海馬錐体ニューロンにおける役割のための位置特異的GABAA 受容体サブユニットミスセンス変異体の同定と分類

要約

本研究では、DNAからタンパク質機能、神経挙動までを網羅するマルチスケールのフレームワークを導入しています。これは、GABA_A 受容体サブユニットで予測される病原性変異を調査するための新しいアプローチを提示し、病原性として予測されるてんかん原性突然変異と近位突然変異がCA1錐体ニューロンモデルに同様の影響を与える可能性があると仮定しています。

要約

てんかん関連遺伝子における機能的に未知の変異体の影響を理解することは、疾患の病態生理学を解明し、個別化された治療法を開発するために重要です。DNA配列からタンパク質機能、神経挙動に至るまでのマルチスケールフレームワークを用いて、GABA_A 受容体サブユニットのてんかん原性変異とその周辺で予測された変異がCA1錐体ニューロンモデルに同様の影響を与える可能性があると仮定し、病原性突然変異を予測および調査するための新しいアプローチについて説明します。予測される病原性変異と近位てんかん原性変異との間の特徴的な関係を調査することにより、この研究は、てんかん原性突然変異が海馬錐体ニューロンシミュレーションに及ぼす影響に基づいて、予測される突然変異の影響を推定することを目的としています。

この方法論は、GABA_A 受容体γ2サブユニットの遺伝データの収集から始まり、その後、カスタムスクリプトを使用してRでデータのクリーニングとフォーマットを行います。次に、アンサンブル予測子を適用して、 γ2 サブユニットの病原性ミスセンス変異体を特定し、優先順位を付けます。てんかん原性突然変異が共有するサブユニット構造ドメインに特定の病原性変異体(予測)をマッピングする方法を、その影響の分子モデリングと進化的保存の考察とともに説明します。次に、バリアント固有のメタアナリシスとパラメーターの正規化が実行され、続いて相関分析が行われ、予測された突然変異と近位てんかん原性突然変異との間の有意な関係が特定されます。Pythonベースの神経シミュレータを用いて、野生型およびてんかん原性変異体の影響を反映したマルチコンパートメントコンダクタンスベースのニューロンモデルについて述べる。てんかん原性GABA_A 受容体サブタイプによって生成される神経応答のシミュレーションは、予測された病原性変異が神経応答に及ぼす影響を大まかに推定するために考慮されます。私たちの知る限り、これは、てんかん研究に不可欠な神経行動に対する_GABAA 受容体変異体の影響を推定するためのマルチスケールフレームワークを探求する最初のプロトコルです。このプロトコルは、てんかんに関連するGABA_A 受容体の潜在的に病原性の変異体によって引き起こされる細胞表現型の予測を強化するための基盤として役立ちます。

概要

ほぼすべてのヒトの疾患において、遺伝的変異は個人の感受性に重要な役割を果たしています。したがって、配列の変動が疾患リスクとどのように関連しているかを理解することは、疾患の発症に関与する主要なプロセスを明らかにし、予防と治療のための新しいアプローチを特定するための貴重な方法を提供します¹。これは神経発達障害にも当てはまり、小児プライマリケアで最も一般的な慢性疾患にランクされています²。自閉症スペクトラム障害、知的障害、てんかんなどの状態は、遺伝的変異が発達中の個々の感受性にどのように大きく影響するかを示しています³。

発達中の脳は、興奮と抑制の間の重要なバランスにおける遺伝的にプログラムされた神経発達の不一致により、成人の脳よりもてんかん発作にかかりやすい^です4。成体脳の主要な抑制性神経伝達物質であるGABA(γ-アミノ酪酸)は、胚発生時および出生後早期に興奮性であるため、若年脳の発作を予防するために必要な安定性には適していません。K-Cl共トランス^{ポーター5}の十分な発現の欠如によって引き起こされるこの一時的な状態は、機能不全のGABA_A受容体の存在下での発作活性のリスク増加に寄与し得る。GABA_A受容体は、Cl^-イオン^の細胞内濃度に応じて、GABAの興奮性および抑制性作用を媒介します6。したがって、脳が成熟するにつれて、GABA_A受容体をコードする遺伝子や他のイオンチャネルの変異が興奮性を歪め、ニューロン代謝、細胞シグナル伝達、およびシナプス形成^{に関与する遺伝子の変異7}が、小児期の不在てんかん8のような状態^{を引き起こす可能性があります。}

臨床介入では、神経発達障害の治療精度を向上させるために、遺伝子解析をますます活用するようになっています²。小児てんかんにおける遺伝子検査は、精密^{医療アプローチの}潜在的な標的を提示し9、治療決定を導く上での遺伝的変異の重要性を強調しています。さらに、 de novo 変異を有するてんかん患者の~25%は、精密医療の潜在的な標的を特定する遺伝子診断を受けており、治療決定を導く上での遺伝的変異の有意な価値を強調しています¹⁰。これは、標的遺伝子パネル、全エクソームシーケンシング、全ゲノムシーケンシングなどの次世代シーケンシング技術の進歩によって促進され、遺伝子発見が劇的に加速しました¹¹。しかし、新たな遺伝子発見の数が増えると、その結果、疾患の病因における変異体の分子的役割に関する矛盾する証拠や不十分な情報を反映した分類である重要性不明の変異体(VUS)が生まれると、課題が伴います。VUSとして分類された多様体は、American College of Medical Genetics and Genomics(ACMG)およびAssociation for Molecular Pathology(AMP)によって提案された5段階の変異分類システム内の1つのカテゴリーに対応する¹²。

機能的に未知の遺伝的変異の課題に対処するには、臨床診療と研究という2つの主要な側面にわたる取り組みが必要です。臨床的には、VUSを取り巻く不確実性は、患者の管理と意思決定を複雑にする可能性があります¹³。科学研究の観点からは、重要性が不明な変異体の増加の中から病原性変異を特定し、疾患の病態生理学および表現型への影響におけるそれらの役割を決定することが重要です¹。理想的なシナリオの1つは、機能的に特徴付けられていないすべてのバリアントの分子レベル、ニューロンレベル、およびネットワークレベルの影響を正確に予測し、それによって実験室ベースの研究に必要なリソース、時間、および労力を最小限に抑えることです。これらの側面は、遺伝的てんかんの正確な診断を可能にし、個別化治療をサポートし、潜在的な薬理学的標的の発見を促進するために、遺伝的変異を正確に分類することの重要性を強調しています。現在の予測ツール^{14、15、16、17}は比較的正確ですが、典型的には二項分類(病原性対良性)しか提供せず、分子病態生理学、表現型の結果、および根本的なメカニズムに関する疾患固有の洞察を欠いています。本論文では、選択されたGABA_A受容体サブユニットコード遺伝子の未知のミスセンス変異に着目し、分子的、進化的、構造的側面などの変異体の文脈的要因を取り入れることによる研究指導の強化と、てんかん関連変異のin vitro生物物理学的データから導き出された神経病理学のシミュレーションを提示する。私たちの方法論は、てんかんの病態生理学に関与する主要なサブユニットである_GABAA受容体のγ2サブユニットの未知の病原性変異体の同定に取り組んでいます18,19,20。これに続いて、これらの予測された変異体と、構造的および電気生理学的データによって特徴付けられるてんかん関連変異との位置特異的なマッチングの調査が行われます。次に、これらのデータを使用して、γ2、α1、およびβ3サブユニット(γ2-GABA_A受容体)で構成されるGABA_A受容体サブタイプを発現する海馬錐体ニューロンのモデルに対するバリアント効果を推定します⁶。GABA_A受容体は大きなサブユニットプール(α1-α6、β1-β3、γ1-γ3、δ、Ε、θ、π、およびρ1-ρ3)から集合し、サブユニット組成に応じて、GABA_A受容体は、その調節、生物物理学的特性、ならびに特定の機能と結合した地域的、細胞的、および細胞内発現パターンが異なることに注意することが重要です^{6,21,22,23。24、25}。したがって、本研究では、γ2-GABA_A受容体またはγ2含有GABA_A受容体のみに焦点を当てています。

GABA_A受容体サブユニットは、長いN末端細胞外ドメイン(ECD)、4つの膜貫通ドメイン(TM1〜TM4)、TM1とTM2をつなぐ細胞内リンカー、TM2とTM3をつなぐ細胞外リンカー、TM3とTM4の間の大きな細胞内ループ(TM3-TM4ループ)、および短い細胞外C末端^6,26という特徴的な構造的特徴で構成されています^。27.GABA_A受容体は、複雑な「ロックアンドプル」メカニズムを介して機能し、GABA結合がβサブユニットとαサブユニットをロックし、サブユニットの細胞外ドメイン(ECD)を引っ張らせ、それらを反時計回りに回転させることが示唆されている²⁷。この動きは膜貫通ドメイン(TMD)を曲げ、それによってイオンチャネル²⁷を開く。したがって、チャネル活性は、GABA_A受容体内の構造カセットと共に調整されているように見えます。てんかんの突然変異は、これらの構造カセットの歪みを介してチャネル活動の機能不全を引き起こすことがわかった²⁸。したがって、私たちの研究は、GABA_A受容体サブユニットの特定の構造カセットで機能的に同定されたてんかん原性変異に近接する予測された病原性変異が、これらのてんかん原性変異の場合に観察されるように、チャネル機能における電気生理学的または生物物理学的歪みのパターンと同様のパターンを示す可能性があるという考えに基づいています。GABA_A受容体サブユニット²⁸におけるてんかん原性構造カセットの存在は、この概念を間接的に支持しているが、我々の研究は、てんかん原性突然変異の生物物理学的パラメータと予測された病原性突然変異のものとを相関させることの複雑さと課題を示している。これらの複雑な関係を明らかにするために、私たちのフレームワークは、DNAからタンパク質機能、てんかん研究に不可欠な神経行動に至るまでのマルチスケールアプローチを強調しているため、重要です。このアプローチは、計算遺伝学を分子モデリングおよび神経シミュレーションと統合すると同時に、大規模なデータセットで学習された機械学習など、チャネル構造、活動、神経興奮性に対する突然変異の影響を捉えることができる補完的な方法の重要性を強調しています。さらに、海馬錐体ニューロンモデル上でのてんかん原性γ2-GABA_A受容体活性のシミュレーションにより、GABA_A受容体チャネルパチーに関連するin vitro細胞表現型の複製と、ネットワーク機能障害の中心における単一ニューロン応答の変化の実証が可能になります。

プロトコル

1. 病原性多様体の インシリコ 予測

1. バリアント データ収集
   1. ClinVarデータベース²⁹を使用して、ウェブサイトを通じて、目的の遺伝子のコード領域における有意性不明(VUS)の変異体を検索する:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/。検索バーに遺伝子記号( GABRG2など)を入力し、結果をフィルタリングして、一塩基やミスセンスバリアントなど、意義が不明な目的のタイプのバリアントのみを含めます。 data.xlxs (補足ファイル4:補足表S1)をダウンロードして保存します。ダウンロードしたデータの日付を記録します。
      注:現在のプロトコルでは、GABA_A 受容体のヒトγ2サブユニット、特に ホモサピエンス γ-アミノ酪酸A型受容体サブユニットγ2(GABRG2)、転写産物バリアント1、mRNA(NCBI参照シーケンス:NM_198904.4)、γ2Lとしても知られています。計算方法が異なれば識別子も異なる場合があるため、目的遺伝子の参照転写産物と他の対応する識別子を異なるデータベース(UniProt、ENSEMBL、PDB)に記録することが重要です(補足ファイル4:補足表S2)。データベースまたは計算ツールがシーケンス識別子のバージョン番号を認識しない場合は、バージョン番号のある ID (NM_198904.4) とバージョン番号のない ID (NM_198904) の両方を試してください。
   2. 参照タンパク質の基本情報
      1. NCBIデータベース https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ で、検索オプションからNucleotideを選択し、目的遺伝子のNCBI Ref. seq. ID(NM_198904.4)を入力します。次に、右側の列を下にスクロールして、関連情報カテゴリの下のタンパク質をクリックして、転写産物NM_198904.4によってコードされたタンパク質(NP_944494.1)を見つけます。NP_944494.1のタンパク質について与えられた情報を用いて、特定の領域の配列位置を表の形で記録します(Supplementary File 4: Supplementary Table S3)。
         注:機能的および構造的に重要な領域、モチーフ、またはタンパク質ドメイン、リン酸化部位、リガンド結合部位、および分子相互作用インターフェースなどの残基の配列位置に関する予備的な既知の情報を決定することが重要です。これは、データベース(NCBI、ENSEMBL、UniProtなど)と文献検索を組み合わせることで実現できます。
2. バリアント データ編成
   1. 選択した予測子の入力要件を満たすようにデータを整理します。取得されるデータの形式が、dbNSFP サーバ http://database.liulab.science/dbNSFP の要件に一致するように編成されていることを確認します。これを行うには、data.xlsx ファイル (ステップ 1.1.1 の補足ファイル 4: 補足テーブル S1 ) から不要な列を削除し、次の列のみを指定した順序で保持します。
      「GRCh38染色体」、「GRCh38場所」、「名前」、「タンパク質の変化」。
   2. 新しいファイル名「data1.xlsx」(補足表S4)でファイルを保存します。コードを実行して 、data1.xlsx ファイルをRでフォーマットします(補足ファイル1:Data_GABAA。R) は、書式設定されたデータを data1_output.xlsx (補足ファイル 4: 補足表 S5) として R プロジェクトに関連する作業ディレクトリに保存します。
      注:計算方法が異なれば、必要なデータタイプと形式も異なります。特定の形式要件に従ってデータを収集および整理すると、たとえ 12 個のバリアントであっても、エラーが発生しやすく、時間がかかる可能性があるため、バリアント プールが少数のバリアントのみで構成されていない限り、この手順は重要です。そうすれば、手動でのデータ整理が可能になるかもしれません。
3. 病原性予測
   1. data1_output.xlsxファイルの内容を、http://database.liulab.science/dbNSFP 経由でアクセスするアカデミックバージョンのdbNSFP^{サーバー30,31}に転送します。これを行うには、ファイルをコピー/貼り付けるか、.txt形式で直接アップロードします。
   2. 送信前に、HG38 (ゲノムビルド)、ClinPred³²、BayesDEL³³ の各オプションが事前に選択され、サーバーで確認されていることを確認してください。数分以内に、サーバーが結果を生成します。
      注:本プロトコルでは、2つのアンサンブル予測器、すなわちBayesDEL³³およびClinPred³²が、高精度³⁴および実用性のために選択された。しかし、dbNSFPデータベース^30,31で利用可能なAlphaMissenseのような他の予測子も選択することができる。インシリコツールの選択は、強力な予測¹²のための十分な複数行の計算証拠の生成など、いくつかの要因に依存する。複数の予測アルゴリズムの分析を統合したアンサンブル予測子は、この目的を果たすことができます。
   3. 出力ファイル(.txt形式)をダウンロードし、data2.xlsx(補足ファイル4:補足表S6)として保存します。
   4. data2.xlsx(補足ファイル4:補足表S6)でフィルターを設定するには、メニューのフィルターオプションをクリックし、Dをフィルタリングして両方の列のコンセンサスバリアントを決定します。これにより、最も病原性の高い変異体のリストが表示されます。保存します(補足表S6[補足ファイル4]の「コンセンサス」タブを参照)。
4. バリアント選択
   1. コンセンサス病原性予測の中で、文献から得られたてんかん原性突然変異の近接性における変異体を決定します。後者がニューロンモデリングに適した構造的および生物物理学的パラメータを持っていることを確認します。
      注:このステップは探索的であり、その構造的、物理化学的、および生物物理学的パラメータの観点から目的のタンパク質を調査することにも関連しています。本研究では、これらのデータは、てんかんに関連する突然変異の調査に加えて、Brüngerら³⁵およびGuoら³⁶から取得されました。また、オプションとして、AlphaMissense³⁷のスコアは、dbNSFPデータベース^30,31からステップ1.3(補足ファイル4:補足表S7)を繰り返してアクセスした。詳細については、プロトコールのセクション2.1.1および2.1.2、および結果(「構造的および生物物理学的パラメータのクラスタリングバリアント」を参照)に記載されています。
   2. 基本的な可視化のために、Protter³⁸ ((https://wlab.ethz.ch/protter/start/)およびHOPE³⁹ (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)サーバーを使用して、選択したGABRG2 遺伝子変異(P302L⁴⁰ およびK328M)(または39残基シグナルペプチドを除く場合はK289M⁴¹)のコンテキストで前のステップのバリアントを調べます。
      注:非常に複雑なため、バリアント効果の構造評価は、複数の分析レベルで実施する必要があります。Protter³⁸ のようなツールを使用すると、タンパク質のトポロジカル特性のコンテキストでバリアントを明確に視覚化でき、HOPE³⁹ などのユーザーフレンドリーなサーバーを使用すると、分子モデリングによってバリアントの影響に関する洞察が得られます。さらに、てんかんに関連する突然変異に関する情報を特定し、統合するためには、目的のタンパク質の包括的な文献レビューが重要です。
   3. 進化的保存と構造的洞察の解析
      1. Open Jalview 42,43,44は、タンパク質の編集、視覚化、および分析のためのオープンソースプログラムです。
      2. アラインメント用のシーケンスをインポートします。トップメニューの 「ファイル 」をクリックします |シーケンスをフェッチします。ダイアログボックスで データベース を選択します(UniProtなど)。 「IDの取得 」タブをクリックします。ダイアログボックスの説明に従って、ヒトおよび他の脊椎動物種由来の目的の遺伝子(GABRG2)のUniProtアクセッションIDを入力します:P18507、P22723、Q6PW52、A0A2I3TKX0、F1RR72、A0A8I3MDZ2、A0A8M1P4D6。 [OK] をクリックします。
         注:GABRG2によってコードされるタンパク質のUniProtアクセッション番号は、ホモサピエンスのP18507(P18507-2)、Mus musculusのP22723、Pan troglodytesのA0A2I3TKX0、Sus scrofaのF1RR72、Canis familiarisのA0A8I3MDZ2、Danio rerioのA0A8M1P4D6です。
      3. 目的の遺伝子によっては、一部の配列にアノテーションが付かない場合があります。したがって、BLAST 検索を実行して関連情報と潜在的な同族体を特定し、文脈の理解を深めます。この場合、FileメニューのAdd Sequences/FromテキストボックスオプションからFASTA形式のタンパク質配列をアップロードし、目的の配列の複数の配列アラインメントを作成します。
      4. アラインメントが読み込まれたら、表示されたシーケンスを観察して、複数のシーケンスを比較します。各行はシーケンスを表し、各列は整列内の位置を表します。最適な位置合わせ方法を決定するには、さまざまな方法を使用します。たとえば、シーケンスメニューのWebサービスをクリックし、プリセットでT-Coffeeを実行するオプションを選択すると、最適なアライメントが可能になります。
      5. 配列 P18507 Homo sapiens (本研究の参照配列)を右クリックし、 参照配列として設定します。上部メニューで[ フォーマット ]を選択し、[ 折り返し ]をクリックして、画面内の完全な配置を視覚化します。同じフォーマットメニューで、 上のスケール をクリックして、特定の残留物番号の視覚化を強化します。視覚化をさらに強化するには、[ 色 ]に移動し、さまざまなオプション(例:Clustal Color、Chemical Property)を選択して配色を調整します。必要に応じてフォントサイズを変更します。
      6. メニューバーの 「計算 」をクリックし、「 コンセンサスの自動計算 」を選択して、保存された領域を強調表示します。
      7. インシリコ予測ステップで特定された関心のあるバリアントの位置に焦点を当て、特定のバリアントの位置を調べます。特定の残基に注釈を付けるには、それらを右クリックして [注釈の追加] を選択します。ラベル(バリアントIDなど)に適切なカラーコードを記入して保存します。
         注:本解析では、P302L(紫)とA303T(赤)を選択し、構造データとともにマルチプルシーケンシングアラインメントで可視化しました(次項参照)。
   4. 選択された保存された残基を示す全タンパク質の三次元再構成
      1. 前の手順で取得したファイルで、参照配列(GABRG2 ヒト)を右クリックし、 3D構造データを選択します。
      2. ドロップダウンメニューから適切な構造データ(7QNE、Chain C)²⁶ を特定し、 Jmolで新しい構造ビューを開くを選択します。
         注:これにより、3D化学構造のオープンソースのJavaベースのビューアであるJmolによって、マルチプルシーケンスアラインメントで選択された残基を構造データに組み込むことができます。

2. パラメータ選択と生物物理学的モデリング

1. バリアント固有のメタアナリシスとパラメーターの正規化
   1. 現在の文献を調査して、電気生理学的データチャネルコンダクタンス(g_GABAA)、不活性化時間(τ_不活性化)、立ち上がり時間(τ立ち_上がり)、および最大電流振幅(I_max)で特定されたサブユニットバリアントを収集します。各ケースのサブユニット組成、細胞型、および野生型の測定値を提供します。バリアントとそのコントロールをそれに応じてラベル付けします(たとえば、生物物理学的特性が特定されたバリアントで知られており、各バリアントの野生型測定値の既知のコントロール)。
   2. 同定された生物物理学的特性を持つバリアントの AlphaMissense 病原性スコアを取得します。
      注: 詳細については、プロトコルのセクション 1.3 を参照してください。
   3. 各バリアントのサブユニットとアミノ酸の位置、元のアミノ酸と変更されたアミノ酸、病原性スコア、および文献から得られた生物物理学的パラメーターを含むデータフレームを作成します。実験の不一致を避けるために、同定されたバリアントの生物物理学的パラメータを野生型測定値のx倍変化として正規化します。
2. 構造特性と機能特性による比較バリアント解析
   1. 予測されたバリアントをデータ フレームに整理します。それに応じてラベルを付けます(たとえば、生物物理学的特性に関する文献がない変異体について予測されます)。
   2. アミノ酸配列と三次構造における位置によってバリアントを分類します。データフレームに構造分類パラメータ(アルファヘリックス、コイル、ベータシート、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、細孔内ライニング、アゴニスト結合、タンパク質間相互作用など)を追加し、各バリアントのアミノ酸位置に関する情報を提供します。
   3. メンブレンの中心と細孔軸までの距離によってバリアントを分類します。データフレームの細孔軸に距離を追加し、メンブレンの中心パラメーターまでの距離を追加します。
   4. 既知のバリアントに対する構造的および生物物理学的パラメータ間の相関関係を解析します。可能であれば、得られた相関関係に対して予測されたバリアントを評価します。
3. Synapseおよびニューロンモデルの構築
   1. Pythonで開発されたオープンソースのニューラルシミュレータであるBrian2⁴⁵を使用して、スパイクニューラルネットワークのモデリングとシミュレーションを行い、マルチコンパートメントコンダクタンスベースの海馬錐体ニューロン上のGABA作動性シナプスのマルチコンパートメント生物物理学モデルを構築します。
   2. イオンチャネルゲーティング速度論、パッシブ パラメーターとアクティブ パラメーター、シナプス後コンダクタンスを定義することで、コンダクタンスベースのモデルを設計します。モデルで使用される方程式を記述した 補足ファイル2に示されているように、コンダクタンスベースのモデルを定義します。
      1. 膜容量(C_m)を1 μF/cm² 、細胞内抵抗_(RA)を200 Ω.cmに設定します。
      2. 海馬錐体ニューロン³⁹ の修正ホジキン・ハクスリー型コンダクタンスをg_L= 0.0003 S/cm²、g_K= 0.036 S/cm²、E_L = -76.5 mV、E_Na = 50 mV、E_K = -90 mVで使用します。
      3. g_Na 上の Na_V チャネルの密度分布を、体細胞で 0.05 S/cm²、軸索初期セグメント (AIS) およびランビエ節 (NR) で 0.5 S/cm²、樹状突起で 0.005 S/cm² に調整します。有髄セグメントでg_Kとg_Naを0とします。
      4. Na_V およびK_V のイオンチャネルゲーティング速度論を、 補足ファイル2に記載のとおりに構築します。
      5. コンパートメント内のすべてのグルタミン酸作動性シナプスとGABA作動性シナプスの合計としてシナプス電流(I_syn)を導入します。グルタミン酸作動性電流(I_glu)には、高速AMPA受容体媒介電流(I_AMPA)と低速NMDA受容体媒介電流(I_NMDA)の両方を含めます。GABA作動性電流(I_GABA)には、高速のGABA_A受容体媒介電流のみを含めます。シナプス前スパイクごとに一定量のグルタミン酸がシナプスに放出されると仮定します。したがって、受容体の活性化はスパイク時間に依存し(s_AMPAおよびs_NMDA)、総受容体コンダクタンス(g_AMPAおよびg_NMDA)は、すべてのイベントによって放出されるグルタミン酸の量を反映します。
      6. 補足ファイル2で説明されているように、シナプスモデルを使用します。
         注: 方程式の詳細な説明については、モデルで使用される方程式について説明している 補足ファイル 2 を参照してください。
   3. 体細胞と神経突起の実験的に測定された直径、および各神経突起コンパートメントの長さと分岐パターンを以前の文献^46,47から取得します。細胞を複数のコンパートメントに分割することにより、実際のニューロンの形態をマルチコンパートメントモデルに縮小し、主要な分岐構造を正確に保持し、両側の対称性を維持します。
   4. 形態を設定します(セグメントの長さと直径、つまり、d_soma:30μm、l_AH:5μm、d_AH_i:1.5μm、d_AH_f:1.3μm、l_AIS:40μm、d_axon:1μm、l_myseg:100μm、l_NR:2μm、l_AxTer:4μm、d_AxTer:2μm、l_approx:100μm、l_apmed: 100μm;l_apdis:200μm;d_approx_i:4μm;d_approx_f:3μm;d_apmed:2μm;d_apdis:2μm;l_apLM:70μm;d_apLM:2μm;l_nAcDbasal:400μm;d_nAcDbasal:1.4μm;l_nAcDbasal_stem:20μm;d_nAcDbasal_stem:1.5μm)およびPythonスクリプト(補足ファイル3:GABAAvar.py)にも詳述されているように、ピラミッドニューロンモデル^46,47の各コンパートメントの生物物理学的パラメータ(セクション2.3.2で与えられているように)。
   5. ステップ2.1.1で得られた野生型制御測定値を評価することにより、GABA作動性シナプスモデルの生物物理学的パラメータを決定します。
4. ニューロンモデルのトポロジーを設計し、以前に取得した形態学的および分岐情報に基づいて、コンパートメントの空間的配置と相互接続の指定を含む形態学的および生物物理学的パラメータを割り当てます。 補足ファイル3:GABAAvar.py で概説されているように、適切な形態学的パラメータ(セグメントの長さと直径など)と生物物理学的パラメータ(セクション2.3.2)をモデルの各コンパートメントに割り当てます。
5. シナプスの構築と電流注入
   1. 「GABAAvar.py」(補足ファイル3)に記載されているように、SpikeGeneratorGroup(Brian2ライブラリのクラス)を使用してシナプス前アクティビティを作成します。Synapses クラスを使用して、スパイク ジェネレーターをモデル ニューロンのターゲット コンパートメントに接続し、シナプス結合をモデル化します。
   2. 持続定電流(I_inj)を0.85 nAに設定し、 補足ファイル3:GABAAvar.py で概説されているように、特定の時間にベースラインイオン電流負荷によって駆動されるサブスレッショルド活動を模倣するように体細胞に配置します。
6. 記録モニターを構築するには、StateMonitor を使用してターゲット コンパートメントから電圧トレースを記録します。
7. ネットワークを構築して実行します。
   1. Network を使用して、モデル ニューロン、接続、およびモニターを使用してネットワークを構築します。
   2. defaultclock.dt でシミュレーションのタイム ステップを設定します (例: 0.01 ms)。
   3. network.run(T*ms) を使用してネットワーク上でシミュレーションを実行します (この例では T を 1,000 ミリ秒に設定)。
8. GABA_A 受容体ミスセンス変異の影響の検証
   1. ステップ2.1.1で収集した生物物理学的パラメータを通じて、各ミスセンス変異がチャネル動態に与える影響を定義します。
   2. これらのパラメータを変更してスティミュレーションを実行し、"GABAAvar.py"(補足ファイル3)に示されているように"matplotlib.pyplot"を使用して結果をプロットします。
9. パラメータの組み合わせをテストして、発砲パターンと発射率の変化を分析します。比較のために結果をプロットします。

結果

この研究では、てんかんの病態生理学における重要な構成要素である_GABAA 受容体のγ2サブユニットの病原性変異を予測および特徴付けるために、マルチスケールアプローチを利用しています。このアプローチは、予測モデル、分子モデリング、進化保存、構造検査、相関分析、および神経シミュレーションの使用を通じて、てんかん研究やおそらく臨床使用に重要な関連性を持つ変異の分類を強化します。方法論の全体的な要約を 図 1 に示します。

隣接する2つのγ2サブユニット変異の比較評価

GABA_A 受容体サブユニットのてんかん原性変異に隣接する予測された病原性変異が、チャネル機能と神経行動に同様の電気生理学的影響をもたらす可能性があるという仮定に基づいて、まず、よく知られているてんかん原性変異とγ2サブユニットの近位予測変異との関係について簡単な調査を行いました。

病原性として予測された多様体(補足表S6)のうち、A303T(rs1581439874、ClinVarアクセッション:VCV000663033.6)を例として挙げる。アンサンブルモデルによる予測に加え、AlphaMissenseスコアによりA303Tの病原性を確認しました(Supplementary File 4: Supplementary Table S7)。A303Tは、図2に示すように、GABA_A受容体γ2サブユニットの第2膜貫通ドメインに位置し、てんかん原性変異P302L⁴⁰の隣に位置しています。分子モデリングによって評価されたように、γ2P302Lとγ2A303Tの両方の置換は、図3に示すように、より大きな側鎖を持つアミノ酸をもたらしました。γ2P302L変異では変異体残基と野生型残基の両方が非極性であるのに対し、γ2A303T変異体では、変異体残基は極性側鎖を持ち、野生型残基は非極性側鎖を持っています。P302とAla303はどちらも、β3サブユニットとのサブユニット相互作用界面に位置しています(それぞれ7QNBと7QNAで観察)。P302とAla303はどちらも、同等の溶媒アクセス可能な表面積(SASA)を持っています。さらに、両方の残基は脊椎動物の進化のスパン全体で100%保存されています(図4、上段)。GABA_A受容体タンパク質(7QNE²⁶、赤で示されているA303は、このドメインの最初の残基である(図4))の三次元再構成で黄色で示されているように、両者ともγ2サブユニットの第2膜貫通領域(TM2ドメイン)の近接に位置しています。これらの比較可能な特徴に基づき、錐体ニューロンモデルを使用して、γ2サブユニット変異P302L⁴⁰のような近位てんかん原性突然変異のシミュレーションを、予測された変異体(γ2A303T)の神経応答に対する効果の予備的特徴付けに使用することができる。次のステップでは、GABA_A受容体サブユニット内のより広範なバリアントセットに解析を拡大しました。

構造的および生物物理学的パラメータのためのクラスタリングバリアント

前節で隣接する2つの変異の比較評価を行った後、我々は、変異体間で共通の分子的特徴を特定できるかどうかを評価するための体系的なアプローチを実施した。このフェーズは、アミノ酸とバリアント全体の構造的、物理化学的、および生物物理学的特徴に一貫したパターンが現れるかどうかを調査することを目的としており、それによって私たちの最初の仮説をさらに裏付けています。

この研究で使用されたデータ フレームと参照は、補足ファイル 4: 補足表 S8^40、 48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60 ^{に記載されています。} 61,62,63、補足表S9³⁶、および補足表S10³⁵。さらに、構造的および生物物理学的パラメータ間の相関関係は、各サブユニットについて、およびサブユニットの区別なしにすべてのバリアントについて決定された(補足ファイル4:補足表S11、補足表S12、補足表S13、補足表S14、および補足表S15)。構造パラメータ(アルファヘリックス、コイル、ベータシート上の局在化、細胞外ドメイン、細胞内ドメインまたは膜貫通ドメイン、細孔内ライニング、アゴニスト/アロステリック結合、およびタンパク質間相互作用)に関する情報は、Brüngerらから得られた³⁵。生物物理学的パラメータは、ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞のパッチクランプ電気生理学研究から得られました。値は、それぞれの野生型受容体活性化時間(τr)および不活性化時間(τd)定数で正規化されました。

本研究は、GABA_A受容体サブユニットの機能的に同定された変異に隣接または近接するアミノ酸変異体が、これらの変異の場合に観察されるのと同様のチャネル機能における電気生理学的変化のパターンを示す可能性があるという考えに基づいているため、構造的、物理化学的、および生物物理学的パラメータ間の関係の可能性を探りました。膜の中心および細孔軸からの距離に対するバリアントの位置を、図5および図6に示す。これに関連して、AlphaMissense³⁷のスコア(補足ファイル4:補足表S7)も使用しました。高精度なタンパク質構造予測モデル「AlphaFold2⁶⁴」を搭載し、塩基性アミノ酸配列をインプットとして活用できます。AlphaMissenseは、単一アミノ酸置換の構造的側面の手がかりを提供することができます。図 7 に、GABA_A 受容体サブユニット (それぞれ GABRA1、GABRB3、GABRG2 遺伝子によってコードされる α1、β3、γ2 サブユニット) のバリアント位置 (アミノ酸位置、膜中心までの距離、および細孔軸までの距離) に対する既知 (黒) バリアントと予測バリアント (赤) の AlphaMissense スコアの分布を示します。

図7A-Cはアミノ酸位置全体のAlphaMissenseスコア分布を示し、図7D-Fは細孔軸から正規化された距離にわたるAlphaMissenseスコア分布を示し、図7G-Iは膜中心からの距離にわたるAlphaMissenseスコア分布を示しています。図7の相関分析は、新たに同定されたバリアントの結果を予測するために、構造特性を通じて根本的な関係を確認することの難しさを示しました。b2サブユニット(GABRB2遺伝子によってコードされる)バリアントは、より広範な解析を実施できるように、クラスタリングおよび相関セクションに含まれていました。ただし、GABRA1によってコードされるα1サブユニット(図7A、D、G)、GABRB3によってコードされるβ3サブユニット(図7B、E、H)、およびGABRBG2によってコードされるγ2サブユニット(図7C、F、I)のバリアントのみが生物物理学モデルに含まれていました。これは、モデルが海馬錐体ニューロンの機能とGABA_Aのα1β3γ2の組み合わせに焦点を当てているためです受容体サブユニットは、海馬で最も広範な組み合わせである⁶⁵。同様に、α1β3γ2 GABA_A受容体でチャネル動態が研究されていないα1、β3、またはγ2の変異体もシミュレーションから除外されました。本解析では、AlphaMissenseスコアとGABA_A受容体変異の影響から導き出された生物物理学的パラメータ(正規化された活性化および不活性化時間)との間には、軽度の相関(補足図S1および補足図S2)がありました(補足図S1および補足図S8)。このことは、病原性であると予測される突然変異(AlphaMissenseスコアに基づく)が、受容体動態(例えば、活性化および不活性化時間)の測定可能で潜在的に破壊的な変化をもたらす可能性があることを示唆しています。それにもかかわらず、図7の位置相関間に相関関係がないため、隣接するアミノ酸が生物物理学的特性に対して同様の結果をもたらすという考えに基づく仮定にAlphaMissenseスコアを利用することは困難です。

既知の変異体の活性化および不活性化動力学に関する細孔軸までの正規化された距離の分布を 図8 および 図9に示します。γ2サブユニット(図8C)には穏やかな相関があり、隣接するアミノ酸が同様の結果をもたらすという仮定に基づく我々の仮説が、一部の領域、特に受容体チャネルの細孔領域の近接性、TM2ドメインに当てはまる可能性を示唆しています。この領域は、参照してんかん原性変異(図2 および 図4; γ2P302)に隣接しており、神経シミュレーションの比較的優れた候補となっています。これに基づいて、γ2A303T(図2 、 図4)のような隣接する予測変異の影響を大まかに推定することができます。ここで提示する結果は、α1β3γ2の測定のみを考慮しています。したがって、我々のモデルで評価されたバリアントは、 補足ファイル4:補足表S16で示されたバリアントに制約されました。

GABA A受容体を介したCA1錐体ニューロン発火の阻害に対する突然変異の影響

GABA_A 受容体を介した阻害に対する突然変異の影響は、マルチコンパートメントコンダクタンスベースのCA1錐体ニューロンモデルで実証されています。海馬錐体ニューロン機能に対する_GABAA 受容体ミスセンス変異体の影響は、CA3および嗅内皮質(EC)III錐体ニューロンの投影から、ニューロンへの頂端入力のGABA作動性シャントを通じて調査できます。言い換えれば、GABA_A 受容体の活性をシミュレートする1つの方法は、シミュレーションが受容体の生理学的意義についての現実的な仮定を表すコンテキストを仮定することです。たとえば、GABA作動性阻害のメカニズムの1つであるシャント阻害などです。CA1海馬錐体ニューロンは、典型的にはその頂端樹状突起にあり、これらのゾーンにGABA_A 受容体を有しており、CA3およびEC IIIのニューロンからの突起によって標的とされる。したがって、この配置はシミュレーションに適しています。このリサーチ課題では、遅延と強度が異なる入力設計が必要です。そこで、 図10に示すように、3種類のグルタミン酸作動性シナプス(GluS1/2/3)を遠位頂端樹状突起、内側頂端樹状突起、基底樹状突起に置き、順次活性化しました。シナプス入力の影響を評価するには、定電流振幅を最小スパイクトリガー閾値(I_inj < I_min)未満に維持する必要があります。野生型または変異型のGABA_A 受容体のいずれかを有する錐体ニューロンモデルは、体細胞に0.85nAの定電流注入により開始された。次に、GABA作動性シナプスを体細胞に配置しました。スパイクジェネレーターによって模倣されたシナプス前活動は、最初に遠位頂端樹状突起で開始されました。内側頂端と基底樹状突起のシナプス入力は、それぞれ25ミリ秒と50ミリ秒遅れました。GABA作動性シナプスは40ミリ秒の遅延で活性化されました。GABA作動性阻害強度は、最初のスパイクを除く全スパイク列が阻害されるように調整されました。次に、この設定でバリアントの影響を、τ_rise 、τ_deactivation、および g_GABAA を変化させることによって調査します。

野生型および変異型受容体のパラメータは、特に海馬錐体ニューロン⁶⁵において最も豊富なサブユニット組成であるα1β3γ2で構成される受容体について、プロトコルステップ2.1.1に記載されているコレクションから得られた。パラメータの分布は、 補足ファイル 4: 補足表 S16 に示されています。

各サブユニット変異は、単一、二重、および三重のグルタミン酸作動性シナプスの症例で試験された。簡単なアプローチで、突然変異の影響を発火率とパターンで評価できます。Δt_ISIの平均と標準偏差は、発射パターンの変化をさらに測定するためにも推定でき、Δt_ISIはスパイク間間隔の変化を表します。各ケースの結果は、付記ファイル4:補遺表S17および付記図S3に発火率とΔt_ISI(平均および標準偏差)として示されています。点火パターンを変更したバリアントのスパイク列と電圧トレースを図11、図12、および図13に示します。

単一(GluS1)およびトリプル(GluS1-2-3)のグルタミン酸作動性シナプス活性化の場合、ニューロン応答を変化させる変異は、₃つのN110Dおよびγ2K328M変異βのみであった。グルタミン酸作動性単回入力ケースでは、β3N110Dが阻害阻害につながり、発火パターンは4^回目の シナプス前スパイクの後、グルタミン酸作動性スパイク列に短い遅延でロックされました(図11)。γ2K328Mも、シナプス前スパイクの5^番目 付近ではあるものの、阻害を損ない、β3N110Dと比較してシナプス後スパイクに大きな遅延をもたらしました(図11)。GluS1-2-3の活性化ケース(図13)では、β3N110D変異とγ2K328M変異の間で応答は同様でした。両方の変異体は、蓄積されたシナプス前スパイクのほぼすべてが検出され、応答を引き起こす発火パターンをもたらしました。どちらの場合も、ニューロンモデルはシナプス前活動に応答してスパイクペアで発火しました。

グルタミン酸作動性シナプスの二重活性化は、他の2つの設定と比較して異なる結果をもたらしました(図12)。この場合、GABA_A 受容体b3サブユニットの2つの変異(β3N110Dおよびβ3T288N)とGABA_A 受容体γ2サブユニットの2つの変異(γ2P302Lおよびγ2K328M)がGABA作動性阻害を損なった。γ2P302L変異体を用いたニューロンモデルは、GluS2とほぼ同期して発火し、これはGluS1に対する応答が遅延した可能性が高く、GluS1-2間のシナプス前スパイクの遅延とほぼ同じであった。β3T288N変異も同様の結果をもたらしましたが、2番目のスパイクの区別は依然としてGluS2と同期しています。β₃N110D変異体を持つニューロンモデルは、GluS1/2の最初の2つのシナプス前スパイクを除いて、ほとんどすべての累積グルタミン酸作動性入力に応答_{しました。}γ2K328Mの発火パターンは、β3N110Dと同様であったが、第2と第3のシナプス前スパイクの区別が欠落していた。

これらの結果は、b3サブユニット( GABRB3 遺伝子によってコードされる)およびγ2サブユニット( GABRG2によってコードされる)変異が海馬錐体ニューロンの活動に及ぼす多様な影響を示しています。興味深いことに、_{3 つの}L170R、β₃つの A305V、β₃つの E180G、β₃つの D120N、β₃つの Y302C、γ₂R82Q β突然変異は、神経活動に変化をもたらさなかった。阻害の最も深刻な障害は、β₃N110Dおよびγ2K328Mであり、どちらもτ_不活性化 が有意に低く、τ_上昇が高かった。また、私たちの予備的な分析では、τ_上昇 またはg_GABAA の変化だけでは阻害を損なうのに十分ではないことが示されました(データは示されていません)。τ上昇の増加とともにτ_{の不活性化}の有意な減少につながる突然変異は、GABA作動性阻害のより重大な_{障害につながると}主張することができます。

すべての興奮性入力を抑制しなければならない場合、発火をもたらす突然変異は、異常で非特異的な神経応答をもたらし、同じ突然変異を持つニューロンで構成される神経回路で誇張される可能性があります。ニューラルネットワークにおける興奮/抑制のバランスは、あらゆるネットワーク活動の重要な要素である阻害フィードバックの障害によって大きく影響を受ける可能性があります。

図1:臨床および研究目的におけるバリアント効果の予測と解析の概要、特に in silico 解析と神経応答シミュレーションに焦点を当てています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:γ2A303Tの位置と選択された患者の変異。ニューラル シミュレーションに使用される γ2P302L と γ2K328L。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:患者変異γ2P302Lと病原性として予測された隣接する変異体γ2L(A303T)の比較モデリング。 どちらのモデルでも、緑は野生型を表し、赤は変異体残基を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:複数の配列のアラインメントと構造的な洞察。 上面パネルは、TM2の端にある患者変異(P302L)(紫色)の位置にある残基と、γ2サブユニットのTM2の冒頭にある病原性多様体A303T(赤色)の位置にある残基の進化的保存を示しています。下のパネルは、(A)三次元GABA_A 受容体構造(7QNE)のこれらの保存された残基の視覚化を示しています。γ2 サブユニット(7QNEの鎖C)は黄色で、さまざまな角度(A、B)で示されています。略語:TM2 = 2番目の膜貫通ドメイン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:含まれるすべてのバリアントのローカリゼーション。 既知(黒)および予測(赤)変異体の、(A)細孔軸からの正規化された距離および(B)膜中心からの距離に対する位置が示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:各サブユニットのバリアントのローカリゼーション。 細孔軸からの(A、C、E)正規化距離および膜中心からの(B、D、F)距離に対する既知(黒)および予測(赤)変異体の位置が示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:バリアントの場所に対するAlphaMissenseスコアの分布。 (A-C)既知(黒)および予測(赤)バリアントについて、アミノ酸位置、(D-F)細孔軸からの正規化距離、および(G-I)膜中心からの距離に対するAlphaMissenseスコア分布を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:α1(GABRA1)サブユニット、β3(GABRB3)サブユニット、およびγ2(GABRG2)サブユニットに変異があるGABA_A受容体の正規化活性化時間。(A)α1、(B)β3、および(C)γ2サブユニットの各突然変異について、細孔軸からの正規化距離に関して実験的に得られた活性化時定数が表示されます。値は、それぞれの野生型受容体活性化時間で正規化されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:GABA _A受容体のα1(GABRA1)サブユニット、GABA _A受容体のβ3(GABRB3)サブユニット、およびγ2(GABRG2)サブユニットに変異があるGABA_A受容体の正規化された不活性化時間。(A)α1、(B)β3、および(C)γ2サブユニットの各突然変異について、細孔軸からの正規化距離に関して実験的に得られた不活性化時定数が表示されます。値は、それぞれの野生型受容体の不活性化時間で正規化されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図10:CA1錐体ニューロンモデル。 モデルニューロンは、(1)体細胞、(2)近位、内側、遠位のコンパートメントを持つ頂端樹状突起で構成され、分子薄層で2つの枝で終わります、(3)短い基底樹状突起茎の後に2つのセクションに分岐する対称的に構成された2つの基底樹状突起、および(4)円錐形の軸索ヒロックで始まり、その後に円筒形の軸索初期セグメントが続く軸索、 有髄セグメント、およびランビエのノードで、球形の軸索終末で終わります。緑の三角形はグルタミン酸作動性シナプスの位置を示し、赤い三角形は体細胞にあるGABA作動性シナプスを表しています。スケールバー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図11:GluS1活性のみの燃焼パターン。 シナプス前ニューロン(GluS1(緑の三角形)とGABA作動性(赤丸))と野生型または変異型のGABA_A 受容体を持つシナプス後ニューロン(黒四角)のスパイクトレインが上段に示されています。野生型GABA_A 受容体を有するニューロン(GABA作動性阻害の有無にかかわらず)、およびGABA作動性阻害を有する変異型GABA_A 受容体を有するニューロンの個々の電圧トレースが下部パネルに表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図12:GluS1とGluS2の活性のみの燃焼パターン。 シナプス前ニューロン(GluS1/2(緑の三角形)とGABA作動性(赤丸))と野生型または変異型のGABA_A 受容体を持つシナプス後ニューロン(黒四角)のスパイクトレインが上段に示されています。野生型GABA_A 受容体を有するニューロン(GABA作動性阻害の有無にかかわらず)、およびGABA作動性阻害を有する変異型GABA_A 受容体を有するニューロンの個々の電圧トレースが下部パネルに表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図13:GluS1、GluS2、GluS3活性のみの燃焼パターン。 上段には、シナプス前ニューロン(GluS1/2/3(緑の三角形)とGABA作動性(赤丸))のスパイクトレインと、野生型または変異型のGABA_A 受容体を持つシナプス後ニューロン(黒四角)が示されています。野生型GABA_A 受容体を有するニューロン(GABA作動性阻害の有無にかかわらず)、およびGABA作動性阻害を有する変異型GABA_A 受容体を有するニューロンの個々の電圧トレースが下部パネルに表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:AlphaMissenseスコアと生物物理学的パラメータの分布(正規化された非アクティブ化時間;本研究で選択された_GABAA 受容体サブユニット変異の正規化されたτd)。補足ファイル4:補足表8も参照してください。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:AlphaMissenseスコアと生物物理学的パラメータの分布(正規化された活性化時間;本研究で選択された_GABAA受容体サブユニット変異の正規化τr)。補足ファイル4:補足表8. も参照してください。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S3:野生型および変異型GABA_A 受容体による神経応答のスパイク間間隔。 一番上のプロットは、単一のグルタミン酸作動性入力のスパイク間時間間隔を示しています。中央のプロットは2つ、一番下のプロットは3つのグルタミン酸作動性シナプスが同時に活性化していることを示しています この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 

補足ファイル1:ファイル「Data_GABAA.R" は、データフォーマットのために R で実行するために必要です。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:コンダクタンスベースモデルの設計に用いる方程式。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:ニューラルシミュレーションのためにBrian2で実行するために必要な GABAAvar.py。 このファイルには、Brian2 ベースのマルチコンパートメント ニューロン モデル (関数: CA1_Pyr)、コンダクタンスベースのニューロンおよびシナプス モデルの方程式 (関数: model_eqns、syn_eqns)、および初期パラメーター (関数: biophys_param、morpho_param、syn_param) の Python コードが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 4: すべての補足テーブルを含む zip フォルダー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S1: GABRG2 遺伝子における意義不明のミスセンス変異体をClinVarから.txtファイルとしてダウンロードし、その後「data.xlxs」として保存。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S2:研究で使用された配列の識別子、目的遺伝子の参照転写産物(NCBI Ref. seq.)、および異なるデータベース間でのその他の対応する識別子)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S3:構造領域と機能領域の位置。 参照転写産物(NM_198904.4)によってコードされるγ2サブユニットタンパク質(NCBI参照配列:NP_944494.1)の特定の領域の位置 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S4:「GRCh38Chromosome」、「GRCh38Location」、「Name」、「Protein change」の列のみを含むGABRG2のClinVarデータを表すファイル「data1.xlxs」の内容。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 S5: バリアント効果予測のために dbNSFP サーバーにアップロードする GABRG2 データのミスセンス バリアントの必要な書式設定を含む "data1_output.xlsx" ファイルの内容。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 S6: GABRG2 の未知のミスセンス変異体の変異影響予測のための dbNSFP サーバーからの出力を含む "data2.xlsx" ファイルの内容。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S7:GABA_A受容体サブユニットバリアントのAlphaMissenseスコア。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S8:変異体の生物物理学的特性。 生物物理学的パラメータの値は、電気生理学実験による以前の研究から得られたものです。変異体は「S」(置換)タイプでラベル付けされますが、野生型受容体パラメータは置換ごとに与えられ、「C」(コントロール)でラベル付けされます。τ_d : 非活性化時定数、P_Open : 開放確率、g_GABA: 受容体コンダクタンス、I_max: 最大電流、τ_r : 活性化時定数 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S9:バリアントの物理化学的特性。 生物物理学的パラメータを持つ以前に同定された変異体は「S」(置換)タイプでラベル付けされますが、予測された変異体は「P」で表されます。H:疎水性の変化、VSC:側鎖の体積の変化、P1:極性の変化、P2:分極の変化、SASA:溶媒アクセス表面の変化、NCISC:正味電荷指数の変化。値は、Guo et ^al.36 から各元のアミノ酸および変異体について取得され、各パラメータの変化は与えられたとおりに推定されます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S10:バリアントの構造特性。 生物物理学的パラメータを持つ以前に同定された変異体は「S」(置換)タイプでラベル付けされ、予測された変異体は「P」で表されます。ドメイン内のバリアントのローカリゼーションは 1 で表され、それ以外の場合は 0 で表されます。すべての値はBrüngerらから取得されます³⁵。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S11:すべての既知のバリアントの構造的および生物物理学的パラメータ相関。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

 補足表S12:既知のGABRA1変異体の構造的、物理化学的、および生物物理学的パラメータ相関。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S13:既知のGABRB2変異体の構造的、物理化学的、および生物物理学的パラメータ相関。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S14:既知のGABRB3変異体の構造的、物理化学的、および生物物理学的パラメータ相関。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S15:既知のGABRG2変異体の構造的、物理化学的、および生物物理学的パラメータ相関。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S16:野生型および変異型α1β3γ2 GABA_A受容体の生物物理学的パラメータ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S17:野生型および変異型GABA_A 受容体を有する単一、二重、または三重のグルタミン酸作動性シナプスに対する発火率およびスパイク間間隔。  この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この論文で紹介したアプローチは、計算遺伝学、分子モデリング、神経シミュレーションの組み合わせを適用することで、GABA_A受容体変異体の分類を改善する可能性を秘めており、てんかん研究と臨床応用の両方に貴重な洞察を提供します。予測される病原性変異の同定と優先順位付けのための包括的な分析が提示され、タンパク質に対するバリアント効果と細胞表現型との間のギャップを埋める可能性のあるフレームワークに拡張されます。てんかん原性GABA_A受容体活性が海馬錐体ニューロンシミュレーションに与える影響を評価することで、GABA_A受容体機能障害に関連するin vitro表現型の再現と、ネットワーク機能障害の根本における単一ニューロン応答変化の実証が可能になります。てんかん原性突然変異によって生成される神経応答のこれらのシミュレーションに基づいて、構造的に近位に予測された突然変異の機能的影響の大まかな推定が検討されました。予測された突然変異がチャネル動態に及ぼす影響を予測するには、既知のバリアントセットによる徹底的な解析が必要です。この論文で紹介したような比較分析と神経活動シミュレーションは、タンパク質機能と神経病理学に対する変異体の影響に焦点を当てた予測モデルのさらなる生成と改善に重要な洞察を提供します。さらに、私たちの方法論を使用して、未知のバリアントの中で最も病原性の高いバリアントを選択して優先順位付けし、GABA_A受容体関連の神経発達障害に関連するバリアントの影響を調べることができます。例えば、蛍光プローブ^{66、67、68、69、70}でタグ付けされ、予測された突然変異を持つ受容体サブユニットは、in vitroで発現させて、それらの輸送、細胞表面発現、および神経生理学を研究することができます。さらに、C.エレガンスなどの動物モデルは、予測された突然変異の影響を検証するために考慮される場合があります。例えば、CRISPR-Cas9遺伝子編集は、C.エレガンスGABA_A受容体であるunc-49の欠失を生成するために使用され、したがって、unc-49またはヒトGABA_A受容体^のサブユニットにホモ接合性てんかん関連変異を生じさせる。

一般に、変異体の分類は、ACMG-AMP¹²で推奨されているように、複数のレベルの計算証拠の使用から恩恵を受ける。このアプローチは、さまざまな予測ツールとデータソースを統合することでバリアント分類の信頼性を強化し、最終的に臨床評価の精度を高め、ゲノム診断における全体的な意思決定プロセスを改善します。私たちの方法論では、複数のツールの予測を組み合わせるアンサンブル予測子を利用することで、複数の計算証拠の要件を満たし、異なるツールを別々に使用する必要がなくなることが利点です。また、このアプローチは、個々のツールからの異なる出力を処理するという課題を克服するため、予測プロセスが合理化され、効率が向上します。それにもかかわらず、遺伝子中心またはバリアント特異的な解析の予測精度に関する保証はありません。このことから、遺伝子中心または変異特異的な予測は、特定の状況と目標に合わせて調整された特定の条件下で実行されるべきであるという結論が導かれる15,72,73,74。臨床介入のためには、特定の疾患の状況における特定の遺伝子または遺伝子のサブセットに対するin silicoツールの予測精度の評価が必要であり、多くの場合、個別化された最適化⁷⁵。ただし、予測精度の評価は、多くの場合、十分な数のバリアントがないために制限され、精度評価の信頼性に影響を与える可能性があります。

文献にはさまざまなツールがあり、その精度はデータセット¹⁴でテストおよび検証されています。ただし、大規模なデータセットに基づくこれらの精度の結果は、特定の遺伝子のいくつかの未知のバリアントの予測に必ずしも反映されるわけではありません。この文脈では、蓄積された文献は、個々の予測変数の結果をコンパイルし計算するアンサンブル予測変数が、個々の予測変数^33,76,77,78の一致よりも優れたパフォーマンスを発揮することが知られていることを示唆しており、したがって、本研究では、アンサンブル予測変数、すなわちBayesDEL33およびClinPred32を特にその優れたパフォーマンス³²に使用することを選択した^。34 BayesDELは、電位依存性ナトリウムチャネルαサブユニット5(SCN5A)などの膜貫通タンパク質をコードする遺伝子を含む、臨床的に関連する遺伝子の4,094のミスセンスバリアントについて比較評価され、優れたパフォーマンスを示しました³³。バリアント効果予測プロトコルでは、最初のステップとして、2つのアンサンブル予測変数(BayesDELとClinPred)からのコンセンサスを考慮しました。Google DeepMindが開発した深層学習モデル「AlphaMissense³⁷」は、AlphaFold ^64,79を拡張したもので、高精度なタンパク質構造予測の力を活用しています。アンサンブルモデル(プロトコールステップ1.3に記載のBayesDELおよびClinPred)の初期予測結果とAlphaMissenseの結果を比較したところ、予測は互いに部分的に一致しており(補足ファイル4:補足表S15)、アンサンブルモデル(BayesDELおよびClinPred)の予測と完全に一致しておらず、病原性または疾患関連性のコンセンサスに達しました。 ピンク色の行で示されています(補足ファイル4:補足表S15)。しかし、我々のニューロンモデルで用い、ClinPredとBayesDELの両方で病原性が予測されたGABRG2変異R82Q、P302L、K328Mの近傍にある未知の変異体(L81F、A303T、V329F)は、黄色のハイライトで示されているように、AlphaMissenseでも病原性が予測されていました(Supplementary File 4:Supplementary Table S15)。

AlphaMissense²⁹は配列と構造的文脈予測を使用しているため、私たちの研究では、AlphaMissenseスコアとGABA_A 受容体変異位置との間に何らかの関連性があるかどうかも確認したいと考えました。私たちの仮説は、機能的に同定されたGABA_A 受容体サブユニットの変異に隣接または近接するアミノ酸変異の機能的影響が、突然変異の場合に観察されるチャネル機能に同様の物理化学的変化のパターンを示す可能性があるという考えに基づいています。GABA_A 受容体サブユニットの変異位置とAlphaMissenseスコアとの相関関係は、GABA_A 受容体サブユニットにおける新規ミスセンス変異体の機能的影響を予測することを可能にする仮説のフレームワークを構築するための使用可能な関係を特定するのに役立ちます。しかし、AlphaMissenseのスコアは、これらの生物物理学的パラメータの変化を予測するものではありませんでした(図7)。私たちの分析ではサンプルサイズが限られているため、決定的な結論を導き出すのが難しいことに注意することが重要です。しかし、私たちの分析では、AlphaMissenseスコアはGABA_A 受容体の構造パラメータと相関していないことがわかりました。明確な位置相関関係(例えば、突然変異の位置とAlphaMissenseスコアとの間)の欠如は、私たちの仮定の妥当性に疑問を投げかけます。隣接する残基が本当に同様の効果を持っていたとしたら、より明確な相関関係が見られることが期待されます。そうではないため、AlphaMissenseスコアを仮定をテストするための信頼できるツールとして使用する能力が弱まります。

興味深いことに、私たちの研究では、 GABRG2 遺伝子変異体のバリアントから細孔軸までの距離と正規化されたチャネル活性化時間との間に穏やかな相関関係があることを発見しました。したがって、隣接するアミノ酸が同様の結果をもたらすという我々の予備的な仮定は、細孔内の領域やゲーティングに関与する主要な部位など、チャネルの一部の領域では当てはまるかもしれないが、他の領域ではそれほど明確ではないかもしれない。データセットが小さいため、この変動性を識別する能力は限られていますが、将来のデータやより詳細な構造解析は、仮説のこの側面を洗練するのに役立つ可能性があります。分子動力学シミュレーション⁸⁰ は、特に、我々の研究で行われた2つの隣接するγ2サブユニット変異、すなわちてんかん原性変異γ2P302L⁴⁰ および近位予測変異γ2A303T(rs1581439874)の比較評価の文脈において、これらの予備的知見をさらに調査するための強力な補完的アプローチとして役立つ可能性がある。将来的には、このアプローチにより、特に私たちの研究で提示された神経シミュレーションと統合した場合、未知の変異が細胞表現型に与える影響をより正確に推定できるようになる可能性があります。

さらに、GABA_A 受容体サブユニットの構造的および物理化学的特性を他の特徴とともに使用して、チャネル、ニューロン、ネットワーク、および疾患の表現型に対する新しい変異体の影響の機能予測のための強力な機械学習モデルをトレーニングできるかどうかを調査することは興味深いでしょう。自動化された機械学習アプローチの出現により、私たちは、医師やウェットラボの科学者も、より民主化された環境で独自のモデルを開発できる地点に到達しました⁸¹。したがって、これらの技術を臨床診療に統合することで、プロセスが合理化され、個別化医療がより身近なものになり、機能的変異解析のための高度に専門化された専門知識への依存を減らすことができる可能性があります。この文脈で、私たちのアプローチは、受容体の構造的および機能的ダイナミクスに関する洞察を提供し、バリアント効果の機能予測のための将来の研究に役立つ可能性があります。

現在のタンパク質構造予測の進歩とAlphaFold⁶⁴に代表されるブレークスルーにもかかわらず、突然変異の影響とタンパク質機能の正確な予測は、モデル⁷⁹のトレーニングに必要なデータが不足しているため、依然として課題となっています。バリアント効果の予測については、AlphaMissenseは予測モデルのサブセットと比較して高いパフォーマンスを示していますが、私たちの研究で使用されたアンサンブル予測変数BayesDEL²⁵ およびClinPred²⁴は、この比較に含まれていませんでした²⁹。私たちの研究では、BayesDEL、ClinPred、およびAlphaMissenseのin silicoツールが別々の目的で使用されていたことに注意することが重要です。アンサンブル予測変数であるBayesDELとClinPredは、主に病原性の予測に使用されましたが、AlphaMissenseは、そのスコアとγ2サブユニットの突然変異の影響に関する既知のデータとの関係を調査するために特に使用されました。具体的には、私たちの仮説は、予測された病原性変異、特にGABA_A 受容体サブユニットの機能的に同定された変異の近くまたは隣接に位置する変異は、機能的に特徴付けられた変異で観察されるものと同様の生物物理学的パラメータを示すと仮定しています。これを調査するために、AlphaMissenseを選んだのは、基本的なペプチド配列を利用して単一アミノ酸置換の結果を予測する高精度のAlphaFold2⁶⁴ モデルを搭載しているという事実によるものです。

したがって、私たちの研究の大きな制限は、主に実験データの限られた利用可能性によって引き起こされています。例えば、私たちのニューロンモデルは、GABA_A 受容体のα1β3γ2サブユニットの組み合わせから得られるデータの発現に基づいており、これにより、文献で研究された突然変異は、この特定の受容体の組み合わせの一部として発現されるサブユニットに本質的に制限されます。さらに、HEK細胞におけるこれらのサブユニットの発現のみに由来する電気生理学的データに依存していたため、文献で利用可能なデータの範囲がさらに狭まりました。未知の変異体の影響を推定するためのニューラルモデリングの使用は、既知の変異のすぐ近くに位置する未知の変異体(ワークフローでは病原性として予測される)が、文献に記載されている突然変異効果のチャネル速度論パラメータまたは物理化学的特性において同様のパターンを示すと仮定しています。この仮定は、HEK293細胞の特定の受容体集合体に関する電気生理学的データの必要性と相まって、モデリングに利用できる実験データの量を減らします。これらの制約の結果として、利用可能なデータでは、α1β3γ2サブユニットの限られた数のバリアントのみをモデル化することができました。しかし、α1β2γ2サブユニットの組み合わせ、α1β2δ、α4β3δサブユニットの組み合わせなど、サブユニット特異的な細胞レベル、回路レベル、ネットワークレベルに影響を与えるさまざまなサブユニットアセンブリのニューロンモデルを学習すると、さまざまなてんかんタイプや神経発達障害に幅広く適用できる可能性があります。将来的には、利用可能な電気生理学的データの増加と、明確に定義された受容体集合体と特定の細胞タイプの突然変異に焦点を当てた研究により、私たちのアプローチの一般化可能性と精度を高めることが可能になるかもしれません。

マルチコンパートメントコンダクタンスベースのニューロンモデルは、単一ニューロン応答の受容体バリアントの機能的意義を予測するための強力なツールを提供します。このツールは、細胞/シナプスパラメータとその位置の両方を柔軟に定義し、特定の質問をテストできます。このプロトコルで使用される単純なスパイクジェネレータは、他のニューロンモデルに置き換えて、マイクロ回路の活動を研究することができます。このプロトコルの重要なステップは、最も制限的なステップでもあります。これは、チャネル動態の変化に関する任意の受容体バリアントの定義です。必要な情報は、理想的にはパッチクランプ電気生理学研究によって提供されます。しかし、臨床的意義が予測されるアミノ酸置換物の計算解析や、既知の置換物との比較も、ある程度の洞察を提供することができる。私たちの研究と記述されたプロトコルは、予測ツールとしてではなく、単一ニューロン活動に対する_GABAA 受容体の生物物理学的特性の変化の結果についてより広い見通しをサポートするための突然変異の影響を調査するツールとして、神経活動シミュレーションの使用を組み込んでいます。ニューラルシミュレーションにおける実験データへの依存性は、私たちのアプローチにおける重要な制限であり、構造と機能の間のギャップを埋めるために高度な分子モデリングの恩恵を受ける可能性があります。

私たちのプロトコルでは、特定のステップを批判的に評価する必要があります。まず、プロトコルの最初の部分で使用される予測モデルの選択が重要になる場合があります。インシリコツールの選択は、強力な予測のための十分な複数行の計算証拠の生成など、いくつかの要因に依存する¹²。複数の予測アルゴリズムの分析を統合したアンサンブル予測子は、この推奨事項により適合するため、個々の予測子よりも好まれます。さまざまな予測変数があり、その精度は通常、大規模なデータセットでテストされますが、特定の遺伝子に位置する未知のバリアント効果に使用される予測モデルの精度を必ずしも保証するものではありません。これは、複数の予測子から予測結果を収集して計算する 2 つのアンサンブル モデルを使用して補正されます。さらに、予測モデルのカットオフは、目的が最も病原性の高い多様体を特定することを主な目的としている場合、特異性を高めるために調整される場合があります。適切なカットオフを設定することは、感度と特異性の間のトレードオフのバランスを取り、バリアントの正確な分類を確保するために重要です。私たちの研究では、デフォルトのカットオフを使用しました。特に、病原性である可能性が高い変異体を捕捉することを優先してカットオフを変更しませんでした。これは、ワークフローで説明されているように、分析の複数のレベルで調査する変異の範囲が減少するためです。また、目的のタンパク質の三次元再構成のための構造データを選択する際には、文献中の構造データの予備的なレビューが必要であることに注意することも重要です。GABA_A受容体の構造検査は、最近、さまざまな条件での異なる受容体集合体の三次元構造を報告する堅牢な構造研究で勢いを増しています^{26,27,82,83,84,85}。これらのデータが利用可能であることから、本研究では、構造データの再構成のために実験的に決定された構造に着目しました。しかし、AlphaFold⁶⁴の予測は、そのような実験的に決定されたデータが不足している他のタンパク質の分析に有利かもしれません。実験的研究から得られた構造データについては、アミノ酸の番号付けに注意を払うことが重要です。アミノ酸のPDB番号付けは、UniProtの番号付けとは異なる場合があります。これは、前者にはタンパク質の成熟中に除去されるシグナルペプチドが含まれていない場合があるためです。また、実験系で発現するキメラタンパク質は、不一致を引き起こす可能性があります。この場合、構造データから導出された配列と対象の配列のペアワイズアラインメントは、一貫性を保つのに役立ちます。文献では、γ2サブユニットタンパク質の構造データは、電子顕微鏡(EM)などの実験方法やAlphaFoldの高精度予測方法など、さまざまな方法に基づいています。実験法が目的の配列を高分解能で完全にカバーしていない場合は、AlphaFold予測を使用することができます。本研究では、ヒト全長シナプスα1β3γ2 GABA_A受容体の極低温電子顕微鏡構造に対応するため、7QNE²⁶という構造を選択した。これはまさに、本研究の焦点であった完全長サブユニットの組み合わせを表しています。

さらに、比較解析では、チャネル動態の正規化されたパラメータの使用が好ましいはずです。これらのパラメータの値は、受容体サブユニットの組成や実験設定によって異なる可能性があるためです。たとえば、τ_{の立ち上がり} と τ_{の不活性化} は、野生型の制御値に対する x 倍の変化で決定する必要があります。プロトコルステップ2.5では、既知のバリアントの数が少ない場合、パラメトリックまたはカテゴリカル相関分析とrho値とp値の決定が望ましい場合があります。理想的には、主成分分析などの方法により、より正確な関係が得られることが期待されますが、より多くのサンプルが必要になります。

シミュレーション環境は変更することができます。この研究では、Brian2が好まれた理由は、Brian2の空間ニューロンクラスが神経活動をシミュレートするための貴重なツールを提供することです。Brian2 は、事前定義された「ブラックボックス」モデルに頼るのではなく、微分方程式を使用して連続ダイナミクスを記述し、離散イベントの更新ステートメントを記述することに大きな利点があり、これにより、モデルのすべての側面を 1 つの Python スクリプトで明示的に定義でき、モデル方程式は数学的表記で記述され、Brian 固有の語彙はごくわずかしか使用されないため、優れたコードの可読性と適応性につながります³⁷.モデルが明示的に記述されているため、すべての特徴が文書化され、一次シミュレーション記述ファイルで見つけることができ、Stimbergらの研究で述べられているように、以前は依存していた「ブラックボックス」モデルが不要になります^45,86。

現在のニューロンモデルは、Na⁺、K⁺、およびリーク電流を含む修正ホジキン・ハクスリー型コンダクタンス⁴⁶を利用しています。このコンダクタンスベースのモデルは、Ca²⁺チャンネルなど、他のいくつかのチャンネルタイプを含めることでさらに拡張できます。シナプスモデルの場合、これらのパラメータは特定のサブユニット組成に対して取得する必要があり、これらの組成で測定されたパラメータを持つバリアントのみを評価する必要があることに注意することが重要です。この研究では、α1β3γ2受容体組成が選択されました。したがって、α1β3γ2 GABA_A受容体で測定されたチャネル速度論パラメータを持つα1、β3、またはγ2の変異体のみが含まれた。

細胞生物物理学の推定には、細胞を複数の円筒形のコンパートメントに分割することが含まれ、それぞれが異なる導電特性を持つ可能性があります。ニューロンの樹状突起には不規則性がありますが、それらは局所的に均質な鎖と見なすことができます。このようなモデルは、細胞の複雑な構造と機能を理解するのに役立ちます。モデル設計は、これらの特徴を反映できる実際の形態の簡略化されたバージョンに焦点を当てています。

変化したアミノ酸の位置と物理化学的特性が、チャネル速度への影響を決定します。例えば、アミノ酸置換によって側鎖の大きいアミノ酸が得られると、チャネルの細孔を覆うアミノ酸にこの変化が起こると、チャネルのコンダクタンスが減少します。置換は、チャネルの開始/終了にも影響を与える可能性があります。このモデルでは簡単にするために、GABA結合速度は利用可能な受容体の比率にのみ減少します。しかし、この相互作用を含むようにより詳細なモデルを設計して、リガンド結合親和性を変化させる置換の可能な影響を研究することができます。

結論として、本研究では、計算手法を用いてGABA_A 受容体サブユニットの病原性変異を予測し、海馬錐体ニューロンモデルにおけるてんかん関連変異のシミュレーションに基づいて可能な細胞表現型を定性的に推定する。私たちの知る限り、これは、DNAからタンパク質機能、神経行動まで、複数の複雑さのレベルにわたって遺伝的変異がGABA_A 受容体の機能障害にどのように寄与するかを評価するために、計算遺伝学、分子モデリング、および神経シミュレーションの組み合わせアプリケーションを探求する最初のプロトコルです。このプロトコルは、てんかんにおける潜在的に有害な変異体および関連する神経病理の推定を改善するための基礎を提供することができます。さらに、他のチャネル障害の研究に利用できる可能性があり、関連する神経発達障害やネットワーク障害の根底にあるメカニズムに重要な洞察をもたらします。これに基づいて、GABA_A 受容体の構造的および物理化学的評価を組み込んで、変異体の機能的影響とGABA_A 受容体のチャネル動態への統合を調べることで、将来、より正確な分析を開発できます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brian2	Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, France; Imperial College London, United Kingdom	2.8.0.4	Stimberg et al., 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
dbNSFP server	Genos Bioinformatics LLC, USA	v3.0	Liu et al., 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
HOPE	Centre for Molecular and Biomolecular Informatics CMBI, Radboud University, Netherlands	1.1.1	Venselaar et al., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
Jalview	University of Dundee, UK	JV2	Waterhouse et al., 2009 (https://www.jalview.org/)
Jupyter Notebook	Project Jupyter, USA		https://jupyter.org/install
Phyton	Python Software Foundation, USA	3.13	https://www.python.org/downloads/
Protter	ETH Zurich, Switzerland	Version 1.0	Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R	The R Foundation for Statistical Computing, USA	R version 4.3.2	https://www.r-project.org/
RStudio	Posit software, PBC, USA	RStudio 2023.12.1+402 "Ocean Storm" Release	https://posit.co/downloads/