偽層状肺気道上皮の毛様体機能と膜不透過性の決定

要約

気液界面培養は、肺気道の頂端側を模倣する初代正常ヒト気管支上皮細胞を分化することにより、偽層状気道上皮を発達させるために一般的に使用されます。ここでは、繊毛機能や膜の完全性などの生物物理学的特性をモニタリングすることにより、その品質を決定するための簡単なプロトコルについて説明します。

要約

気液界面(ALI)で初代肺気道上皮細胞を分化することは、肺気道の頂端側を模倣する多細胞偽層状気道上皮を開発するための一般的な手法です。初代肺気道細胞の分化が期待されますが、毛様体機能や膜不透過性などの生物物理学的特性の評価は、気道上皮の品質評価を提供し、実験の信頼性を確保します。ここでは、ALI培養における多細胞偽層状気道上皮の開発のための簡単なプロトコルについて説明し、2つの重要な生物物理学的特性、すなわち繊毛機能と膜不透過性を評価します。毛様体機能を決定するために、倒立顕微鏡に取り付けられた高速度カメラを使用して4週間の分化した気道上皮の毛様体運動を捉え、続いてSimon Amon Video Analysis(SAVA)システムを使用して毛様体拍動頻度(CBF)を定量化しました。また、ボルトオーム計を使用して経上皮電気抵抗(TEER)を測定し、気道上皮の上皮バリア完全性を決定しました。

概要

喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症などの慢性呼吸器疾患は、世界中の主要な健康問題の一部です¹。また、ヒトインフルエンザA型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型(SARS-CoV-2)などのウイルスによる呼吸器疾患の蔓延も、経済的・公衆衛生上の負担となっています²。したがって、不可逆的な呼吸器組織の損傷につながる呼吸器疾患の治療計画を開発する必要性が非常に高くなっています。気道上皮組織自体は、酸素摂取に関与するだけでなく、侵入する病原体や危険な化学物質から体を保護するためのバリアも提供します³。呼吸器上皮は、繊毛細胞、杯細胞、基底細胞の3つの主要な細胞タイプで構成される複雑な細胞組織を持っています。最近、気道上皮4に新規ではあるがまれなイオン細胞の存在が報告され^{ています。}この複雑な組織は協調して機能し、抗菌ペプチドの分泌、サイトカインの放出による適応免疫応答の活性化、粘液繊毛クリアランス5などの自然免疫応答^{を提供します。}適切な気道モデルがないことは、呼吸器感染症の研究と治療法の開発に対する障害の1つです。

気液界面(ALI)モデルは、呼吸器疾患研究の重要なツールになりつつあります⁶。これは、一次肺気道細胞が、一般的に気道の頂端側に存在する少なくとも3種類の細胞で構成される偽層状気道上皮に分化するため、効果的なin vitro肺気道モデルです。まず、繊毛細胞は気道の頂端側の大部分を覆い、粘液繊毛クリアランスに寄与します。第二に、杯細胞は粘液を産生し、気道の頂端側で毛様体細胞と共存する最大の細胞です。第三に、基底細胞は気道の基底層に存在し、異なる上皮細胞に分化する前駆細胞である^5,7。イオノサイトと房状細胞は気道上皮ではまれですが、毛様体機能と膜透過性にも役割を果たしている可能性があります⁴。この技術は、in vivoの肺環境を模倣しない従来の水中細胞培養とは異なります。ALIは、健康な人、喘息患者、およびCOPDに由来する初代上皮細胞から産生されるため、感染に対する応答や疾患の病態生理学を研究するためのより多様なプラットフォームを提供します。

ALIで開発された培養物の健康評価は、培養細胞の生存率、機能性、および生理学的関連性を確保するためのモニタリングに不可欠な側面です。これにより、ALI培養の完全性、信頼性、再現性に対する信頼性が向上します。以前に発表されたように、私たちのグループは、2つの生物物理学的パラメーターを評価することにより、ALI培養の完全性を評価しています:繊毛拍動頻度(CBF)を定量化することによる繊毛機能と、経上皮電気抵抗(TEER^{)を決定する}ことによる上皮バリアの完全性^6,7,8。粘液繊毛クリアランス(MCC)は、繊毛細胞が運ぶ気道上皮の重要な特徴の1つです。繊毛細胞の表面にある繊毛と呼ばれる特殊な細胞小器官がメタクロナル波で鼓動し、気道上皮の粘膜層に詰まった感染症や吸入粒子の気道を取り除きます。効果的なMCCは、適切な毛様体活動に完全に依存しています⁹。良好なCBFは、健康で無傷の気道上皮を示しています。したがって、ALI培養のためのCBFのモニタリングは、上皮の完全性に関する貴重な洞察を提供します¹⁰。CBFの定量化には、例えば高速ビデオ顕微鏡¹¹や位相分解ドップラー光干渉断層撮影^法12など、複数の方法がありますが、いずれの方法も技術的な専門知識と専門の機器が必要です。このプロトコルでは、分化した気道上皮のCBFを定量化するためのより簡単で技術的な方法を提供します。また、上皮組織の完全性とバリア機能を示す同じ上皮のTEERを定量化する方法についても説明した¹³。

プロトコル

このプロトコルは、バイオセーフティ レベル 2 の層流フード (バイオセーフティ キャビネット) の下で無菌状態で実行する必要があります。すべての培地と溶液は、使用前に37°Cで解凍する必要があります。遠心分離は4°Cで行う必要があります。 実験で使用されるすべての材料は無菌でなければなりません。初代細胞(匿名化ドナー)は、ネブラスカ大学医療センター(UNMC、ネブラスカ州オマハ)のKristina Bailey博士と共同で取得しました。初代細胞は匿名化されたドナーからのものであり、細胞はNIHヒト被験者に該当しません。このセルは、ノースダコタ大学グランドフォークス校とノースダコタ州オマハのUNMCとの間で承認された材料移転契約(MTA)に基づいて取得されました。ここでは、継代した4つのNHBE細胞を使用しました。より高い継代NHBE細胞(継代8まで)も気道上皮に分化することが示されましたが、継代1から4の間で全ゲノム転写プロファイルに明らかな差がないことから、継代4つのNHBE細胞を日常的に使用しています^6,14。

1. 初代細胞培養

注:初代細胞の慎重な取り扱いは非常に重要です。プロトコール全体では、初代細胞の過酷な処理や過度のピペッティングを避ける必要があります。

1. 滅菌血清学的ピペットを使用して、100 mmの組織培養(TC)皿に5 mLのコラーゲンを加えて、皿を事前にコーティングします。TCディッシュをコラーゲンと室温(RT)で20分間インキュベートします。
2. 滅菌血清ピペットを使用して、TCディッシュからコラーゲンを吸引し、2%(v / v)ペニシリン-ストレプトマイシンと1%(v / v)アムホテリシンBを補充した8mLの解凍済み全気道上皮細胞(AEC)培地と交換します(表1)。
3. 1つのバイアル(5 x 10⁵ 細胞を含む)の一次正常ヒト気管支上皮(NHBE)細胞を37°Cの水浴中で解凍します。
4. 5 mLの滅菌血清ピペットを使用して、解凍済みの完全AEC培地1 mLを細胞に滴下してNHBE細胞を順応させ、すべての細胞を滅菌済みの15 mLコニカルチューブに集めます。
5. 細胞を212 x g で4°Cで5分間遠心分離してペレット化します。 チューブから培地を静かに捨て、チューブ内に残った培地滴に細胞を静かに軽くたたいて再懸濁します。
   注意: 過度で激しいタッピングは避けてください。
6. 5 mLの滅菌血清ピペットを使用して、再懸濁した細胞に2 mLの完全AEC培地をゆっくりと加え、すべての細胞を回収します。
7. 8 mLの完全AEC培地をあらかじめ添加したプレートに細胞を加えます。TCディッシュを横に動かして、ディッシュ内の細胞を均一に分散させます。
8. 細胞を37°Cで85%〜95%の湿潤CO₂ 細胞培養インキュベーターでインキュベートします。24時間後、NHBE細胞を10倍または20倍の顕微鏡で観察し、TC皿への付着と増殖を確認します。細胞が培地に懸濁している場合、これは死んだ細胞を示しています。
9. 48時間後、TC皿から古い培地を滅菌血清ピペットで吸引します。
10. 滅菌血清ピペットを使用して、あらかじめ温めた完全なAEC培地10 mLを細胞に加えます。メディアをゆっくりと片隅に追加します。細胞の上部に直接注ぐことは避けてください。
11. 細胞が95%〜100%の密度に達するまで、48時間ごとに完全なAEC培地を交換します。

2. 気液界面培養

1. P200ピペットを使用して、0.4 μm孔ポリエステルメンブレン(以下、インサートと呼びます)を塗布済みの6.5 mmトランズウェルインサートに100 μLのコラーゲンを加え、室温で20分間インキュベートします。
2. 滅菌血清ピペットを使用して、コンフルエントなNHBE細胞から培地を吸引します。
3. 1x Dulbecco's Phosphate Buffer Saline(DPBS)を滅菌血清学的ピペットで5 mLをTCディッシュの片隅に加えます。
4. プレートを静かに回転させて細胞を洗浄し、滅菌血清学的ピペットで1x DPBSを吸引します。プロトコール中のどのステップでも細胞が乾燥しないようにしてください。
5. 血清ピペットを使用して、5 mLのTrypsinLEを細胞に加え、湿度の高い_CO2 細胞培養インキュベーターで37°Cでインキュベートし、すべての細胞がプレートの底面から解離するまでインキュベートします。
6. 滅菌血清ピペットを使用して、すべての細胞を15mLのコニカルチューブに集めます。滅菌血清学的ピペットを使用して、TCディッシュに3mLのトリプシンを加え、残留細胞を回収します。
7. 細胞を212 x g で4°Cで5分間遠心分離してペレット化します。 培地を捨て、チューブを軽くたたいて、チューブに残ったトリプシン滴の細胞を再懸濁します。
8. 血清学的ピペットを使用して、再懸濁した細胞に2 mLの完全AEC培地を加えます。
9. 血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。
10. 細胞を完全なAEC培地で希釈し、各インサートに200 μLの容量で5 x 10⁴ 細胞を受け取ります。
11. 滅菌鉗子を使用して、インサートを24ウェル培養皿の空のウェルに移します。
12. P1000ピペットを使用して、500 μLの完全なAEC培地をプレートの基底ウェルに加えます。
13. 滅菌鉗子を使用して、インサートを完全なAEC培地を添加した基礎ウェルに戻します。
14. P200ピペットを使用して、200 μLの全AEC培地に5 x 10⁴ 再懸濁NHBE細胞をインサートの頂端側に加えます。細胞を37°Cで85%〜95%の湿度の高いCO₂ 細胞培養インキュベーターでインキュベートします。
15. 24時間後、顕微鏡で細胞を観察し、ウェル内でコンフルエント層を形成しているかどうかを確認します。
    注:細胞がコンフルエント層を形成しない場合は、細胞がコンフルエント単層を形成するまで、48時間ごとに基礎AEC培地を新鮮で完全なAEC培地と交換します。基礎培地を交換しながら、滅菌鉗子でインサートを空のウェルに移します。P1000ピペットで古い培地を吸引し、新しい培地を追加し、インサートを新鮮で完全なAEC培地に戻します。
16. 細胞がコンフルエントになったら、滅菌鉗子でインサートを空のウェルに移します。P1000ピペットを使用して、すべての基礎AEC培地を吸引します。
17. P1000ピペットを使用して、2%(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシンと1%(v/v)アムホテリシンBを添加した500 μLの新鮮な完全空気液界面分化(ALI)培地を基礎ウェルに加えます。
18. 滅菌鉗子を使用して、完全なALI培地を添加したインサートを基礎ウェルに移します。P200ピペットを使用して、ウェルから頂端AEC培地を穏やかに吸引します。
    注意: 頂端側は、完全なALI培地で追加しないでください。AEC培地を頂端側から慎重に吸引し、細胞の剥離を防ぎます。
19. 湿潤なCO₂ 細胞培養インキュベーターで細胞を37°Cでインキュベートします。48時間後、滅菌鉗子でインサートを空のウェルに移します。
20. P1000ピペットを使用して、古い培地を吸引し、新しい500μLの完全ALI培地を加えます。
21. 滅菌鉗子を使用して、インサートを新鮮な培地でウェルに戻します。完全なALI培地を28日目(4週間)まで48時間ごとに交換し続けます。
22. 28日目に、P200ピペットを使用して、インサートの頂端側に100 μLの1x DPBSを加え、湿度の高い_CO2 細胞培養インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。1x DPBSをP200ピペットで吸引します。
    注:DPBSは、セルに直接注ぐのではなく、壁に注ぐことによって追加する必要があります。DPBSを吸引する際は、上皮に損傷を与えると上皮(組織様)の完全性が損なわれる可能性があるため、上皮に触れたり、激しいピペッティングを行ったりすることは避けてください。
23. 分化の^2週目 から、顕微鏡下で上皮上の粘液による可能性のある暗い層を観察することにより、粘液産生を評価します。余分な粘液はDPBS洗浄で取り除くことができます。簡単に説明すると、24ウェルプレートのインサートの頂端側に200 μLの1x DPBSを加え、プレートを37°Cで湿潤な_CO2 細胞培養インキュベーターで30分間インキュベートします。DPBSを取り外し、プレートを湿度の高い_CO2 細胞培養インキュベーターで37°Cに保ちます。

3. 毛様体心拍周波数の決定

注:37°CでのCBFの測定(必要な場合)には、顕微鏡に37°Cおよび湿度で5%の_CO2 を提供する環境チャンバーインキュベーターが必要です。

1. 接続されたコンピューターと環境チャンバーを備えた顕微鏡の電源を入れます。チャンバーのドアを開けて、インサートが入ったプレートを顕微鏡ステージに置きます。
2. プレートをステージに置いたら、チャンバーを閉じます。顕微鏡ステージの操作ノブを使用して、プレートを動かしてインサートを視界に浮かべます。
3. 倍率20倍のレンズを位相差モードで選択します。顕微鏡の接眼レンズを通してプレートを観察し、チューニングノブを使用して細胞の焦点を合わせます。
4. コンピュータ画面で、 SAVAシステム アイコンをクリックします。SAVAプログラムは、顕微鏡に接続されたコンピューターにインストールする必要があります。
5. ソフトウェアインターフェースで、[ Configure Experiment] をクリックします。次のタブで、[ 実験の作成] をクリックします。
6. 新しいタブが表示され、データが保存されるディレクトリの詳細を [Enter Experiment Directory Name] に、実験の詳細を [Enter Experiment Description] に入力し、[ OK] をクリックします。
7. 作成され、ディレクトリの [Experiments] の下に表示されている [ The Experiment ] をクリックします。
8. [Modify] をクリックし、[Sample Description] にサンプルの詳細を入力します。[追加]をクリックし、[終了]をクリックして、このタブを終了します。
9. 実験スロットのメインソフトウェアインターフェースで、メインインターフェースのドロップダウンメニューから作成した実験を選択します。
10. [ビデオの録画]をクリックし、コンピューター画面上の毛様体心拍周波数(CBF)を監視します。画面には焦点が合った毛様体の動きが表示されます。
11. 挿入ごとに、6 つの異なるランダム フィールドを 120 フレーム/秒で 2.1 秒間記録します。CBFデータを監視するには、[ ビデオの保存 ]をクリックします。
12. データを分析するには、ソフトウェアインターフェースの 「ビデオの分析 」をクリックします。次のタブで、[ OK]をクリックします。
13. 次のタブで、[ すべて分析]をクリックします。コンピューターの SAVA データ収集フォルダー内のすべての実験に対して生成されたスプレッドシートをダウンロードします。
14. データ表示のガウス平均度数を取ります。

4. 経上皮電気抵抗の定量化

注:TEERの定量には、気道上皮の頂端側に液体が必要です。このプロトコルを確立するには、すでに基礎培地 (実験的) が含まれているインサートの気道上皮の頂端側に 100 μL の 1x DPBS を追加するか、500 μL の 1x DPBS を追加します。

1. 電源スイッチを使用してEVOM2ボルト抵抗計の電源を入れます。テスト抵抗をINPUTスロットのEVOM2に接続します。
2. EVOM2画面で読み取りを監視します。1000より上または小さい場合は、キャリブレーションが必要です。鉗子を使用して、EVOM2ボルト抵抗計のADJスイッチを回して、均一な1000の読み取り値が表示されるまで回します。
3. 実験制御の読み取りには、空のインサートを用意します。P200ピペットを使用して、空のインサートの頂端側に100 μLの1x DPBSを添加し、P1000ピペットで基底側に500 μLの1x DPBSを添加します。
4. テスト抵抗器を外し、EVOM2の入力スロットにSTX2電極を接続します。STX2電極を70%エタノールで優しく洗浄します。
5. STX2電極を1x DPBSでemptyinsertに挿入し、短い方の電極脚を各インサートの頂端部分に、長い方の電極脚を基底部に保ちます。
6. 動きやその他の不確定な理由により読み取り値が変動する可能性があるため、EVOM2画面に安定した読み取り値を記録します。
7. STX2電極を28日間の分化上皮を持つインサートに挿入し、短い方の電極レッグを各インサートの頂端部分に、長い方の電極レッグを媒体の基底部に保ちます。
8. EVOM2画面に安定した読み取りを記録します。信頼できる平均を計算するために、いくつかの独立した読み取りを行います。計算のために、実験的なインサートの読み取り値から背景 (空の挿入読み取り値) を差し引きます。

結果

2人の独立した匿名化ドナー(2人の非喫煙、健康な成人、またはCOPDの成人、50歳以上の女性)からの分化初代NHBE細胞から得られた気道上皮の毛様体機能と膜不透過性の両方を評価しました。毛様体機能を決定するために、28日間の分化した気道上皮のCBFを決定しました。CBFは両方の気道上皮で少なくとも3Hzに達し、これは以前に発表された結果と同等であることが観察?...

ディスカッション

ヒト原発性気道上皮(ALI培養)は、機能とメカニズムを調査し、動物の使用を減らすための生物学的評価のためのin vitro肺モデルとしてますます使用されています¹⁴。ALIには、単層の水中培養に比べていくつかの利点があります。例えば、それは、肺気道^6,7,14の頂端側を模倣する組?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific, USA	14190-144
Airway Epithelial Cell Growth Medium	PromoCell, Germany	C-21060
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific, USA	15290-026
EVOM2 volt Ohmmeter	World Precision Instruments, USA	Not applicable
Heparin Solution	STEMCELL technologies, USA	07980
Hydrocortisone stock	STEMCELL technologies, USA	07926
Microscope: Leica DMI8 (Leica Microscope) with 120f/sec high-speed camera (Basler) associated with the microscope. Microsope also fixed with stage chamber incubator i8.	Leica, USA	Not applicable
Penicillin-Streptomycin	Corning, USA	30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL technologies, USA	05002
PureCol	Advanced BioMatrix, USA	5005
Sisson-Ammons video analysis (SAVA) system. Software V.2.1.15	Amson Engineering, USA	Not applicable