automatischen Analysator nicht ausreicht, verwenden Sie eine Probenverdünnungslösung.
   HINWEIS: Für die Messung mit einem automatischen Analysator sind >175 μl Plasma erforderlich, um nur einen P4-Gehalt zu bestimmen, und >250 μl Plasma sind erforderlich, um sowohl P4 als auch E2 zu bestimmen.

3. Messung des Schwerpunkts des Urins zur Erkennung von Eisprung und Schwangerschaft

HINWEIS: Der Schwerpunktspiegel bei Weißbüschelaffen kann mit einem immunchromatographischen Kit-Test sowohl für den Eisprung als auch für die Schwangerschaft gemessen werden. Im Falle des Eisprungs kann 0-2 Tage vor dem Eisprung ein positives Ergebnis erzielt werden. Im Falle einer Schwangerschaft wird ein positives Ergebnis vom 15. bis 20. Tag bis etwa zum 100. Tag der Schwangerschaft festgestellt. Für den Test wird eine kleine Menge (90 μl) Urin benötigt (ein Tropfen Urin entspricht ~30 μl).

1. Tray-Methode: Wenn sich mehr als zwei Tiere im selben Käfig befinden, bringen Sie den Ziel-Weißbüschelaffen (oder die anderen Tiere) am Vortag in einen anderen Käfig. Stellen Sie am Abend vor oder vor dem Anzünden ein sauberes Tablett auf den Boden des Käfigs. Der Urin wird während der Nacht nicht aus der Blase abgelassen. Daher wird der Urin in der Regel kurz nach dem Anzünden aus der Blase freigesetzt.
   HINWEIS: Das Betreten des Raumes am Morgen vor der Beleuchtung kann den Schlafzyklus der Kohorte stören. Der Urin kann in der Regel innerhalb von ca. 30 Minuten nach dem Anzünden gesammelt werden.
2. Quetschmethode: Bereiten Sie die gewaschenen Schalen für die Urinsammlung vor. Nachdem Sie die Blase des Weißbüschelaffen lokalisiert haben, drücken Sie sie vorsichtig von vorne und von beiden Seiten mit der gesamten Länge der Finger zusammen (Abbildung 1F). Sammeln Sie Urin, bevor Sie morgens den Raum erhellen.
   HINWEIS: Wenn die Urinsammlung aufgrund des Fehlens von Urin in der Blase nicht erfolgreich ist, warten Sie eine Weile und versuchen Sie es erneut. Achten Sie darauf, keine übermäßige Gewalt anzuwenden, da dies das Tier verletzen kann.
3. Geben Sie die Urinprobe unmittelbar nach der Entnahme in die Vertiefung des immunchromatographischen Testkits. Lesen Sie das Ergebnis nach 10 Minuten gemäß den Anweisungen des Herstellers ab.

4. Kontrolle und Bestimmung des Stadiums des Eierstockzyklus für die Entnahme von Eizellen, Zygoten und Embryonen

1. Keimvesikel (GV) Eizellentnahme aus den Eierstöcken
   1. Verabreichen Sie eine intramuskuläre Injektion von 3 μl 0,263 mg/ml Cloprostenol (ein synthetisches PGF2α-Analogon), verdünnt in 150 μl Kochsalzlösung¹⁴ (Abbildung 2), um den Eierstockzyklus am Ende der Lutealphase (d. h. ≥10 Tage nach Beginn der Lutealphase) zurückzusetzen.
      HINWEIS: Es kann zweckmäßig sein, die verdünnte Lösung in einem größeren Volumen herzustellen, da das verdünnte Clofrostenol mindestens mehrere Wochen lang bei +4 °C stabil bleibt.
   2. Bestätigen Sie am nächsten Tag (Tag 1) den Beginn der Follikelphase, indem Sie überprüfen, ob der P4-Spiegel gesunken ist.
      HINWEIS: Es wurde berichtet, dass die Cloprostenol-Injektion den P4-Spiegel (normalerweise <10 ng/ml) innerhalb von 24 h drastisch senkt³.
   3. Injizieren Sie ab Tag 1 FSH (25 I.E., intramuskulär) einmal alle 2 Tage für insgesamt 5x (Tage 1, 3, 5, 7 und 9). An Tag 10 injizieren Sie nachmittags hCG (75 IE, intramuskulär).
   4. Entnahme von GVs aus den Eierstöcken am Tag 11 durch follikuläre Aspiration unter Narkose gemäß der Literatur^15,16.
      HINWEIS: Manchmal findet der Eisprung früher als erwartet statt. Daher wird empfohlen, die Schwerpunktwerte ab dem 8. Tag zu überprüfen. Wenn der CG-Test positiv ist, führen Sie an diesem Tag eine GV-Entnahme durch.
2. Entnahme von Metaphase II (MII) Eizellen, Zygoten und frühen Embryonen
   1. Setzen Sie den Eierstockzyklus mit Cloprostenol zurück, wie in Schritt 4.1.1 beschrieben.
   2. Bestätigen Sie am nächsten Tag (Tag 1) den Beginn der Follikelphase, indem Sie überprüfen, ob der P4-Spiegel gesunken ist.
   3. Für die Entnahme von Zygoten und Embryonen halten Sie weibliche Weißbüschelaffen zusammen mit männlichen Weißbüschelaffen zur Paarung ab dem 6. Tag.
   4. Überprüfen Sie ab dem 7. Tag die P4/E2-Spiegel im Blut und die Schwerpunktwerte im Urin der Frauen. Der Nachweis von CG ist ein Hinweis auf den Eisprung innerhalb weniger Tage (in der Regel am nächsten Tag). An dem Tag, an dem die P4-Spiegel ansteigen und die E2-Spiegel im Vergleich zum Vortag sinken, werden MII-Eizellen oder embryonale Tag 0 (E0)-Zygoten aus den Eileitern^{entnommen 17,18}.
   5. Für die Embryonenentnahme, wie in der Literatur beschrieben, führen Sie je nach Zielstadium entweder eine Spülung aus den Eileitern (E1-E3, 1-8 Zellen)^17,18 oder aus der Gebärmutter (E5-E10, 8 Zellen-Blastozyste)19,20,21,22 durch.

Ergebnisse

Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Tieren sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Anatomische Analysen der Vena femoralis
Anatomische Analysen der Oberschenkelvene wurden an einem 2-jährigen männlichen Weißbüschelaffen (I 7713M) durchgeführt, der sich einer Euthanasie unterziehen musste. Die Oberschenkelvenen und Arterien befinden sich im Femurdreieck. Das femorale Dreieck bildet sich an den Grenzen zwischen der B...

Diskussion

Die Lokalisierung der Vene ist der wichtigste Schritt bei der Blutentnahme. Basierend auf anatomischen Beobachtungen führt dieses Protokoll den proximalen Bereich im Femurdreieck als einfache Stelle für die Blutentnahme bei Weißbüschelaffen ein. In diesem Bereich kann problemlos eine Blutentnahme aus einer großen Vene durchgeführt werden. Selbst bei Verwendung dieses Protokolls kommt es jedoch manchmal zu einer Verletzung einer Arterie. Bei einer Verletzung einer Arterie wird empfo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIA-360	Tosoh Corporation	0019945	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020956	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET II	Tosoh Corporation	0020968	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020955	Hormone measurement (P4/E2)
CMS-1	CLEA Japan		Marmoset food
Estrumate	MSD Animal Health		PGF2alpha analog (cloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150	Merck Biopharma Co., Ltd.		FSH
Gonatropin for intramuscular injection 1000	ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.	872413	hCG
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL	Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.	224122458	Blood collection
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker)	CLEA Japan, Inc.		Determining CG level
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD	SHIOKAZE GIKEN		Desk lamp for blood collection
Marmoset blood collection restraint device	JIC Japan	JM-1006	Blood collection http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05%	Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.		Hematoma treatment
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag	Globe Scientific	110913	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2	Tosoh Corporation	0025224	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025324	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025524	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII	Tosoh Corporation	0025240	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025340	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025540	Hormone measurement (P4/E2)
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle	TERUMO	SS-01T2525	Blood collection
Tensolvet 5.000 I.E. gel.	Dechra Pharmaceuticals	14033492	Hematoma treatment
TOSOH MULTI-CONTROL SET	Tosoh Corporation	0015965	Hormone measurement (P4/E2)