Determinando a função ciliar e a impermeabilidade da membrana do epitélio pseudoestratificado das vias aéreas pulmonares

Resumo

A cultura de interface ar-líquido é comumente usada para desenvolver epitélio pseudoestratificado das vias aéreas, diferenciando células epiteliais brônquicas humanas normais primárias que imitam o lado apical das vias aéreas pulmonares. Aqui, descrevemos um protocolo fácil para determinar sua qualidade monitorando suas propriedades biofísicas, como função ciliar e integridade da membrana.

Resumo

A diferenciação de células epiteliais primárias das vias aéreas pulmonares na interface ar-líquido (LPA) é uma técnica popular para desenvolver um epitélio pseudoestratificado multicelular das vias aéreas que imita o lado apical das vias aéreas pulmonares. Embora a diferenciação das células primárias das vias aéreas pulmonares seja esperada, a avaliação das propriedades biofísicas, como função ciliar e impermeabilidade da membrana, fornece uma avaliação da qualidade do epitélio das vias aéreas e garante a confiabilidade do experimento. Aqui, descrevemos um protocolo simples para o desenvolvimento de epitélio pseudoestratificado multicelular das vias aéreas em cultura de LPA e avaliamos duas propriedades biofísicas importantes: função ciliar e impermeabilidade da membrana. Para determinar a função ciliar, capturamos o movimento ciliar de um epitélio diferenciado das vias aéreas de 4 semanas usando uma câmera de alta velocidade acoplada a um microscópio invertido, seguido pela quantificação da frequência de batimento ciliar (CBF) usando o sistema Simon Amon Video Analysis (SAVA). Também medimos a resistência elétrica transepitelial (TEER) usando um volt-ohmímetro para determinar a integridade da barreira epitelial do epitélio das vias aéreas.

Introdução

Doenças respiratórias crônicas, como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e fibrose cística, são alguns dos principais problemas de saúde em todo o mundo¹. A prevalência de doenças respiratórias causadas por vírus como o vírus da influenza A humana, o vírus sincicial respiratório (VSR) e o coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2) também causam ônus econômico e de saúde pública². Portanto, há uma imensa necessidade de desenvolver regimes de tratamento para doenças respiratórias que levam a danos irreversíveis nos tecidos respiratórios. O próprio tecido epitelial respiratório não está apenas envolvido na absorção de oxigênio, mas também fornece uma barreira para proteger o corpo de patógenos invasores e produtos químicos perigosos³. O epitélio respiratório tem uma organização celular complexa composta por três tipos principais de células: células ciliadas, células caliciformes e células basais. Recentemente, houve um relato sobre a presença de células ionócitos novas, mas raras, no epitélio das vias aéreas⁴. O tecido complexo funciona de forma coordenada para fornecer respostas imunes inatas, como secreção de peptídeos antimicrobianos, liberação de citocinas para ativar uma resposta imune adaptativa e depuração mucociliar⁵. A falta de um modelo adequado de vias aéreas é um dos obstáculos para o estudo de infecções respiratórias e o desenvolvimento de tratamentos.

O modelo de interface ar-líquido (LPA) está se tornando uma ferramenta fundamental para a pesquisa de doenças respiratórias⁶. É um modelo eficaz de vias aéreas pulmonares in vitro, pois as células primárias das vias aéreas pulmonares se diferenciam em um epitélio pseudoestratificado das vias aéreas composto por pelo menos três tipos de células que geralmente residem no lado apical das vias aéreas. Primeiro, as células ciliadas cobrem a maior parte do lado apical das vias aéreas e contribuem para a depuração mucociliar. Em segundo lugar, as células caliciformes produzem muco e são as maiores células que co-residem com as células ciliares no lado apical das vias aéreas. Em terceiro lugar, as células basais residem na camada basal das vias aéreas e são as células progenitoras que se diferenciam em diferentes células epiteliais ^5,7. Embora os ionócitos e as células do tufo sejam raros no epitélio das vias aéreas, eles também podem desempenhar um papel na função ciliar e na permeabilidade da membrana⁴. Essa técnica difere da cultura de células submersas tradicional, que não mimetiza o ambiente pulmonar in vivo. Como a LPA é produzida a partir de células epiteliais primárias derivadas de pessoas saudáveis, pacientes com asma e DPOC, ela oferece uma plataforma mais diversificada para estudar as respostas à infecção e à fisiopatologia da doença.

A avaliação da saúde das culturas desenvolvidas com LPA é um aspecto essencial a ser monitorado, garantindo a viabilidade, funcionalidade e relevância fisiológica das células cultivadas. Aumenta a confiança na integridade, confiabilidade e reprodutibilidade das culturas ALI. Como publicado anteriormente, nosso grupo vem avaliando a integridade da cultura de LPA avaliando dois parâmetros biofísicos: função ciliar pela quantificação da frequência de batimento ciliar (FSC) e integridade da barreira epitelial pela determinação da resistência elétrica transepitelial (TEER)^6,7,8. A depuração mucociliar (CCM) é uma das características importantes do epitélio das vias aéreas transportado pelas células ciliadas. Organelas especializadas chamadas cílios na superfície das células ciliadas batem em ondas metacrônicas para limpar as vias aéreas de infecções e partículas inaladas presas na camada mucosa do epitélio das vias aéreas. O MCC eficaz é totalmente dependente da atividade ciliar adequada⁹. Um bom FSC é indicativo de um epitélio das vias aéreas saudável e intacto; portanto, o monitoramento do CBF para culturas de LPA fornece informações valiosas sobre a integridade do epitélio¹⁰. Embora existam várias maneiras de quantificar o FSC, por exemplo, a microscopia de vídeo de alta velocidade¹¹ e a tomografia de coerência óptica com resolução de fase^{Doppler 12}, cada método necessita de conhecimento técnico e equipamentos especializados. Neste protocolo, fornecemos uma maneira mais fácil e menos técnica de quantificar o FSC do epitélio diferenciado das vias aéreas. Também descrevemos um método para quantificar o TEER do mesmo epitélio, que indica a integridade e a função de barreira dos tecidos epiteliais¹³.

Protocolo

O protocolo deve ser realizado em estado estéril sob uma capela de fluxo laminar de nível 2 de biossegurança (gabinete de biossegurança). Todos os meios e soluções devem ser descongelados a 37 °C antes da utilização. A centrifugação deve ser realizada a 4 °C. Todos os materiais utilizados no experimento devem ser estéreis. As células primárias (doador não identificado) foram obtidas em colaboração com a Dra. Kristina Bailey no Centro Médico da Universidade de Nebraska (UNMC), Omaha, NE. As células primárias são de doadores não identificados e as células não se enquadram no sujeito humano do NIH. As células foram obtidas sob um Acordo de Transferência de Material (MTA) aprovado entre a Universidade de Dakota do Norte, Grand Forks, ND, e UNMC, Omaha, NE. Aqui, usamos 4 células NHBE passadas. Embora as células NHBE de passagem mais alta (até a passagem 8) também tenham se diferenciado em epitélio das vias aéreas, usamos rotineiramente células NHBE de passagem quatro porque não há diferença óbvia nos perfis de transcrição do genoma completo entre as passagens 1 a 4 ^6,14.

1. Cultura de células primárias

NOTA: O manuseio cuidadoso das células primárias é crucial. Todo o protocolo deve evitar tratamento agressivo e pipetagem excessiva das células primárias.

1. Usando uma pipeta sorológica estéril, adicione 5 mL de colágeno a uma placa de cultura de tecidos (TC) de 100 mm para pré-revestir a placa. Incube a placa TC com colágeno em temperatura ambiente (RT) por 20 min.
2. Usando uma pipeta sorológica estéril, aspire o colágeno da placa de CT e substitua-o por 8 mL de meio de células epiteliais (AEC) completas das vias aéreas pré-descongeladas suplementadas com 2% (v/v) de penicilina-estreptomicina e 1% (v/v) de anfotericina B (Tabela 1).
3. Descongelar um frasco para injetáveis (contendo 5 x^10,5 células) de células epiteliais brônquicas humanas normais primárias (NHBE) em banho-maria a 37 °C.
4. Com uma pipeta sorológica estéril de 5 mL, adicione 1 mL de meio AEC completo pré-descongelado às células gota a gota para aclimatar as células NHBE e colete todas as células em um tubo cônico estéril de 15 mL.
5. Pulverizar as células por centrifugação a 212 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte suavemente o meio do tubo e ressuspenda as células nas gotas restantes do meio no tubo batendo suavemente.
   NOTA: Batidas excessivas e bruscas devem ser evitadas.
6. Usando uma pipeta sorológica estéril de 5 mL, adicione lentamente 2 mL de meio AEC completo às células ressuspensas e colete todas as células.
7. Adicione as células à placa pré-adicionada com 8 mL de meio AEC completo. Mova a placa TC para o lado para distribuir as células na placa uniformemente.
8. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de cultura de células de CO₂ úmido de 85% a 95%. Após 24 h, observe as células NHBE ao microscópio a 10x ou 20x quanto à sua fixação à placa de TC e crescimento. Se as células estiverem suspensas no meio, isso mostra células mortas.
9. Após 48 h, aspirar o meio antigo da placa de TC com uma pipeta serológica estéril.
10. Usando uma pipeta sorológica estéril, adicione 10 mL de meio AEC completo pré-aquecido às células. Adicione a mídia lentamente a um canto; Evite derramar diretamente por cima das células.
11. Troque o meio AEC completo a cada 48 h até que as células atinjam 95% -100% de confluência.

2. Cultura de interface ar-líquido

1. Usando uma pipeta P200, adicione 100 μL de colágeno a um inserto transwell pré-revestido de 6,5 mm com membrana de poliéster de poros de 0,4 μm (doravante chamados de insertos) e incube em RT por 20 min.
2. Com uma pipeta serológica estéril, aspirar o meio das células NHBE confluentes.
3. Adicione 5 mL de 1x solução salina tampão fosfato de Dulbecco (DPBS) com uma pipeta sorológica estéril em um canto da placa TC.
4. Agite suavemente a placa para lavar as células e aspire o 1x DPBS com uma pipeta sorológica estéril. Certifique-se de que as células não sequem em nenhuma etapa durante o protocolo.
5. Com uma pipeta serológica, adicionar 5 ml de tripsinLE às células e incubar a 37 °C numa incubadora húmida de cultura de células de CO₂ até que todas as células estejam dissociadas da superfície inferior da placa.
6. Usando uma pipeta sorológica estéril, colete todas as células em um tubo cônico de 15 mL. Com uma pipeta sorológica estéril, adicione 3 mL de tripsina à placa de TC e colete todas as células residuais.
7. Pulverizar as células por centrifugação a 212 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o meio e bata suavemente no tubo para ressuspender as células nas gotas de tripsina restantes no tubo.
8. Usando uma pipeta sorológica, adicione 2 mL de meio AEC completo às células ressuspensas.
9. Conte as células usando um hemacitômetro ou contador de células automatizado.
10. Diluir as células com meio AEC completo, com cada inserção recebendo 5 x 10⁴ células em um volume de 200 μL.
11. Com uma pinça estéril, transfira as inserções para um poço vazio em uma placa de cultura de 24 poços.
12. Usando uma pipeta P1000, adicione 500 μL de meio AEC completo ao poço basal da placa.
13. Usando uma pinça estéril, transfira as inserções de volta para o poço basal com a adição de meio AEC completo.
14. Com uma pipeta P200, adicione 5 x 10⁴ células NHBE ressuspensas em 200 μL do meio AEC completo ao lado apical do inserto. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de cultura de células de CO₂ 85% - 95% úmido.
15. Após 24 h, observe as células ao microscópio para ver se formaram uma camada confluente no poço.
    NOTA: Se as células não formarem uma camada confluente, troque o meio AEC basal a cada 48 h por meio AEC fresco e completo até que as células formem uma monocamada confluente. Ao trocar o meio basal, transfira as inserções para o poço vazio com uma pinça estéril. Aspire o meio antigo com uma pipeta P1000, adicione meio fresco e coloque as inserções de volta em meio AEC novo e completo.
16. Assim que as células estiverem confluentes, transfira as inserções para um poço vazio com pinças estéreis. Usando uma pipeta P1000, aspire todo o meio AEC basal.
17. Com uma pipeta P1000, adicione 500 μL de meio de diferenciação de interface ar-líquido (LPA) completo fresco suplementado com 2% (v/v) de penicilina-estreptomicina e 1% (v/v) de anfotericina B ao poço basal.
18. Transfira as inserções para o poço basal com meio ALI completo adicionado usando uma pinça estéril. Usando uma pipeta P200, aspire suavemente o meio AEC apical do poço.
    NOTA: O lado apical não deve ser adicionado com o meio ALI completo. Aspire o meio AEC cuidadosamente do lado apical para evitar qualquer descolamento celular.
19. Incubar as células a 37 °C numa incubadora húmida de CO₂ para cultura de células. Após 48 h, transfira as inserções para um poço vazio com pinça estéril.
20. Usando uma pipeta P1000, aspire o meio antigo e adicione 500 μL de meio ALI completo.
21. Com pinça estéril, coloque as inserções de volta no poço com meio fresco. Continue trocando o meio ALI completo a cada 48 h até o dia 28 (quatro semanas).
22. No dia 28, usando uma pipeta P200, adicione 100 μL de 1x DPBS ao lado apical das inserções e incube a 37 ° C em uma incubadora úmida de cultura de células de CO₂ por 30 min. Aspire o 1x DPBS com uma pipeta P200.
    NOTA: O DPBS deve ser adicionado despejando na parede em vez de diretamente nas células. Durante a aspiração da sep-bronquio, evite tocar no epitélio e na pipetagem vigorosa, pois qualquer dano ao epitélio pode comprometer a integridade do epitélio (semelhante ao tecido).
23. A partir da^2ª semana de diferenciação, avalie a produção de muco observando uma possível camada mais escura devido ao muco no epitélio ao microscópio. O muco excessivo pode ser removido pela lavagem do DPBS. Resumidamente, adicione 200 μL de 1x DPBS no lado apical das inserções em uma placa de 24 poços e incube a placa a 37 ° C em uma incubadora úmida de cultura de células de CO₂ por 30 min. Remover o DPBS e manter a placa a 37 °C numa incubadora húmida de CO₂ para cultura de células.

3. Determinação da frequência de batimento ciliar

NOTA: Para a determinação do FSC a 37 °C (se necessário), o microscópio precisa ter uma incubadora de câmara ambiente que forneça 5% de CO₂ a 37 °C e umidade.

1. Ligue o microscópio com o computador conectado e a câmara do ambiente. Abra a porta da câmara para colocar a placa que contém as inserções na platina do microscópio.
2. Assim que a placa for colocada no palco, feche a câmara. Usando o botão de operação da platina do microscópio, mova a placa para trazer as inserções à vista.
3. Selecione a lente de ampliação de 20x no modo de contraste de fase. Observe a placa através da ocular do microscópio e focalize a célula usando o botão de sintonia.
4. Na tela do computador, clique no ícone do sistema SAVA . O programa SAVA deve ser instalado no computador conectado ao microscópio.
5. Na interface do software, clique em Configurar experimento. Na próxima guia, clique em Criar experimento.
6. Uma nova guia aparecerá, forneça detalhes do diretório em que os dados serão armazenados em Inserir nome do diretório do experimento e detalhes do experimento em Inserir descrição do experimento e clique em OK.
7. Clique no Experimento que foi criado e é mostrado no Diretório em Experimentos.
8. Clique em Modificar e forneça detalhes da amostra na Descrição da amostra. Clique em Adicionar e depois em Sair para sair desta guia.
9. Na interface de software principal no slot do experimento, selecione o experimento criado no menu suspenso na interface principal.
10. Clique em Gravar vídeo e monitore a frequência de batimento ciliar (FSC) na tela do computador. A tela mostrará o movimento ciliar focado.
11. Para cada inserção, grave 6 campos aleatórios diferentes por 2,1 s a 120 quadros por segundo. Clique em Salvar vídeo para monitorar os dados do CBF.
12. Para analisar os dados, clique em Analisar vídeo na interface do software. Na próxima guia, clique em OK.
13. Na guia a seguir, clique em Analisar tudo. Baixe a planilha gerada para cada experimento na pasta de aquisição de dados SAVA do computador.
14. Considere a frequência média gaussiana para a apresentação dos dados.

4. Quantificação da resistência elétrica transepitelial

NOTA: A quantificação de TEER precisa de líquido no lado apical do epitélio das vias aéreas. Para estabelecer este protocolo, adicionar 100 μL de 1x DPBS no lado apical do epitélio das vias aéreas nos insertos que já contêm o meio basal (experimental) ou 500 μL de 1x DPBS.

1. Ligue o ohmímetro de 2 volts EVOM2 usando o botão liga/desliga. Conecte o resistor de teste ao EVOM2 no slot INPUT.
2. Monitore a leitura na tela do EVOM2. Se estiver acima ou abaixo de 1000, precisa de calibração. Usando uma pinça, gire a chave ADJ no ohmímetro de volt EVOM2 até que mostre uma leitura uniforme de 1000.
3. Pegue um encarte vazio para leitura de controle experimental. Usando uma pipeta P200, adicione 100 μL de 1x DPBS no lado apical do inserto vazio, enquanto 500 μL de 1x DPBS são adicionados no lado basal com uma pipeta P1000.
4. Desconecte o resistor de teste e conecte o eletrodo STX2 no slot INPUT no EVOM2. Limpe suavemente o eletrodo STX2 com etanol a 70%.
5. Insira o eletrodo STX2 no inserto vazio com 1x DPBS, mantendo a perna do eletrodo mais curta na parte apical de cada inserto e a perna do eletrodo mais longa na parte basal.
6. Registre a leitura estável na tela EVOM2, pois a leitura pode flutuar devido ao movimento ou outros motivos indeterminados.
7. Insira o eletrodo STX2 no inserto com epitélio diferenciado de 28 dias, mantendo a perna do eletrodo mais curta na parte apical de cada inserto e a perna do eletrodo mais longa na parte basal do meio.
8. Registre a leitura estável na tela EVOM2. Faça várias leituras independentes para calcular uma média confiável. Subtraia o plano de fundo (leitura de inserção vazia) da leitura experimental da inserção para cálculo.

Resultados

Avaliamos a função ciliar e a impermeabilidade da membrana do epitélio das vias aéreas obtidas da diferenciação de células NHBE primárias de dois doadores independentes não identificados (dois adultos saudáveis, não fumantes, ou adultos com DPOC, acima de 50 anos de idade). Para determinar a função ciliar, determinou-se o FSC do epitélio diferenciado das vias aéreas de 28 dias. Observamos que o FSC atingiu pelo menos 3 Hz para ambos os epitélios das vias aéreas, o que fo...

Discussão

O epitélio primário das vias aéreas humanas (cultura de LPA) é cada vez mais usado como modelo pulmonar in vitro para avaliações biológicas para investigar a função e os mecanismos e reduzir o uso de animais¹⁴. O ALI tem várias vantagens sobre qualquer cultura submersa monocamada. Por exemplo, fornece um epitélio pseudoestratificado semelhante a um tecido que imita o lado apical das vias aéreas pulmonares ^6,7,14

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific, USA	14190-144
Airway Epithelial Cell Growth Medium	PromoCell, Germany	C-21060
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific, USA	15290-026
EVOM2 volt Ohmmeter	World Precision Instruments, USA	Not applicable
Heparin Solution	STEMCELL technologies, USA	07980
Hydrocortisone stock	STEMCELL technologies, USA	07926
Microscope: Leica DMI8 (Leica Microscope) with 120f/sec high-speed camera (Basler) associated with the microscope. Microsope also fixed with stage chamber incubator i8.	Leica, USA	Not applicable
Penicillin-Streptomycin	Corning, USA	30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL technologies, USA	05002
PureCol	Advanced BioMatrix, USA	5005
Sisson-Ammons video analysis (SAVA) system. Software V.2.1.15	Amson Engineering, USA	Not applicable