Determining Ciliary Function and Membrane Impermeability of the Pseudostratified Lung Airway epithelium(가성층화된 폐 기도 상피의 섬모 기능 및 막 불투과성 측정)

요약

공기-액체 계면 배양은 일반적으로 폐기도의 정점 쪽을 모방하는 1차 정상 인간 기관지 상피 세포를 분화하여 가성층화 기도 상피를 개발하는 데 사용됩니다. 여기에서는 섬모 기능 및 막 무결성과 같은 생물물리학적 특성을 모니터링하여 품질을 결정하기 위한 쉬운 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

공기-액체 계면(ALI)에서 원발성 폐 기도 상피 세포를 분화하는 것은 폐기도의 정점 쪽을 모방한 다세포 가성층 기도 상피를 개발하기 위해 널리 사용되는 기술입니다. 원발성 폐 기도 세포의 분화가 예상되지만, 섬모 기능 및 막 불투과성과 같은 생물물리학적 특성의 평가는 기도 상피의 품질 평가를 제공하고 실험의 신뢰성을 보장합니다. 여기에서는 ALI 배양에서 다세포 가성층 기도 상피의 발달을 위한 간단한 프로토콜을 설명하고 두 가지 중요한 생물물리학적 특성인 섬모 기능과 막 불투과성을 평가합니다. 섬모 기능을 확인하기 위해 도립 현미경에 부착된 고속 카메라를 사용하여 4주 동안 분화된 기도 상피의 섬모 움직임을 캡처한 다음 Simon Amon Video Analysis(SAVA) 시스템을 사용하여 섬모 박동 주파수(CBF)를 정량화했습니다. 또한 기도 상피의 상피 장벽 무결성을 결정하기 위해 볼트-옴 미터를 사용하여 경상피 전기 저항(TEER)을 측정했습니다.

서문

천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증과 같은 만성 호흡기 질환은 전 세계적으로 주요 건강 문제 중 하나입니다¹. 인간 인플루엔자 A 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)와 같은 바이러스에 의해 유발되는 호흡기 질환의 유병률도 경제적 및 공중 보건 부담을 초래합니다². 따라서 돌이킬 수 없는 호흡기 조직 손상으로 이어지는 호흡기 질환에 대한 치료 요법을 개발해야 할 필요성이 매우 큽니다. 호흡기 상피 조직 자체는 산소 흡수에 관여할 뿐만 아니라 병원균 및 유해 화학 물질의 침입으로부터 신체를 보호하는 장벽을 제공합니다³. 호흡기 상피는 섬모 세포(ciliated cell), 배상 세포(goblet cell), 기저 세포(basal cell)의 세 가지 주요 세포 유형으로 구성된 복잡한 세포 조직을 가지고 있습니다. 최근에는 기도 상피⁴에 새롭지만 드문 전리세포 세포가 존재한다는 보고가 있었습니다. 이 복잡한 조직은 항균 펩타이드의 분비, 적응 면역 반응을 활성화하기 위한 사이토카인 방출, 점액 섬모 제거와 같은 선천성 면역 반응을 제공하기 위해 조정된 방식으로 기능합니다⁵. 적절한 기도 모델이 없다는 것은 호흡기 감염 연구와 치료법 개발에 대한 장애물 중 하나입니다.

공기-액체 계면(ALI) 모델은 호흡기 질환 연구의 핵심 도구가 되고 있습니다⁶. 이는 일차 폐 기도 세포가 일반적으로 기도의 정점 쪽에 상주하는 최소 세 가지 유형의 세포로 구성된 가성층화된 기도 상피로 분화되기 때문에 효과적인 체외 폐 기도 모델입니다. 첫째, 섬모 세포는 기도의 정점 쪽 대부분을 덮고 있으며 점액 섬모 청소에 기여합니다. 둘째, 배상세포(goblet cell)는 점액을 생성하며 기도의 정점 쪽에서 섬모 세포와 함께 상주하는 가장 큰 세포입니다. 셋째, 기저세포는 기도의 기저층에 존재하며 다른 상피세포로 분화하는 전구세포입니다 ^5,7. 전리세포(ionocyte)와 다발세포(tuft cell)는 기도 상피에서 드물지만, 섬모 기능과 막 투과성(membrane permeability)에도 중요한 역할을 할 수 있다⁴. 이 기술은 생체 내 폐 환경을 모방하지 않는 기존의 수중 세포 배양과 다릅니다. ALI는 건강한 사람, 천식 환자 및 COPD 환자에서 유래한 1차 상피 세포에서 생성되기 때문에 감염 및 질병 병태생리학에 대한 반응을 연구하기 위한 보다 다양한 플랫폼을 제공합니다.

ALI가 개발한 배양액의 건강 평가는 배양된 세포의 생존력, 기능 및 생리학적 관련성을 보장하기 위해 모니터링해야 하는 필수적인 측면입니다. 이를 통해 ALI 문화의 무결성, 신뢰성 및 재현성에 대한 확신을 높일 수 있습니다. 이전에 발표된 바와 같이, 우리 그룹은 두 가지 생물물리학적 매개변수, 즉 섬모 박동 빈도(CBF)를 정량화하여 섬모 기능과 경상피 전기 저항(TEER)을 결정하여 상피 장벽 무결성을 평가하여 ALI 배양 무결성을 평가해 왔습니다^6,7,8. 점모세포제거율(Mucociliary clearance, MCC)은 섬모 세포가 운반하는 기도 상피의 중요한 특징 중 하나입니다. 섬모 세포의 표면에 있는 섬모(cilia)라고 불리는 특수 소기관은 기도 상피의 점막층에 붙어 있는 감염 및 흡입된 입자를 기도에서 제거하기 위해 중시파(metachronal wave)로 박동합니다. 효과적인 MCC는 전적으로 적절한 섬모 활동에 달려 있다⁹. 좋은 CBF는 건강하고 손상되지 않은 기도 상피를 나타냅니다. 따라서 ALI 배양에 대한 CBF의 모니터링은 상피의 무결성에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다¹⁰. 예를 들어 고속 비디오 현미경¹¹ 및 위상 분해 도플러 광 간섭 단층 촬영(¹²)과 같이 CBF를 정량화하는 방법에는 여러 가지가 있지만 각 방법에는 기술 전문 지식과 전문 장비가 필요합니다. 이 프로토콜에서는 분화된 기도 상피의 CBF를 정량화하는 더 쉽고 덜 기술적인 방법을 제공합니다. 또한 동일한 상피의 TEER을 정량화하는 방법을 설명했는데, 이는 상피 조직의 무결성과 장벽 기능을 나타냅니다¹³.

프로토콜

프로토콜은 생물 안전성 레벨 2 층류 후드(생물 안전 캐비닛)에서 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 모든 매체와 용액은 사용하기 전에 37°C에서 해동해야 합니다. 원심분리는 4°C에서 수행해야 합니다. 실험에 사용된 모든 재료는 멸균되어야 합니다. 일차 세포(비식별화된 기증자)는 네브래스카주 오마하에 있는 네브래스카 대학 의료 센터(UNMC)의 Kristina Bailey 박사와 협력하여 얻었습니다. 일차 세포는 비식별화된 기증자로부터 유래하며, 세포는 NIH Human Subject에 속하지 않습니다. 세포는 노스다코타주 그랜드포크스에 있는 노스다코타대학교(University of North Dakota)와 네브래스카주 오마하의 UNMC 간에 승인된 MTA(Material Transfer Agreement)에 따라 획득되었습니다. 여기에서는 계대가 형성된 4개의 NHBE 세포를 사용했습니다. 더 높은 계대 NHBE 세포(최대 계대 8)도 기도 상피로 분화하는 것으로 나타났지만, 계대 1에서 4까지의 계대 간에 전체 게놈 전사 프로파일에 명백한 차이가 없기 때문에 일반적으로 4개의 계대 NHBE 세포를 사용합니다 ^6,14.

1. 일차 세포 배양

참고: 일차 세포를 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 전체 프로토콜은 일차 세포의 가혹한 처리와 과도한 피펫팅을 피해야 합니다.

1. 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 100mm 조직 배양(TC) 접시에 콜라겐 5mL를 첨가하여 접시를 사전 코팅합니다. TC 접시에 콜라겐을 넣고 실온(RT)에서 20분 동안 배양합니다.
2. 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 TC 접시에서 콜라겐을 흡인하고 2%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신과 1%(v/v) 암포테리신 B가 보충된 사전 해동된 완전 기도 상피 세포(AEC) 배지 8mL로 교체합니다(표 1).
3. 1차 정상 인간 기관지 상피(NHBE) 세포의 1개 바이알(5 x 10⁵ 개 세포 포함)을 37°C의 수조에서 해동합니다.
4. 5mL 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 사전 해동된 완전한 AEC 배지 1mL를 세포에 적가하여 NHBE 세포에 순응시키고 모든 세포를 멸균 15mL 원뿔형 튜브에 수집합니다.
5. 4°C에서 5분 동안 212 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 튜브에서 배지를 부드럽게 버리고 부드럽게 두드려 튜브에 남은 배지 방울의 세포를 다시 현탁시킵니다.
   알림: 과도하고 거친 두드리기는 피해야 합니다.
6. 5mL 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 2mL의 완전한 AEC 배지를 재현탁 세포에 천천히 추가하고 모든 세포를 수집합니다.
7. 8mL의 완전한 AEC 배지가 미리 추가된 플레이트에 세포를 추가합니다. TC 접시를 옆으로 움직여 접시의 세포를 균일하게 분배합니다.
8. 37°C에서 85%-95% 습도가 높은 CO₂ 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 24시간 후, 현미경으로 NHBE 세포가 TC 접시에 부착되고 성장하는지 10x 또는 20x로 관찰합니다. 세포가 배지에 부유하면 죽은 세포가 표시됩니다.
9. 48 시간 후, 멸균 혈청 학적 피펫으로 TC 접시의 오래된 배지를 흡인합니다.
10. 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 10mL의 예열된 완전한 AEC 배지를 세포에 추가합니다. 미디어를 한쪽 모서리에 천천히 추가합니다. 세포 상단에 직접 붓지 마십시오.
11. 셀이 95%-100% 농도에 도달할 때까지 48시간마다 전체 AEC 미디어를 변경합니다.

2. Air-Liquid 인터페이스 문화

1. P200 피펫을 사용하여 0.4μm 공극의 폴리에스테르 멤브레인이 있는 사전 코팅된 6.5mm 트랜스웰 인서트(여기서는 인서트라고 함)에 콜라겐 100μL를 추가하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
2. 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 합류하는 NHBE 세포에서 배지를 흡인합니다.
3. 멸균 혈청학 피펫과 함께 1x Dulbecco의 인산염 완충액 식염수(DPBS) 5mL를 TC 접시의 한쪽 모서리에 추가합니다.
4. 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 세포를 세척하고 멸균 혈청학 피펫으로 1x DPBS를 흡인합니다. 프로토콜 중 어떤 단계에서도 세포가 건조되지 않도록 합니다.
5. 혈청학 피펫을 사용하여 세포에 5mL의 TrypsinLE를 추가하고 모든 세포가 플레이트의 바닥 표면에서 해리될 때까지 습한 CO₂ 세포 배양 인큐베이터에서 37°C로 배양합니다.
6. 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에 모든 세포를 수집합니다. 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 TC 접시에 트립신 3mL를 추가하고 잔류 세포를 수집합니다.
7. 4°C에서 5분 동안 212 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 배지를 버리고 튜브를 부드럽게 두드려 튜브에 남아 있는 트립신 방울의 세포를 다시 현탁시킵니다.
8. 혈청학적 피펫을 사용하여 2mL의 완전한 AEC 배지를 재현탁 세포에 추가합니다.
9. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다.
10. 완전한 AEC 매체로 셀을 희석하고 각 삽입물은 200μL 부피의 5 x 10⁴ 셀을 수용합니다.
11. 멸균 겸자를 사용하여 삽입물을 24웰 배양 접시의 빈 우물로 옮깁니다.
12. P1000 피펫을 사용하여 500μL의 완전한 AEC 매체를 플레이트의 기초 웰에 추가합니다.
13. 멸균 겸자를 사용하여 완전한 AEC 매체를 추가하여 삽입물을 기저 웰로 다시 옮깁니다.
14. P200 피펫을 사용하여 전체 AEC 배지의 200 μL에 있는 5 x 10⁴ resuspended NHBE 셀을 인서트의 정점 면에 추가합니다. 85% - 95% 습도가 높은 CO₂ 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양합니다.
15. 24시간 후, 현미경으로 세포를 관찰하여 우물에 합류층을 형성했는지 확인합니다.
    참고: 세포가 합류층을 형성하지 않는 경우 세포가 융합 단층을 형성할 때까지 48시간마다 새롭고 완전한 AEC 매체로 기저 AEC 매체를 변경합니다. 기초 매체를 교체하는 동안 멸균 겸자로 삽입물을 빈 웰로 옮깁니다. P1000 피펫으로 기존 매체를 흡입하고, 새 배지를 추가하고, 인서트를 새롭고 완전한 AEC 배지에 다시 놓습니다.
16. 세포가 합류하면 멸균 집게를 사용하여 삽입물을 빈 우물로 옮깁니다. P1000 피펫을 사용하여 모든 기초 AEC 매체를 흡입합니다.
17. P1000 피펫을 사용하여 2%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신과 1%(v/v) 암포테리신 B가 보충된 500μL의 완전한 공기-액체 계면 분화(ALI) 배지를 기저 웰에 추가합니다.
18. 멸균 겸자를 사용하여 완전한 ALI 배지를 추가하여 삽입물을 기저 웰로 옮깁니다. P200 피펫을 사용하여 웰에서 정점 AEC 매체를 부드럽게 흡입합니다.
    참고: 정점 쪽에 완전한 ALI 매체를 추가해서는 안 됩니다. 세포가 분리되지 않도록 정점 쪽에서 AEC 매체를 조심스럽게 흡입합니다.
19. 습한 CO₂ 세포 배양 인큐베이터에서 37°C의 세포를 배양합니다. 48시간 후 멸균 집게를 사용하여 삽입물을 빈 우물로 옮깁니다.
20. P1000 피펫을 사용하여 기존 배지를 흡입하고 새로운 500 μL의 완전한 ALI 배지를 추가합니다.
21. 멸균 집게를 사용하여 새 배지로 인서트를 웰에 다시 놓습니다. 28일(4주)까지 48시간마다 전체 ALI 배지를 계속 교체합니다.
22. 28일째에 P200 피펫을 사용하여 100μL의 1x DPBS를 인서트의 정점 면에 추가하고 습한 CO₂ 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다. P200 파이펫으로 1x DPBS를 흡입합니다.
    참고: DPBS는 셀에 직접 붓는 대신 벽에 부어 추가해야 합니다. DPBS를 흡인하는 동안 상피를 만지지 말고 격렬한 피펫팅을 하면 상피(조직과 같은) 무결성이 손상될 수 있으므로 피펫팅을 하지 마십시오.
23. 분화 2^주 째부터 현미경으로 상피의 점액으로 인해 더 어두워질 수 있는 층을 관찰하여 점액 생성을 평가합니다. 과도한 점액은 DPBS 세척으로 제거할 수 있습니다. 간단히 말해서, 24웰 플레이트에 삽입물의 정점 쪽에 200μL의 1x DPBS를 추가하고 습한 CO₂ 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. DPBS를 제거하고 습한 CO₂ 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 37°C로 유지합니다.

3. 섬모 박동 빈도의 결정

참고: 37°C에서 CBF를 측정하려면(필요한 경우) 현미경에는 37°C 및 습도에서 5% CO₂ 를 제공하는 환경 챔버 인큐베이터가 있어야 합니다.

1. 컴퓨터가 부착된 현미경과 환경 챔버를 켭니다. 챔버의 도어를 열어 인서트가 들어 있는 플레이트를 현미경 스테이지에 놓습니다.
2. 플레이트가 무대에 놓이면 챔버를 닫습니다. 현미경 스테이지 작동 손잡이를 사용하여 플레이트를 이동하여 인서트를 view.
3. 위상차 모드에서 20배 확대 렌즈를 선택합니다. 현미경의 접안렌즈를 통해 플레이트를 관찰하고 튜닝 노브를 사용하여 세포의 초점을 맞춥니다.
4. 컴퓨터 화면에서 SAVA 시스템 아이콘을 클릭합니다. SAVA 프로그램은 현미경에 연결된 컴퓨터에 설치해야합니다.
5. 소프트웨어 인터페이스에서 Configure Experiment를 클릭합니다. 다음 탭에서 Create Experiment를 클릭합니다.
6. 새 탭이 나타나면, 실험 디렉토리 이름 입력에 데이터가 저장될 디렉토리의 세부 정보와 실험 설명 입력에 실험 세부 정보를 제공한 다음 확인을 클릭합니다.
7. 생성되어 실험 아래의 디렉토리에 표시되는 실험 을 클릭합니다.
8. Modify( 수정 )를 클릭하고 Sample Description(샘플 설명)에 샘플 세부 정보를 제공합니다. Add( 추가 )를 클릭한 다음 Exit(종료 )를 클릭하여 이 탭을 종료합니다.
9. 실험 슬롯의 기본 소프트웨어 인터페이스에서 기본 인터페이스의 드롭다운 메뉴에서 생성된 실험을 선택합니다.
10. 비디오 녹화를 클릭하고 컴퓨터 화면에서 섬모 비트 주파수(CBF)를 모니터링합니다. 화면에 집중된 섬모 움직임이 표시됩니다.
11. 각 삽입에 대해 초당 120프레임에서 2.1초 동안 6개의 서로 다른 임의 필드를 기록합니다. Save Video(비디오 저장 )를 클릭하여 CBF 데이터를 모니터링합니다.
12. 데이터를 분석하려면 소프트웨어 인터페이스에서 Analyse Video(비디오 분석 )를 클릭합니다. 다음 탭에서 확인을 클릭합니다.
13. 다음 탭에서 Analyse All(모두 분석)을 클릭합니다. 컴퓨터의 SAVA 데이터 수집 폴더에서 모든 실험에 대해 생성된 스프레드시트를 다운로드합니다.
14. 데이터 표현을 위한 가우스 평균 빈도를 사용합니다.

4. 경상피 전기 저항의 정량화

참고: TEER 정량화는 기도 상피의 정점 쪽에 액체가 필요합니다. 이 프로토콜을 확립하려면 이미 기저 배지(실험용)가 포함된 삽입물의 기도 상피의 정점 쪽에 100μL의 1x DPBS를 추가하거나 500μL의 1x DPBS를 추가합니다.

1. 전원 스위치를 사용하여 EVOM2 전압 저항계를 켭니다. 테스트 저항을 INPUT 슬롯의 EVOM2에 연결합니다.
2. EVOM2 화면에서 판독값을 모니터링합니다. 1000 이상이거나 미만이면 보정이 필요합니다. 집게를 사용하여 균일한 2 판독값이 표시될 때까지 EVOM1000 볼트 저항계의 ADJ 스위치를 돌립니다.
3. 실험 대조군 판독을 위해 빈 삽입물을 취합니다. P200 피펫을 사용하여 빈 인서트의 정점 쪽에 100μL의 1x DPBS를 추가하고, P1000 피펫을 사용하여 기저 쪽에 500μL의 1x DPBS를 추가합니다.
4. 테스트 저항을 분리하고 EVOM2의 INPUT 슬롯에 STX2 전극을 연결합니다. 2% 에탄올로 STX70 전극을 부드럽게 청소합니다.
5. 2x DPBS로 빈 삽입물에 STX2 전극을 삽입하고 짧은 전극 레그는 각 인서트의 정점 부분에 유지하고 긴 전극 레그는 기저 부분에 유지합니다.
6. 움직임이나 기타 알 수 없는 이유로 인해 판독값이 변동될 수 있으므로 EVOM2 화면에 안정적인 판독값을 기록하십시오.
7. 28일 분화된 상피가 있는 삽입물에 STX2 전극을 삽입하고 각 삽입물의 정점 부분에 짧은 전극 다리를 유지하고 배지의 기저 부분에 긴 전극 다리를 유지합니다.
8. EVOM2 화면에 안정적인 판독값을 기록합니다. 신뢰할 수 있는 평균을 계산하기 위해 여러 개의 독립적인 판독값을 취하십시오. 계산을 위해 실험용 인서트 판독값에서 배경(빈 인서트 판독값)을 뺍니다.

결과

우리는 2명의 독립적인 비식별화 기증자(2명의 비흡연, 건강한 성인 또는 COPD가 있는 성인, 50세 이상의 여성)로부터 1차 NHBE 세포를 분화하여 얻은 기도 상피의 섬모 기능과 막 불투과성을 모두 평가했습니다. 섬모 기능을 결정하기 위해 28일 분화된 기도 상피의 CBF를 측정했습니다. 우리는 CBF가 양쪽 기도 상피에 대해 최소 3Hz에 도달하는 것을 관찰했으며, 이는 이전에 발?...

토론

인간의 일차 기도 상피(ALI 배양)는 기능과 기전을 조사하고 동물 사용을 줄이기 위한 생물학적 평가를 위한 체외 폐 모델로 점점 더 많이 사용되고 있다¹⁴. ALI는 단층 수중 배양에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 폐기도의 정점 쪽을 모방한 조직과 같은 가성층화 기도 상피를 제공합니다 ^6,7,14

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific, USA	14190-144
Airway Epithelial Cell Growth Medium	PromoCell, Germany	C-21060
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific, USA	15290-026
EVOM2 volt Ohmmeter	World Precision Instruments, USA	Not applicable
Heparin Solution	STEMCELL technologies, USA	07980
Hydrocortisone stock	STEMCELL technologies, USA	07926
Microscope: Leica DMI8 (Leica Microscope) with 120f/sec high-speed camera (Basler) associated with the microscope. Microsope also fixed with stage chamber incubator i8.	Leica, USA	Not applicable
Penicillin-Streptomycin	Corning, USA	30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL technologies, USA	05002
PureCol	Advanced BioMatrix, USA	5005
Sisson-Ammons video analysis (SAVA) system. Software V.2.1.15	Amson Engineering, USA	Not applicable