Determining Ciliary Function and Membrane Impermeability of the Pseudostratified Lung Airway epithelium(가성층화된 폐 기도 상피의 섬모 기능 및 막 불투과성 측정)

요약

공기-액체 계면 배양은 일반적으로 폐기도의 정점 쪽을 모방하는 1차 정상 인간 기관지 상피 세포를 분화하여 가성층화 기도 상피를 개발하는 데 사용됩니다. 여기에서는 섬모 기능 및 막 무결성과 같은 생물물리학적 특성을 모니터링하여 품질을 결정하기 위한 쉬운 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

공기-액체 계면(ALI)에서 원발성 폐 기도 상피 세포를 분화하는 것은 폐기도의 정점 쪽을 모방한 다세포 가성층 기도 상피를 개발하기 위해 널리 사용되는 기술입니다. 원발성 폐 기도 세포의 분화가 예상되지만, 섬모 기능 및 막 불투과성과 같은 생물물리학적 특성의 평가는 기도 상피의 품질 평가를 제공하고 실험의 신뢰성을 보장합니다. 여기에서는 ALI 배양에서 다세포 가성층 기도 상피의 발달을 위한 간단한 프로토콜을 설명하고 두 가지 중요한 생물물리학적 특성인 섬모 기능과 막 불투과성을 평가합니다. 섬모 기능을 확인하기 위해 도립 현미경에 부착된 고속 카메라를 사용하여 4주 동안 분화된 기도 상피의 섬모 움직임을 캡처한 다음 Simon Amon Video Analysis(SAVA) 시스템을 사용하여 섬모 박동 주파수(CBF)를 정량화했습니다. 또한 기도 상피의 상피 장벽 무결성을 결정하기 위해 볼트-옴 미터를 사용하여 경상피 전기 저항(TEER)을 측정했습니다.

서문

천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증과 같은 만성 호흡기 질환은 전 세계적으로 주요 건강 문제 중 하나입니다¹. 인간 인플루엔자 A 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)와 같은 바이러스에 의해 유발되는 호흡기 질환의 유병률도 경제적 및 공중 보건 부담을 초래합니다². 따라서 돌이킬 수 없는 호흡기 조직 손상으로 이어지는 호흡기 질환에 대한 치료 요법을 개발해야 할 필요성이 매우 큽니다. 호흡기 상피 조직 자체는 산소 흡수에 관여할 뿐만 아니라 병원균 및 유해 화학 물질의 침입으로부터 신체를 보호하는 장벽을 제공합니다³. 호흡기 상피는 섬모 세포(ciliated cell), 배상 세포(goblet cell), 기저 세포(basal cell)의 세 가지 주요 세포 유형으로 구성된 복잡한 세포 조직을 가지고 있습니다. 최근에는 기도 상피⁴에 새롭지만 드문 전리세포 세포가 존재한다는 보고가 있었습니다. 이 복잡한 조직은 항균 펩타이드의 분비, 적응 면역 반응을 활성화하기 위한 사이토....

프로토콜

프로토콜은 생물 안전성 레벨 2 층류 후드(생물 안전 캐비닛)에서 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 모든 매체와 용액은 사용하기 전에 37°C에서 해동해야 합니다. 원심분리는 4°C에서 수행해야 합니다. 실험에 사용된 모든 재료는 멸균되어야 합니다. 일차 세포(비식별화된 기증자)는 네브래스카주 오마하에 있는 네브래스카 대학 의료 센터(UNMC)의 Kristina Bailey 박사와 협력하여 얻었습니다. 일차 세포는 비식별화된 기증자로부터 유래하며, 세포는 NIH Human Subject에 속하지 않습니다. 세포는 노스다코타주 그랜드포크스에 있는 노스다코타대학교(University of North Dakota)와 네브래스카주 오마하의 UNMC 간에 승인된 MTA(Material Transfer Agreement)에 따라 획득되었습니다. 여기에서는 계대가 형성된 4개의 NHBE 세포를 사용했습니다. 더 높은 계대 NHBE 세포(최대 계대 8)도 기도 상피로 분화하는 것으로 나타났지만, 계대 1에서 4까지의 계대 간에 전체 게놈 전사 프로파일에 명백한 차이가 없기 때문에 일반적으로 4개의 계대 NHBE 세포를 사용합니다 ^6,14.

결과

우리는 2명의 독립적인 비식별화 기증자(2명의 비흡연, 건강한 성인 또는 COPD가 있는 성인, 50세 이상의 여성)로부터 1차 NHBE 세포를 분화하여 얻은 기도 상피의 섬모 기능과 막 불투과성을 모두 평가했습니다. 섬모 기능을 결정하기 위해 28일 분화된 기도 상피의 CBF를 측정했습니다. 우리는 CBF가 양쪽 기도 상피에 대해 최소 3Hz에 도달하는 것을 관찰했으며, 이는 이전에 발?.......

토론

인간의 일차 기도 상피(ALI 배양)는 기능과 기전을 조사하고 동물 사용을 줄이기 위한 생물학적 평가를 위한 체외 폐 모델로 점점 더 많이 사용되고 있다¹⁴. ALI는 단층 수중 배양에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 폐기도의 정점 쪽을 모방한 조직과 같은 가성층화 기도 상피를 제공합니다 ^6,7,14

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific, USA	14190-144
Airway Epithelial Cell Growth Medium	PromoCell, Germany	C-21060
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific, USA	15290-026
EVOM2 volt Ohmmeter	World Precision Instruments, USA	Not applicable
Heparin Solution	STEMCELL technologies, USA	07980
Hydrocortisone stock	STEMCELL technologies, USA	07926
Microscope: Leica DMI8 (Leica Microscope) with 120f/sec high-speed camera (Basler) associated with the microscope. Microsope also fixed with stage chamber incubator i8.	Leica, USA	Not applicable
Penicillin-Streptomycin	Corning, USA	30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL technologies, USA	05002
PureCol	Advanced BioMatrix, USA	5005
Sisson-Ammons video analysis (SAVA) system. Software V.2.1.15	Amson Engineering, USA	Not applicable