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Résumé

Cette étude introduit un cadre multi-échelle, allant de l’ADN à la fonction des protéines et au comportement neuronal. Il présente une nouvelle approche pour étudier les mutations pathogènes prédites dans la sous-unité du récepteur GABAA , en émettant l’hypothèse que les mutations épileptogènes et les mutations proximales, prédites comme pathogènes, peuvent produire des effets similaires sur le modèle de neurone pyramidal CA1.

Résumé

Comprendre les effets de variantes fonctionnellement inconnues dans les gènes associés à l’épilepsie est crucial pour élucider la physiopathologie de la maladie et développer des thérapies personnalisées. Avec un cadre multi-échelle, allant de la séquence d’ADN à la fonction des protéines et au comportement neuronal, nous décrivons une nouvelle approche pour prédire et étudier les mutations pathogènes, en émettant l’hypothèse que les mutations épileptogènes dans la sous-unité du récepteur GABAA et les mutations prédites à proximité peuvent produire des effets similaires sur le modèle de neurone pyramidal CA1. En explorant les relations caractéristiques entre les mutations pathogènes prédites et les mutations épileptogènes proximales, l’étude vise à estimer les effets des mutations prédites sur la base des effets des mutations épileptogènes sur les simulations de neurones pyramidaux de l’hippocampe.

La méthodologie commence par la collecte des données génétiques des sous-unités du récepteur GABAA γ2, suivie d’un nettoyage et d’un formatage des données effectués en R à l’aide d’un script personnalisé. Ensuite, des prédicteurs d’ensemble seront appliqués pour identifier et hiérarchiser les variants faux-sens pathogènes de la sous-unité γ2 . La cartographie d’un variant pathogène spécifique (prédit) aux domaines structurels des sous-unités partagées par les mutations épileptogènes sera illustrée, accompagnée d’une modélisation moléculaire de leurs effets et d’une prise en compte de la conservation évolutive. Ensuite, une méta-analyse spécifique aux variants et une normalisation des paramètres seront effectuées, suivies d’une analyse de corrélation pour identifier toute relation significative entre les mutations prédites et les mutations épileptogènes proximales. À l’aide d’un simulateur neuronal basé sur Python, un modèle de neurones basé sur la conductance multicompartimentale, reflétant l’effet des mutants de type sauvage et épileptogènes, sera décrit. La simulation des réponses neuronales générées par le sous-type épileptogène du récepteur GABAA sera prise en compte pour l’estimation approximative de l’effet des variants pathogènes prédits sur la réponse neuronale. À notre connaissance, il s’agit du premier protocole explorant un cadre multi-échelle pour estimer les effets des variantes du récepteur GABAA sur le comportement neuronal, crucial pour la recherche sur l’épilepsie. Ce protocole peut servir de base pour améliorer les prédictions des phénotypes cellulaires causés par des variantes potentiellement pathogènes des récepteurs GABAA associées à l’épilepsie.

Introduction

Pour presque toutes les maladies humaines, la variation génétique joue un rôle important dans la susceptibilité individuelle. Par conséquent, comprendre comment les variations de séquence sont liées au risque de maladie offre un moyen précieux de découvrir les processus clés impliqués dans le développement de la maladie et d’identifier de nouvelles approches de prévention et de traitement1. Cela s’applique également aux troubles neurodéveloppementaux, qui se classent parmi les affections chroniques les plus répandues en soins primaires pédiatriques2. Des conditions telles que les troubles du spectre autistique, la déficience intellectuelle et l’épilepsie illustrent comment la variation génétique influence de manière significative la susceptibilité individuelle au cours du développement3.

Le cerveau en développement est plus sensible aux crises d’épilepsie que le cerveau adulte en raison d’un décalage neurodéveloppemental génétiquement programmé dans l’équilibre critique entre l’excitation et l’inhibition4. Le GABA (acide gamma-aminobutyrique), principal neurotransmetteur inhibiteur du cerveau adulte, étant excitateur au cours du développement embryonnaire et postnatal précoce, cela n’est pas favorable à la stabilité nécessaire pour prévenir les crises dans les jeunes cerveaux. Cet état temporaire, causé par l’absence d’expression suffisante des co-transporteurs K-Cl5, peut contribuer à un risque accru d’activité convulsive en présence de récepteurs GABAA dysfonctionnels. Les récepteurs GABAA médient les actions excitatrices et inhibitrices du GABA, en fonction de la concentration intracellulaire de l’ion6. Ainsi, à mesure que le cerveau mûrit, les mutations dans les gènes codant pour le récepteur GABAA, ainsi que dans d’autres canaux ioniques, déforment l’excitabilité, et les mutations dans les gènes impliqués dans le métabolisme neuronal, la signalisation cellulaire et la formation des synapses7, peuvent provoquer des conditions telles que l’épilepsie d’absence chez l’enfant8.

Les interventions cliniques s’appuient de plus en plus sur l’analyse génétique pour améliorer la précision du traitement des troubles neurodéveloppementaux2. Les tests génétiques dans l’épilepsie pédiatrique présentent des cibles potentielles pour les approches de médecine de précision9, soulignant l’importance des variantes génétiques dans l’orientation des décisions de traitement. De plus, ~25 % des patients épileptiques présentant des mutations de novo reçoivent un diagnostic génétique qui identifie des cibles potentielles pour la médecine de précision, soulignant la valeur significative des variantes génétiques dans l’orientation des décisions de traitement10. Cela a été alimenté par les progrès des technologies de séquençage de nouvelle génération, telles que les panels de gènes ciblés, le séquençage de l’exome entier et le séquençage du génome entier, qui ont considérablement accéléré les découvertes génétiques11. Cependant, le nombre croissant de nouvelles découvertes de gènes s’accompagne d’un défi lorsque les résultats produisent un variant de signification inconnue (VUS), une classification qui reflète des preuves contradictoires ou des informations insuffisantes concernant le rôle moléculaire du variant dans la pathogenèse de la maladie. Les variants classés comme VUS correspondent à une catégorie dans le système de classification des variants à cinq niveaux proposé par l’American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) et l’Association for Molecular Pathology (AMP)12.

Relever le défi des variantes génétiques fonctionnellement inconnues nécessite des efforts dans deux dimensions clés : la pratique clinique et la recherche. Sur le plan clinique, l’incertitude entourant l’UVV peut compliquer la prise en charge et la prise de décisiondes patients 13. Du point de vue de la recherche scientifique, il est crucial d’identifier les variants pathogènes parmi le nombre croissant de variants de signification incertaine et de déterminer leur rôle dans la physiopathologie et les effets phénotypiques de la maladie1. Un scénario idéal consisterait à prédire avec précision les effets moléculaires, neuronaux et au niveau du réseau de tous les variants non caractérisés sur le plan fonctionnel, minimisant ainsi les ressources, le temps et les efforts nécessaires aux investigations en laboratoire. Ces aspects soulignent l’importance de classer avec précision les variantes génétiques pour permettre un diagnostic précis des épilepsies génétiques, soutenir un traitement personnalisé et faciliter la découverte de cibles pharmacologiques potentielles. Les outils prédictifs actuels 14,15,16,17 sont relativement précis, mais ne fournissent généralement que des classifications binaires (pathogène ou bénin) et manquent d’informations spécifiques à la maladie sur la physiopathologie moléculaire, les conséquences phénotypiques et les mécanismes sous-jacents. En se concentrant sur les variantes faux-sens inconnues de certains gènes codant pour des sous-unités du récepteur GABAA, cet article présente un cadre visant à améliorer l’orientation de la recherche en incorporant des facteurs contextuels de variantes tels que les aspects moléculaires, évolutifs et structurels, ainsi que des simulations de pathologie neuronale dérivées de données biophysiques in vitro de mutations associées à l’épilepsie. Notre méthodologie porte sur l’identification de variants pathogènes inconnus de la sous-unité γ2 du récepteur GABAA, une sous-unité clé impliquée dans la physiopathologie de l’épilepsie 18,19,20. S’ensuit l’exploration de l’appariement spécifique à la position de ces variants prédits avec les mutations associées à l’épilepsie caractérisées par des données structurales et électrophysiologiques. Ces données sont ensuite utilisées pour estimer l’effet variant sur un modèle de neurone pyramidal de l’hippocampe exprimant un sous-type de récepteur GABAA, composé de sous-unités γ2, α1 et β3 (récepteurs γ2-GABAA), responsables de l’inhibition synaptique rapide6. Il est important de noter que les récepteurs GABAA s’assemblent à partir d’un grand pool de sous-unités (α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π et ρ1-ρ3) et selon la composition des sous-unités, les récepteurs GABAA diffèrent par leur modulation, leurs caractéristiques biophysiques, ainsi que leurs modèles d’expression régionaux, cellulaires et subcellulaires couplés à des fonctions spécifiques 6,21,22,23, 24,25. Ainsi, la présente étude se concentre sur les récepteurs γ2-GABAA ou les récepteurs GABAA contenant γ2 uniquement.

Les sous-unités du récepteur GABAA sont composées de caractéristiques structurelles caractéristiques - un long domaine extracellulaire N-terminal (ECD), quatre domaines transmembranaires couvrant (TM1 à TM4), un linker intracellulaire reliant TM1 et TM2, un linker extracellulaire reliant TM2 et TM3, une grande boucle intracellulaire entre TM3 et TM4 (boucle TM3-TM4) et une courte terminaison C extracellulaire 6,26, N° 27. Il est suggéré que le récepteur GABAA fonctionne via un mécanisme complexe de « verrouillage et de traction », où la liaison GABA verrouille les sous-unités β et α, les amenant à tirer sur les domaines extracellulaires (ECD) des sous-unités, en les faisant pivoter dans le sens inverse des aiguilles d’une montre27. Ce mouvement plie les domaines transmembranaires (TMD), ouvrant ainsi le canal ionique27. Ainsi, l’activité du canal semble être coordonnée avec les cassettes structurelles dans les récepteurs GABAA. Il s’avère que les mutations de l’épilepsie provoquent un dysfonctionnement de l’activité des canaux via la distorsion de ces cassettes structurelles28. Par conséquent, notre étude est basée sur l’idée que les variants pathogènes prédits à proximité de mutations épileptogènes fonctionnellement identifiées dans les cassettes structurelles spécifiques des sous-unités du récepteur GABAA peuvent présenter des modèles similaires de distorsion électrophysiologique ou biophysique dans la fonction des canaux, comme observé dans les cas de ces mutations épileptogènes. Alors que la présence de cassettes structurales épileptogènes dans les sous-unités28 du récepteur GABAA soutient indirectement cette notion, notre étude démontre la complexité et le défi de corréler les paramètres biophysiques des mutations épileptogènes avec ceux des mutations pathogènes prédites. Pour démasquer ces relations complexes, notre cadre est important car il met en évidence une approche multi-échelle allant de l’ADN à la fonction des protéines et au comportement neuronal essentiel pour la recherche sur l’épilepsie. Cette approche intègre la génétique computationnelle à la modélisation moléculaire et aux simulations neuronales tout en soulignant l’importance des méthodes complémentaires, telles que l’apprentissage automatique formé sur de grands ensembles de données, qui pourraient capturer les effets des mutations sur la structure des canaux, l’activité et l’excitabilité neuronale. De plus, la simulation de l’activité épileptogène du récepteur γ2-GABAA sur le modèle de neurone pyramidal de l’hippocampe permet la réplication du phénotype cellulaire in vitro associé à la canalopathie du récepteur GABAA et la mise en évidence de réponses mononeuronales altérées au centre du dysfonctionnement du réseau.

Protocole

1. Prédiction in silico des variants pathogènes

  1. Collecte de données sur les variantes
    1. À l’aide de la base de données ClinVar29, recherchez des variants de signification incertaine (VUS) dans la région codante du gène d’intérêt via le site web : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. Entrez le symbole du gène (par exemple, GABRG2) dans la barre de recherche et filtrez les résultats pour n’inclure que les types de variantes souhaités, tels que les variantes mononucléotidiques, les variantes faux-sens de signification incertaine. Téléchargez et enregistrez les données au format data.xlxs (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S1). Enregistrez la date des données téléchargées.
      REMARQUE : Dans le présent protocole, la sous-unité γ2 humaine du récepteur GABAA , en particulier la sous-unité gamma2 du récepteur de l’acide gamma-aminobutyrique de type A d’Homo sapiens gamma2 (GABRG2), la variante de transcription 1, l’ARNm (NCBI Ref. seq. : NM_198904.4), également connue sous le nom de γ2L, sera analysée. Il est important d’enregistrer le transcrit de référence du gène d’intérêt ainsi que d’autres identificateurs correspondants dans différentes bases de données (UniProt, ENSEMBL, PDB), car différentes méthodes de calcul peuvent nécessiter des identificateurs différents (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S2). Si la base de données ou l’outil de calcul ne reconnaît pas les numéros de version des identificateurs de séquence, essayez à la fois l’ID avec le numéro de version (NM_198904.4) et sans le numéro de version (NM_198904).
    2. Informations de base sur les protéines de référence
      1. Dans la base de données NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, sélectionnez Nucleotide dans les options de recherche et entrez la référence NCBI Seq. ID du gène d’intérêt (NM_198904.4). Ensuite, en faisant défiler la colonne de droite, cliquez sur la protéine sous la catégorie Informations connexes pour trouver la protéine (NP_944494.1) codée par le transcrit NM_198904.4. À l’aide des informations fournies pour la protéine NP_944494.1, enregistrer les positions de séquence des régions spécifiques sous la forme d’un tableau (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S3).
        REMARQUE : Il est important de déterminer les informations préliminaires connues pour la position de séquence de régions, de motifs ou de résidus critiques sur le plan fonctionnel et structurel, tels que les domaines protéiques, les sites de phosphorylation, les sites de liaison des ligands et les interfaces d’interaction moléculaire. Cela peut être réalisé en combinant des bases de données (NCBI, ENSEMBL, UniProt...) et des recherches documentaires.
  2. Organisation des données de variantes
    1. Organisez les données de manière à répondre aux exigences d’entrée des prédicteurs choisis. Assurez-vous que le format des données extraites est organisé pour correspondre aux exigences du serveur dbNSFP http://database.liulab.science/dbNSFP. Pour ce faire, supprimez les colonnes inutiles du fichier data.xlsx (Fichier supplémentaire 4 : Table supplémentaire S1 de l’étape 1.1.1), en ne conservant que les colonnes suivantes dans l’ordre spécifié :
      « Chromosome GRCh38 », « Emplacement GRCh38 », « Nom », « Changement de protéine ».
    2. Enregistrez le fichier sous un nouveau nom de fichier : « data1.xlsx » (tableau supplémentaire S4). Formatez le fichier data1.xlsx en R en exécutant le code (Fichier supplémentaire 1 : Data_GABAA. R), qui enregistrera les données formatées en tant que data1_output.xlsx (Fichier supplémentaire 4 : Table supplémentaire S5) dans le répertoire de travail pertinent pour le projet R.
      REMARQUE : Différentes méthodes de calcul nécessitent différents types et formats de données. La collecte et l’organisation des données en fonction d’exigences de format spécifiques, même pour une douzaine de variantes, peuvent être sujettes à des erreurs et prendre du temps, cette étape est donc importante à moins que le pool de variantes ne soit composé que de quelques variantes. Dans ce cas, l’organisation manuelle des données peut être possible.
  3. Prédiction de la pathogénicité
    1. Transférez le contenu du fichier data1_output.xlsx dans la version académique du serveur dbNSFP30,31 accessible via http://database.liulab.science/dbNSFP. Pour ce faire, copiez/collez ou téléchargez directement le fichier au format .txt.
    2. Assurez-vous que les options suivantes sont présélectionnées et confirmées sur le serveur : HG38 (construction du génome), ClinPred32 et BayesDEL33 avant de les soumettre. En quelques minutes, le serveur générera les résultats.
      REMARQUE : Dans le présent protocole, deux prédicteurs d’ensemble, à savoir BayesDEL33 et ClinPred32, ont été sélectionnés pour leur grande précision34 et leur praticité. Cependant, d’autres prédicteurs, tels que AlphaMissense, qui est disponible dans la base de données dbNSFP30,31, peuvent également être sélectionnés. Le choix des outils in silico dépend de plusieurs facteurs, notamment de la génération de plusieurs lignes de preuves informatiques suffisantes pour une prédiction puissante12. Les prédicteurs d’ensemble intégrant l’analyse de plusieurs algorithmes prédictifs peuvent servir à cette fin.
    3. Téléchargez le fichier de sortie (au format .txt) et enregistrez-le sous data2.xlsx (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S6).
    4. Définissez les filtres dans data2.xlsx (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S6) en cliquant sur l’option de filtre dans le menu et en déterminant les variantes consensuelles dans les deux colonnes en filtrant pour D. Cela donnera la liste des variants les plus pathogènes ; enregistrez-le (voir l’onglet Consensus dans le tableau supplémentaire S6 [ Fichier supplémentaire 4]).
  4. Sélection des variantes
    1. Parmi les prédictions pathogènes consensuelles, déterminer les variants à proximité des mutations épileptogènes obtenues dans la littérature. S’assurer que ces derniers disposent de paramètres structurels et biophysiques adaptés à la modélisation des neurones.
      REMARQUE : Cette étape est exploratoire et est également liée à l’étude de la protéine d’intérêt en termes de paramètres structurels, physicochimiques et biophysiques. Dans la présente étude, ces données ont été obtenues auprès de Brünger et al.35 et de Guo et al.36, en plus d’une enquête sur les mutations associées à l’épilepsie. En outre, en option, les scores AlphaMissense37 ont été consultés à partir de la base de données dbNSFP 30,31 en répétant l’étape 1.3 (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S7). De plus amples détails sont fournis dans les sections 2.1.1 et 2.1.2 du protocole et dans les résultats (voir « Clustering Variants for Structural and Biophysical Parameters »).
    2. Pour une visualisation de base, utilisez les serveurs Protter38 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/) et HOPE39 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/) pour examiner les variants de l’étape précédente dans le contexte des mutations du gène GABRG2 sélectionnées : P302L40 et K328M (ou K289M41, en excluant le peptide signal de 39 résidus).
      REMARQUE : En raison de l’énorme complexité, l’évaluation structurelle des effets des variants doit être effectuée à plusieurs niveaux d’analyse. Des outils tels que Protter38 permettront de visualiser clairement les variants dans le contexte des caractéristiques topologiques de la protéine et des serveurs conviviaux tels que HOPE39 donneront un aperçu de l’effet des variants par modélisation moléculaire. De plus, une revue complète de la littérature sur la protéine d’intérêt est essentielle pour identifier et intégrer l’information sur les mutations associées à l’épilepsie.
    3. Analyse de la conservation évolutive et des connaissances structurelles
      1. Ouvrez Jalview 42,43,44, un programme open source pour l’édition, la visualisation et l’analyse des protéines.
      2. Importez des séquences pour l’alignement. Cliquez sur Fichier dans le menu supérieur | Récupération de séquences ; sélectionner la base de données dans la boîte de dialogue (par exemple, UniProt) ; cliquez sur l’onglet Récupérer les identifiants ; et, comme décrit dans la boîte de dialogue, entrez les ID d’accession UniProt du gène d’intérêt (GABRG2) de l’homme et d’autres espèces de vertébrés : P18507, P22723, Q6PW52, A0A2I3TKX0, F1RR72, A0A8I3MDZ2, A0A8M1P4D6. Cliquez sur OK.
        REMARQUE : Les numéros d’accession UniProt des protéines codées par GABRG2 sont les suivants : P18507 (P18507-2) pour Homo sapiens, P22723 pour Mus musculus, A0A2I3TKX0 pour Pan troglodytes, F1RR72 pour Sus scrofa, A0A8I3MDZ2 pour Canis familiaris et A0A8M1P4D6 pour Danio rerio.
      3. Selon le gène d’intérêt, certaines séquences peuvent ne pas être annotées ; par conséquent, effectuez une recherche BLAST pour identifier les informations pertinentes et les homologues potentiels pour une meilleure compréhension contextuelle. Dans ce cas, téléchargez le format FASTA des séquences de protéines via l’option de zone de texte Ajouter des séquences/À partir de du menu Fichier pour produire plusieurs alignements de séquences des séquences souhaitées.
      4. Une fois l’alignement chargé, observez les séquences affichées pour la comparaison de plusieurs séquences. Chaque ligne représente une séquence et chaque colonne représente une position dans l’alignement. Pour déterminer la meilleure méthode d’alignement, utilisez différentes approches ; par exemple, cliquez sur les services Web dans le menu Séquence et sélectionnez l’option Exécuter T-Coffee avec préréglage , qui permet un alignement optimal.
      5. Faites un clic droit sur la séquence P18507 Homo sapiens (la séquence de référence dans la présente étude) et définissez-la comme séquence de référence. Choisissez Format dans le menu supérieur et cliquez sur Habiller pour visualiser l’alignement complet à l’écran. Dans le même menu Format, cliquez sur l’échelle ci-dessus pour améliorer la visualisation de numéros de résidus spécifiques. Pour améliorer encore la visualisation, ajustez les schémas de couleurs en allant dans Couleur et en sélectionnant différentes options (par exemple, Couleur Clustal, Propriété chimique) ; Modifiez la taille de la police si nécessaire.
      6. Cliquez sur Calculer dans la barre de menu et sélectionnez Calcul automatique du consensus pour mettre en évidence les régions conservées.
      7. Concentrez-vous sur la position des variants d’intérêt identifiés dans l’étape de prédiction in-silico et examinez les positions spécifiques des variants. Annotez des résidus spécifiques en cliquant dessus avec le bouton droit de la souris et en sélectionnant Ajouter une annotation. Écrivez l’étiquette (par exemple, l’ID de la variante) avec le code de couleur approprié et enregistrez.
        REMARQUE : Dans la présente analyse, P302L (violet) et A303T (rouge) ont été sélectionnés pour les visualiser dans l’alignement de séquences multiples avec les données structurelles (voir la section suivante).
    4. Reconstruction tridimensionnelle de la protéine complète avec les résidus conservés sélectionnés
      1. Dans le fichier obtenu à partir de l’étape précédente, faites un clic droit sur la séquence de référence (GABRG2 humain) et sélectionnez les données de structure 3D.
      2. Identifiez les données structurelles appropriées (7QNE, Chaîne C)26 dans le menu déroulant et sélectionnez Ouvrir une nouvelle vue de structure avec Jmol.
        REMARQUE : Cela permettra l’incorporation des résidus sélectionnés dans l’alignement de séquences multiples dans les données structurelles par Jmol, un visualiseur open source basé sur Java pour les structures chimiques 3D.

2. Sélection des paramètres et modélisation biophysique

  1. Méta-analyse spécifique aux variants et normalisation des paramètres
    1. Examiner la littérature actuelle pour recueillir des variantes de sous-unités identifiées avec la conductance du canal de données électrophysiologiques (gGABAA), le temps de désactivation (τdésactivation), le temps de montée (τmontée) et l’amplitude maximale du courant (Imax). Indiquez la composition des sous-unités, le type de cellule et les mesures de type sauvage pour chaque cas. Étiquetez les variants et leurs témoins en conséquence (p. ex., connu pour les variants ayant des caractéristiques biophysiques identifiées et contrôle connu pour les mesures de type sauvage pour chaque variant).
    2. Obtenir les scores de pathogénicité d’AlphaMissense pour les variants présentant des caractéristiques biophysiques identifiées.
      REMARQUE : Voir la section 1.3 du protocole pour plus de détails.
    3. Créez un cadre de données avec la position des sous-unités et des acides aminés pour chaque variant, les acides aminés originaux et modifiés, le score de pathogénicité et les paramètres biophysiques obtenus à partir de la littérature. Pour éviter les divergences expérimentales, normalisez les paramètres biophysiques des variants identifiés sous forme de changements x-x sur les mesures de type sauvage.
  2. Analyse comparative des variantes par caractéristiques structurelles et fonctionnelles
    1. Organiser les variants prédits sur une trame de données ; étiqueter en conséquence (p. ex., prédit pour les variants sans documentation sur leurs caractéristiques biophysiques).
    2. Classez les variants en fonction de leur emplacement dans la séquence d’acides aminés et la structure tertiaire. Ajoutez des paramètres de classification structurale (par exemple, localisation dans les hélices alpha, les bobines, les feuillets bêta, les domaines extracellulaires, intracellulaires ou transmembranaires, la muqueuse des pores, la liaison des agonistes, les interactions protéine-protéine) sur le cadre de données et fournissez des informations pour chaque variant en ce qui concerne leur position d’acides aminés.
    3. Classez les variantes en fonction de leur distance au centre de la membrane et de l’axe des pores. Ajoutez les paramètres de distance à l’axe des pores et de distance au centre de la membrane sur le cadre de données.
    4. Analysez la corrélation entre les paramètres structurels et biophysiques par rapport aux variants connus. Si possible, évaluez les variants prédits par rapport aux corrélations obtenues.
  3. Construction de modèles de synapses et de neurones
    1. Utilisez le Brian245, un simulateur neuronal open source développé en Python pour la modélisation et la simulation de réseaux neuronaux de pointe, pour construire un modèle biophysique multicompartimental de la synapse GABAergique sur un neurone pyramidal hippocampique basé sur la conductance multicompartimentale.
    2. Concevez le modèle basé sur la conductance en définissant la cinétique de déclenchement des canaux ioniques, les paramètres passifs et actifs et les conductances postsynaptiques. Définir le modèle basé sur la conductance tel qu’il est donné dans le fichier supplémentaire 2, qui décrit les équations utilisées dans le modèle.
      1. Réglez la capacité membranaire (Cm) à 1 μF/cm2 et la résistance intracellulaire (Ra) à 200 Ω.cm.
      2. Utilisez les conductances modifiées de type Hodgkin-Huxley pour les neurones pyramidaux de l’hippocampe39 avec gL = 0,0003 S/cm2, gK = 0,036 S/cm2, EL = -76,5 mV, ENa = 50 mV et EK = -90 mV.
      3. Ajustez la distribution de la densitédes canaux Na V sur gNa à 0,05 S/cm2 pour le soma, 0,5 S/cm2 pour le segment initial de l’axone (AIS) et le nœud de Ranvier (NR), et 0,005 S/cm2 pour les dendrites. Définissez gK et gNa sur 0 dans les segments myélinisés.
      4. Construire la cinétique de déclenchement du canal ionique pour NaV et KV comme décrit dans le fichier supplémentaire 2.
      5. Introduire les courants synaptiques (Isyn) comme la somme de toutes les synapses glutamatergiques et GABAergiques dans un compartiment. Inclure à la fois le courant rapide médié par le récepteur AMPA (IAMPA) et le courant lent médié par le récepteur NMDA (INMDA) dans le courant glutamatergique (Iglu). N’inclure que le courant rapide médié par le récepteur GABAA dans le courant GABAergique (IGABA). Supposons qu’une quantité constante de glutamate est libérée dans la synapse pour chaque pic présynaptique ; par conséquent, l’activation des récepteurs dépend du temps de pointe (sAMPA et sNMDA) et les conductances totales des récepteurs (gAMPA et gNMDA) reflètent la quantité de glutamate libérée par chaque événement.
      6. Utilisez le modèle synaptique comme décrit dans le fichier supplémentaire 2.
        REMARQUE : Pour une explication détaillée des équations, voir le fichier supplémentaire 2 décrivant les équations utilisées dans le modèle.
    3. Obtenez le diamètre mesuré expérimentalement pour le soma et les neurites et la longueur de chaque compartiment de neurites et les motifs de ramification à partir de la littérature antérieure46,47. Réduire la morphologie réelle des neurones en un modèle multicompartimental, en divisant la cellule en plusieurs compartiments, qui préserve avec précision la structure ramifiée principale et maintient la symétrie bilatérale.
    4. Réglez la morphologie (longueur et diamètre du segment, c’est-à-dire d_soma : 30 μm ; l_AH : 5 μm ; d_AH_i : 1,5 μm ; d_AH_f : 1,3 μm ; l_AIS : 40 μm ; d_axon : 1 μm l_myseg : 100 μm ; l_NR : 2 μm l_AxTer : 4 μm ; d_AxTer : 2 μm ; l_approx : 100 μm ; l_apmed : 100 μm ; l_apdis : 200 μm ; d_approx_i : 4 μm ; d_approx_f : 3 μm ; d_apmed : 2 μm ; d_apdis : 2 μm ; l_apLM : 70 μm ; d_apLM : 2 μm ; l_nAcDbasal : 400 μm ; d_nAcDbasal : 1,4 μm ; l_nAcDbasal_stem : 20 μm ; d_nAcDbasal_stem : 1,5 μm) et les paramètres biophysiques (comme indiqué dans la section 2.3.2) pour chaque compartiment du modèle de neurone pyramidal 46,47 comme également détaillé dans le script Python (Fichier supplémentaire 3 : GABAAvar.py).
    5. Déterminer les paramètres biophysiques du modèle de synapse GABAergique en évaluant les mesures de contrôle de type sauvage obtenues à l’étape 2.1.1.
  4. Concevoir la topologie du modèle neuronal et attribuer des paramètres morphologiques et biophysiques, ce qui inclut la spécification de la disposition spatiale et des interconnexions des compartiments, sur la base des informations morphologiques et ramifiées précédemment obtenues. Attribuez les paramètres morphologiques (p. ex. longueur et diamètre du segment) et biophysiques (section 2.3.2) appropriés à chaque compartiment du modèle, comme il est indiqué dans la fiche supplémentaire 3 : GABAAvar.py.
  5. Construction des synapses et injection de courant
    1. Créez l’activité présynaptique à l’aide de SpikeGeneratorGroup (une classe de la bibliothèque Brian2) comme indiqué dans « GABAAvar.py » (Fichier supplémentaire 3). Connectez le générateur de pointes au compartiment cible du neurone modèle à l’aide de la classe Synapses pour modéliser les connexions synaptiques.
    2. Définissez un courant constant soutenu (Iinj) à 0,85 nA et placez-le au niveau du soma pour imiter l’activité sous-seuil entraînée par la charge de courant ionique de base à un moment donné, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 3 : GABAAvar.py.
  6. Pour construire des moniteurs d’enregistrement, enregistrez les traces de tension à partir des compartiments cibles à l’aide de StateMonitor.
  7. Construisez et exécutez le réseau.
    1. Construisez le réseau avec le neurone modèle, les connexions et les moniteurs à l’aide de Réseau.
    2. Définissez le pas de temps de la simulation par defaultclock.dt (par exemple, 0,01 ms).
    3. Exécutez la simulation sur le réseau avec network.run(T*ms), où T est défini sur 1 000 ms dans l’exemple.
  8. Test de l’impact des mutations faux-sens du récepteur GABAA
    1. Définir l’impact de chaque mutation faux-sens sur la cinétique des canaux à l’aide des paramètres biophysiques collectés à l’étape 2.1.1.
    2. Exécutez la stimulation en modifiant ces paramètres et tracez les résultats à l’aide de « matplotlib.pyplot » comme indiqué dans « GABAAvar.py » (Fichier supplémentaire 3).
  9. Testez des combinaisons de paramètres pour analyser les changements dans les modèles et les cadences de tir. Tracez les résultats à des fins de comparaison.

Résultats

Cette étude utilise une approche multi-échelle pour prédire et caractériser les variants pathogènes dans la sous-unité γ2 du récepteur GABAA , un composant clé de la physiopathologie de l’épilepsie. Grâce à l’utilisation de modèles prédictifs, de la modélisation moléculaire, de la conservation évolutive, de l’examen structurel, de l’analyse de corrélation et des simulations neuronales, cette approche améliore la classification des variants, avec une pertinence significative pour la recherche sur l’épilepsie et peut-être pour une utilisation clinique. Le résumé général de la méthodologie est présenté à la figure 1.

Évaluation comparative de deux mutations adjacentes de la sous-unité γ2

En nous appuyant sur notre hypothèse selon laquelle les mutations pathogènes prédites adjacentes aux mutations épileptogènes dans les sous-unités du récepteur GABAA peuvent produire des effets électrophysiologiques similaires sur la fonction des canaux et le comportement neuronal, nous avons d’abord effectué un bref examen de la relation entre une mutation épileptogène bien connue et une mutation proximale prédite de la sous-unité γ2.

Parmi les variants prédits pathogènes (tableau supplémentaire S6), A303T (rs1581439874, ClinVar Accession : VCV000663033.6) est choisi à titre d’exemple. En plus de la prédiction par les modèles d’ensemble, la pathogénicité d’A303T a été confirmée par les scores AlphaMissense (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S7). A303T se trouve dans le deuxième domaine transmembranaire de la sous-unité γ2 du récepteur GABAA et situé à côté de la mutation épileptogène P302L40, comme le montre la figure 2. Comme l’a évalué la modélisation moléculaire, les substitutions γ2P302L et γ2A303T ont donné des acides aminés qui ont des chaînes latérales plus grandes, comme le montre la figure 3. Les résidus mutants et de type sauvage sont tous deux non polaires dans la mutation γ2P302L, tandis que dans le γ2A303T, le résidu mutant a une chaîne latérale polaire et le résidu de type sauvage a une chaîne latérale non polaire. P302 et Ala303 sont tous deux situés dans l’interface d’interaction de la sous-unité avec la sous-unité β3 (observée dans 7QNB et 7QNA, respectivement). Le P302 et l’Ala303 ont tous deux une surface accessible au solvant (SASA) comparable. De plus, les deux résidus sont conservés à 100 % tout au long de l’évolution des vertébrés (Figure 4, panneau du haut). Ils sont tous deux situés à proximité de la deuxième région transmembranaire (domaine TM2) de la sous-unité γ2, comme le montre en jaune la reconstruction tridimensionnelle de la protéine du récepteur GABAA (7QNE26, où A303, en rouge, est le premier résidu dans ce domaine (Figure 4). Sur la base de ces caractéristiques comparables et à l’aide d’un modèle de neurones pyramidaux, la simulation de mutations épileptogènes proximales telles que la mutation de la sous-unité γ2 P302L40 peut être utilisée pour la caractérisation préliminaire de l’effet de la variante prédite (γ2A303T) sur la réponse neuronale. Dans l’étape suivante, nous avons élargi notre analyse à un ensemble plus large de variantes au sein des sous-unités du récepteur GABAA .

Variantes de regroupement pour les paramètres structurels et biophysiques

Suite à l’évaluation comparative de deux mutations adjacentes dans la section précédente, nous avons mis en œuvre une approche systématique pour évaluer si des caractéristiques moléculaires partagées entre les variants pouvaient être identifiées. Cette phase visait à explorer si des modèles cohérents émergent dans les caractéristiques structurelles, physicochimiques et biophysiques à travers les acides aminés et les variants, fournissant ainsi un soutien supplémentaire à notre hypothèse initiale.

Le cadre de données utilisé dans cette étude et les références sont fournis dans le Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S840, 48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61, 62, 63, tableau supplémentaireS936 et tableau supplémentaireS1035. De plus, des corrélations entre les paramètres structuraux et biophysiques ont été déterminées pour chaque sous-unité et pour toutes les variantes sans distinction de sous-unité (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S11, Tableau supplémentaire S12, Tableau supplémentaire S13, Tableau supplémentaire S14 et Tableau supplémentaire S15). Des informations sur les paramètres structuraux (localisation sur les hélices alpha, les bobines, les feuillets bêta ; domaines extracellulaires, intracellulaires ou transmembranaires ; paroi des pores, liaison agoniste/allostérique et interactions protéine-protéine) ont été obtenues auprès de Brünger et al.35. Les paramètres biophysiques ont été obtenus à partir d’études électrophysiologiques par patch-clamp sur des cellules de rein embryonnaire humain (HEK) 293. Les valeurs ont été normalisées à l’aide des constantes respectives de temps d’activation du récepteur de type sauvage (τr) et de temps de désactivation (τd).

Étant donné que notre étude est basée sur l’idée que les variantes d’acides aminés adjacentes ou à proximité de mutations fonctionnellement identifiées dans les sous-unités du récepteur GABAA peuvent présenter des modèles similaires de changements électrophysiologiques dans la fonction des canaux, comme observé dans les cas de ces mutations, nous avons exploré la possibilité d’une relation entre les paramètres structurels, physicochimiques et biophysiques. L’emplacement des variants par rapport à leurs distances par rapport au centre de la membrane et à l’axe des pores est donné sur les figures 5 et 6. Dans ce contexte, nous avons également utilisé les scores (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S7) d’AlphaMissense37 ; alimenté par le modèle de prédiction de la structure des protéines très précis AlphaFold264, qui peut utiliser la séquence d’acides aminés de base comme entrée. AlphaMissense peut fournir des indices sur les aspects structurels des substitutions d’acides aminés uniques. La distribution des scores AlphaMissense pour les variants connus (noirs) et prédits (rouges) en ce qui concerne la position des variants (position des acides aminés, distance au centre de la membrane et distance à l’axe des pores) des sous-unités du récepteur GABAA (sous-unités α1, β3, γ2 codées respectivement par les gènes GABRA1, GABRB3, GABRG2 ) est donnée à la figure 7.

La figure 7A-C montre la distribution du score AlphaMissense entre les positions des acides aminés, la figure 7D-F montre la distribution du score AlphaMissense sur la distance normalisée de l’axe des pores, et la figure 7G-I montre la distribution du score AlphaMissense sur la distance du centre de la membrane. L’analyse de corrélation de la figure 7 a indiqué la difficulté de déterminer une relation sous-jacente à travers les propriétés structurelles pour prédire l’issue des variants nouvellement identifiés. Les variantes de la sous-unité b2 (codées par le gène GABRB2) ont été incluses dans les sections de regroupement et de corrélation afin de pouvoir effectuer une analyse plus large. Cependant, seules les variantes de la sous-unité α1 codée par GABRA1 (Figure 7A, D, G), de la sous-unité β3 codée par GABRB3 (Figure 7B, E, H) et de la sous-unité γ2 codée par GABRBG2 (Figure 7C, F, I) ont été incluses dans les modèles biophysiques, car le modèle se concentre sur la fonction d’un neurone pyramidal de l’hippocampe et la combinaison α1β3γ2 de GABAA Les sous-unités réceptrices sont la combinaison la plus répandue dans l’hippocampe65. De même, toutes les variantes de α1, β3 ou γ2 pour lesquelles la cinétique de canal n’a pas été étudiée dans un récepteur GABAA α1β3γ2 ont également été exclues des simulations. Il y avait une légère corrélation (figure supplémentaire S1 et figure supplémentaire S2) entre les scores AlphaMissense et les paramètres biophysiques (temps d’activation et de désactivation normalisés) dérivés des effets des mutations du récepteur GABAA (fichier supplémentaire 4 et tableau supplémentaire S8) dans la présente analyse. Cela suggère que les mutations prédites pathogènes (sur la base des scores AlphaMissense) pourraient également entraîner des changements mesurables et potentiellement perturbateurs dans la cinétique des récepteurs (par exemple, les temps d’activation et de désactivation). Néanmoins, l’absence de corrélation entre les corrélations de position dans la figure 7 rend difficile l’utilisation des scores AlphaMissense pour notre hypothèse, qui est basée sur l’idée que les acides aminés adjacents auront des conséquences similaires sur les caractéristiques biophysiques.

Les distributions de la distance normalisée à l’axe des pores par rapport à la cinétique d’activation et de désactivation des variantes connues sont illustrées aux figures 8 et 9. Il existe une légère corrélation pour la sous-unité γ2 (Figure 8C), ce qui suggère la possibilité que notre hypothèse, qui est basée sur l’hypothèse que les acides aminés adjacents auront des conséquences similaires, puisse se vérifier dans certaines régions, en particulier à proximité de la zone poreuse du canal récepteur, le domaine TM2. Cette région est adjacente à notre mutation épileptogène de référence (Figure 2 et Figure 4 ; γ2P302), ce qui en fait un candidat relativement bon pour les simulations neuronales. Sur cette base, il est possible de faire une estimation approximative des effets des mutations prédites adjacentes telles que γ2A303T (figure 2 et figure 4). Nos résultats présentés ici ne prennent en compte que les mesures sur α1β3γ2 ; par conséquent, les variantes évaluées dans notre modèle ont été limitées aux variantes données dans le Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S16.

Effet des mutations sur l’inhibition médiée par le récepteur GABA A de l’activation des neurones pyramidaux CA1

L’effet des mutations sur l’inhibition médiée par le récepteur GABAA est démontré sur un modèle de neurone pyramidal CA1 basé sur la conductance multicompartimentale. L’impact des variantes faux-sens du récepteur GABAA sur la fonction des neurones pyramidaux de l’hippocampe peut être exploré par le biais de la dérivation GABAergique des entrées apicales vers le neurone, à partir des projections de CA3 et des neurones pyramidaux du cortex entorhinal (EC) III. En d’autres termes, une façon de simuler l’activité des récepteurs GABAA est de supposer un contexte dans lequel la simulation représente des hypothèses réalistes sur la signification physiologique des récepteurs, comme l’inhibition de shunt, l’un des mécanismes de l’inhibition GABAergique. Les neurones pyramidaux de l’hippocampe CA1, généralement dans leurs dendrites apicales, ont des récepteurs GABAA dans ces zones, qui sont ciblés par les projections des neurones du CA3 et de l’EC III. Cette disposition est donc adaptée à la simulation. Cette question de recherche nécessite un plan d’entrée avec des délais et des intensités variables. Par conséquent, trois synapses glutamatergiques différentes (GluS1/2/3) ont été placées sur les dendrites apicales, apicales médiales et basales, comme le montre la figure 10, et elles ont été activées séquentiellement. Pour évaluer l’impact des entrées synaptiques, l’amplitude constante du courant doit rester inférieure au seuil minimum de déclenchement des pointes (Iinj < Imin). Le modèle de neurone pyramidal avec un récepteur GABAA de type sauvage ou mutant a été initié par une injection de courant constant de 0,85 nA au niveau du soma. La synapse GABAergique a ensuite été placée au niveau du soma. L’activité présynaptique, imitée par le générateur de pointes, a été initiée d’abord au niveau de la dendrite apicale distale. Les entrées synaptiques sur les dendrites apicales médiales et basales ont été retardées de 25 ms et 50 ms, respectivement. La synapse GABAergique a été activée avec un retard de 40 ms. L’intensité de l’inhibition GABAergique a été ajustée de telle sorte que l’ensemble du train de pointes, à l’exception du premier pointe, soit inhibé. Ensuite, l’impact des variants est exploré dans ce contexte en faisant varier τaugmentation, τdésactivation et gGABAA .

Les paramètres pour les récepteurs de type sauvage et mutants ont été obtenus à partir de la collection décrite à l’étape 2.1.1 du protocole, en particulier pour les récepteurs composés de α1β3γ2, qui est la composition de sous-unités la plus abondante dans les neurones pyramidaux de l’hippocampe65. La distribution des paramètres est donnée dans le Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S16.

Chaque mutation de sous-unité a été testée sur des cas de synapses glutamatergiques simples, doubles et triples. Dans une approche simple, l’impact des mutations peut être évalué en fonction de la cadence et du schéma de décharge. Les moyennes et l’écart-type de ΔtISI peuvent également être estimés pour mieux évaluer les changements dans le modèle de décharge, où ΔtISI représente le changement dans l’intervalle entre les pointes. Les résultats pour chaque cas sont présentés sous forme de taux de tir et de ΔtISI (moyenne et écart-type) dans le fichier supplémentaire 4 : tableau supplémentaire S17 et figure supplémentaire S3. Les trains de pointes et les traces de tension pour les variantes qui ont modifié les schémas de tir sont donnés dans les figures 11, 12 et 13.

Pour l’activation des synapses glutamatergiques simples (GluS1) et triples (GluS1-2-3), les mutations qui ont altéré la réponse neuronale n’étaient que β3mutations N110D et γ2K328M. Dans le cas d’une entrée glutamatergique unique, β3N110D a conduit à une inhibition altérée, et le modèle de décharge a été verrouillé sur le train de pointes glutamatergiques après le 4e pic présynaptique avec un court délai (Figure 11). γ2K328M a également altéré l’inhibition, bien que seulement autour du 5e pic présynaptique, et a introduit un retard plus important dans le pic postsynaptique par rapport à β3N110D (Figure 11). Dans le cas d’activation de GluS1-2-3 (Figure 13), la réponse était similaire entre les mutations β3N110D et γ2K328M. Les deux mutants ont produit un schéma de décharge où presque tous les pics présynaptiques cumulés ont été détectés et ont déclenché une réponse. Dans les deux cas, les modèles de neurones se déclenchent avec une paire de pointes en réponse à l’activité présynaptique.

La double activation de la synapse glutamatergique a donné des résultats distincts par rapport aux deux autres paramètres (Figure 12). Dans ce cas, deux mutations sur la sous-unité b3 du récepteur GABAA (β3N110D et β3T288N) et deux mutations sur la sous-unité γ2 du récepteur GABAA (γ2P302L et γ2K328M) ont altéré l’inhibition GABAergique. Le modèle neuronal avec le mutant γ2P302L s’est déclenché presque en synchronisation avec le GluS2, ce qui était très probablement une réponse retardée au GluS1 avec à peu près le même retard de pointes présynaptiques entre GluS1 et 2. La mutation β3T288N a donné un résultat similaire, avec la distinction du deuxième pic toujours en synchronisation avec GluS2. Le modèle neuronal avec le mutant N110D β3a répondu à presque toutes les entrées glutamatergiques cumulées, à l’exception des deux premiers pics présynaptiques de GluS1/2, qui ont été introduits avec unΔt ISI plus court. Le schéma de décharge de γ2K328M était à nouveau similaire à celui de β3N110D, avec la distinction des deuxième et troisième pics présynaptiques manqués.

Ces résultats démontrent les divers effets des mutations de la sous-unité b3 (codée par le gène GABRB3 ) et de la sous-unité γ2 (codée par GABRG2) sur l’activité des neurones pyramidaux de l’hippocampe. Il est intéressant de noter que les mutations β3L170R, β3A305V, β3E180G, β3D120N, β3Y302C et γ2R82Q n’ont entraîné aucun changement dans l’activité neuronale. L’altération la plus sévère de l’inhibition a été observée pour β3N110D et γ2K328M, qui présentaient tous deux unedésactivation τ significativement plus faible et uneélévation τ plus élevée. Notre analyse préliminaire a également montré que les variations de τrise ou gGABAA seules ne sont pas suffisantes pour nuire à l’inhibition (données non présentées). On peut soutenir que les mutations qui conduisent à une diminution significative de ladésactivation de τ associée à une augmentation deτ entraînent une altération plus significative de l’inhibition GABAergique.

Dans le cas où toutes les entrées excitatrices doivent être inhibées, toute mutation entraînant une décharge produira des réponses neuronales anormales et non spécifiques, qui ont le potentiel d’être exagérées dans un circuit neuronal composé de neurones présentant les mêmes mutations. L’équilibre excitation/inhibition dans un réseau neuronal peut être considérablement affecté par la rétroaction inhibitrice altérée qui en résulte, qui est un élément crucial de toute activité de réseau.

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Figure 1 : Vue d’ensemble de la prédiction et de l’analyse de l’effet des variants à des fins cliniques et de recherche, avec un accent particulier sur l’analyse in silico et les simulations de réponse neuronale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Position de γ2A303T et mutations sélectionnées chez les patients ;γ2P302L et γ2K328L utilisés pour les simulations neuronales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Modélisation comparative de la mutation patiente γ2P302L et de la variante adjacente γ2L (A303T) prédite pathogène. Dans les deux modèles, le vert représente le type sauvage et le rouge représente les résidus mutants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Alignement de séquences multiples et informations structurelles. Le panneau du haut montre la conservation évolutive des résidus dans la position de la mutation du patient (P302L) (violet) sur le bord de la TM2 et de la variante pathogène A303T (couleur rouge) au début de la TM2 de la sous-unité γ2. Le panneau du bas montre la visualisation de ces résidus conservés dans la structure tridimensionnelle du récepteur GABAA (A) (7QNE), où la sous-unité γ2 (chaîne C dans le 7QNE) est représentée en jaune et sous différents angles (A, B). Abréviation : TM2 = deuxième domaine transmembranaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Localisation de toutes les variantes incluses. Les emplacements des variants connus (noir) et prédits (rouge) par rapport à leur distance normalisée (A) par rapport à l’axe des pores et (B) à leur distance par rapport au centre de la membrane sont indiqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Localisation des variantes pour chaque sous-unité. Les emplacements des variants connus (noir) et prédits (rouge) par rapport à leur distance normalisée (A, C, E) par rapport à l’axe des pores et à leur distance (B, D, F) par rapport au centre de la membrane sont indiqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Distribution du score AlphaMissense selon l’emplacement de la variante. (A-C) La distribution du score AlphaMissense sur la position des acides aminés, la distance normalisée (D-F) par rapport à l’axe des pores et la distance (G-I) par rapport au centre de la membrane sont données pour les variantes connues (noires) et prédites (rouges). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 8 : Temps d’activation normalisé des récepteurs GABAA avec des mutations dans la sous-unité α1 (GABRA1), la sous-unité β3 (GABRB3) et la sous-unité γ2 (GABRG2).Les constantes de temps d’activation obtenues expérimentalement par rapport à la distance normalisée par rapport à l’axe des pores pour chaque mutation sur les sous-unités (A) α1, (B) β3 et (C) γ2 sont affichées. Les valeurs ont été normalisées avec le temps d’activation du récepteur de type sauvage respectif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 9 : Temps de désactivation normalisé des récepteurs GABAA avec des mutations dans la sous-unité α1 (GABRA1) du récepteur GABAA, la sous-unité β3 (GABRB3) du récepteur GABAA et la sous-unité γ2 (GABRG2).Les constantes de temps de désactivation obtenues expérimentalement par rapport à la distance normalisée par rapport à l’axe des pores pour chaque mutation sur les sous-unités (A) α1, (B) β3 et (C) γ2 sont affichées. Les valeurs ont été normalisées avec le temps de désactivation du récepteur de type sauvage respectif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 10 : Modèle de neurone pyramidal CA1. Le neurone modèle se compose de (1) soma, (2) une dendrite apicale avec des compartiments proximal, médial et distal, se terminant par deux branches à la lamina molecularis, (3) deux dendrites basales composées symétriquement qui se ramifient en deux sections après une courte tige de dendrite basale, et (4) un axone qui commence par une butte axonale conique, suivie d’un segment initial axonal cylindrique, segments myélinisés, et nœuds de Ranvier, se terminant par une terminaison axonale sphérique. Les triangles verts indiquent l’emplacement des synapses glutamatergiques, et le triangle rouge représente la synapse GABAergique située au niveau du soma. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 11 : Modèle de cuisson avec uniquement l’activité GluS1. Les spikes spike pour les neurones présynaptiques (GluS1 (triangle vert) et GABAergic (cercle rouge)) et les neurones postsynaptiques avec des récepteurs GABAA de type sauvage ou mutants (carré noir) sont donnés dans le panneau supérieur. Les panneaux inférieurs affichent des traces de tension individuelles pour les neurones avec ou sans récepteur GABAA de type sauvage avec ou sans inhibition GABAergique et pour les neurones avec des récepteurs GABAA mutants avec inhibition GABAergique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 12 : Modèle de cuisson avec uniquement l’activité GluS1 et GluS2. Les spikes pour les neurones présynaptiques (GluS1/2 (triangle vert) et GABAergic (cercle rouge)) et les neurones postsynaptiques avec des récepteurs GABAA de type sauvage ou mutants (carré noir) sont donnés dans le panneau supérieur. Les panneaux inférieurs affichent des traces de tension individuelles pour les neurones avec ou sans récepteur GABAA de type sauvage avec ou sans inhibition GABAergique et pour les neurones avec des récepteurs GABAA mutants avec inhibition GABAergique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 13 : Modèle de cuisson avec activité GluS1, GluS2 et GluS3 uniquement. Les spikes pour les neurones présynaptiques (GluS1/2/3 (triangle vert) et GABAergic (cercle rouge) et les neurones postsynaptiques avec des récepteurs GABAA de type sauvage ou mutants (carré noir) sont donnés dans le panneau supérieur. Les panneaux inférieurs affichent des traces de tension individuelles pour les neurones avec ou sans récepteur GABAA de type sauvage avec ou sans inhibition GABAergique et pour les neurones avec des récepteurs GABAA mutants avec inhibition GABAergique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Distribution des scores AlphaMissense et des paramètres biophysiques (temps de désactivation normalisé ; Τd) normalisé des mutations de la sous-unité du récepteur GABAA sélectionnées dans la présente étude. Voir aussi Dossier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire 8. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire S2 : Distribution des scores AlphaMissense et des paramètres biophysiques (temps d’activation normalisé ; Τr) normalisé des mutations de la sous-unité du récepteur GABAA sélectionnées dans la présente étude. Voir aussi Dossier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire 8. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire S3 : Les intervalles entre les pointes pour la réponse neuronale avec les récepteurs GABAA de type sauvage et mutants. Le graphique le plus haut indique les intervalles de temps entre les pointes pour l’apport glutamatergique unique. Le graphique du milieu en montre deux, et le graphique le plus bas montre trois synapses glutamatergiques actives simultanément. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure. 

Dossier supplémentaire 1 : Le fichier « Data_GABAA. R" requis pour s’exécuter dans R pour le formatage des données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Équations utilisées dans la conception d’un modèle basé sur la conductance. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : GABAAvar.py nécessaire pour s’exécuter dans Brian2 pour la simulation neuronale. Le fichier contient les codes Python pour le modèle de neurones multicompartimentaires basé sur Brian2 (fonction : CA1_Pyr), les équations pour les modèles de neurones et synaptiques basés sur la conductance (fonction : model_eqns, syn_eqns) et les paramètres initiaux (fonction : biophys_param, morpho_param, syn_param). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Un dossier zip contenant toutes les tables supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Variants faux-sens de signification inconnue dans le gène GABRG2 téléchargés à partir de ClinVar sous forme de fichier .txt et sauvegardés par la suite sous le nom « data.xlxs ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S2 : Identificateurs des séquences utilisées dans l’étude, transcrit de référence du gène d’intérêt (NCBI Ref. seq.) et autres identifiants correspondants dans différentes bases de données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S3 : Positions des régions structurelles et fonctionnelles. Les positions des régions spécifiques de la protéine de la sous-unité γ2 (séquence de référence NCBI : NP_944494.1) codées par le transcrit de référence (NM_198904.4) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S4 : Le contenu du fichier « data1.xlxs », qui représente les données ClinVar de GABRG2 qui ne comprend que les colonnes : « GRCh38Chromosome », « GRCh38Location », « Name », « Protein change ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S5 : Le contenu du fichier « data1_output.xlsx » qui contient le formatage requis des variantes faux-sens des données GABRG2 à télécharger sur le serveur dbNSFP pour la prédiction de l’effet des variants. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S6 : Le contenu du fichier « data2.xlsx » qui contient la sortie du serveur dbNSFP pour la prédiction de l’effet des variants pour les variants faux-sens inconnus de GABRG2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S7 : Scores AlphaMissense pour les variantes de sous-unités du récepteur GABAA . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S8 : Caractéristiques biophysiques des variants. Les valeurs des paramètres biophysiques ont été obtenues à partir d’études antérieures avec des expériences d’électrophysiologie. Les variants sont marqués avec le type « S » (substitution), tandis que les paramètres du récepteur de type sauvage sont donnés pour chaque substitution et étiquetés avec « C » (contrôle). τ d : Constantede temps de désactivation, POpen : Probabilité d’ouverture, gGABA : Conductance du récepteur, Imax : Courant maximum, τr : Constante de temps d’activation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S9 : Caractéristiques physicochimiques des variants. Les variants précédemment identifiés avec des paramètres biophysiques sont étiquetés avec le type « S » (substitution), tandis que les variants prédits sont représentés par « P ». H : Changement de l’hydrophobie, VSC : Changement du volume de la chaîne latérale, P1 : Changement de polarité, P2 : Changement de polarisation, SASA : Changement de la surface accessible au solvant, NCISC : Changement de l’indice de charge nette. Les valeurs sont obtenues pour chaque acide aminé original et variante à partir de Guo et al.36 et la variation de chaque paramètre est estimée comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S10 : Caractéristiques structurelles des variantes. Les variants précédemment identifiés avec des paramètres biophysiques sont étiquetés avec le type « S » (substitution), tandis que les variants prédits sont représentés par « P ». La localisation de la variante dans un domaine est représentée par 1, sinon 0. Toutes les valeurs sont obtenues à partir de Brünger et al.35. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S11 : Corrélations des paramètres structurels et biophysiques pour toutes les variantes connues. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

 Tableau supplémentaire S12 : Corrélations des paramètres structurels, physicochimiques et biophysiques pour les variants connus de GABRA1 . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S13 : Corrélations des paramètres structurels, physicochimiques et biophysiques des variants connus de GABRB2 . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S14 : Corrélations des paramètres structurels, physicochimiques et biophysiques des variants connus de GABRB3 . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S15 : Corrélations des paramètres structurels, physicochimiques et biophysiques pour les variants connus de GABRG2 . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S16 : Paramètres biophysiques des récepteurs α1β3γ2 GABAA de type sauvage et mutants. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S17 : Taux de décharge et intervalles entre les pointes en réponse à des synapses glutamatergiques simples, doubles ou triples avec des récepteurs GABAA de type sauvage et mutants.  Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

En appliquant une combinaison de génétique computationnelle, de modélisation moléculaire et de simulations neuronales, l’approche présentée dans cet article a le potentiel d’améliorer la classification des variantes du récepteur GABAA, offrant des informations précieuses pour la recherche sur l’épilepsie et les applications cliniques. Une analyse complète pour l’identification et la hiérarchisation des mutations pathogènes prédites est présentée et étendue dans un cadre qui pourrait combler le fossé entre les effets des variants sur les protéines et le phénotype cellulaire. L’évaluation de l’impact de l’activité épileptogène du récepteur GABAA sur la simulation des neurones pyramidaux de l’hippocampe permet la réplication du phénotype in vitro associé au dysfonctionnement du récepteur GABAA et la mise en évidence de l’altération de la réponse d’un seul neurone à l’origine du dysfonctionnement du réseau. Sur la base de ces simulations de réponses neuronales générées par des mutations épileptogènes, une estimation approximative des effets fonctionnels des mutations prédites structurellement proximales a été explorée. Les prédictions de l’effet des mutations prédites sur la cinétique des canaux nécessitent une analyse approfondie avec des ensembles de variants connus. Des analyses comparatives, telles que celles présentées dans cet article, et des simulations d’activité neuronale fournissent des informations essentielles pour la génération et l’amélioration ultérieures de modèles prédictifs axés sur l’effet variant sur la fonction protéique et la pathologie neuronale. De plus, notre méthodologie peut être utilisée pour sélectionner et hiérarchiser les variants les plus pathogènes parmi les variants inconnus afin d’examiner les effets des variants liés aux troubles neurodéveloppementaux liés au récepteur GABAA. Par exemple, les sous-unités réceptrices marquées avec des sondes fluorescentes66, 67, 68, 69, 70 et porteuses des mutations prédites peuvent être exprimées in vitro pour étudier leur trafic, l’expression de la surface cellulaire et la neurophysiologie. De plus, des modèles animaux tels que C. elegans peuvent être envisagés pour valider les effets des mutations prédites. Par exemple, l’édition du gène CRISPR-Cas9 a été utilisée pour générer une délétion de unc-49, un récepteur GABAA de C. elegans, générant ainsi des mutations homozygotes associées à l’épilepsie dans unc-49 ou des sous-unités du récepteur GABAA humain71.

En général, la classification des variants bénéficie de l’utilisation de plusieurs niveaux de preuves informatiques, comme le recommande l’ACMG-AMP12. Cette approche renforce la fiabilité de la classification des variants en intégrant différents outils prédictifs et sources de données, ce qui améliore la précision des évaluations cliniques et le processus global de prise de décision dans le diagnostic génomique. Dans notre méthodologie, l’utilisation de prédicteurs d’ensemble, qui combinent les prédictions de plusieurs outils, répondant ainsi à l’exigence de plusieurs sources de preuves computationnelles et éliminant la nécessité d’utiliser différents outils séparément, est un avantage. Cette approche permet également de surmonter le défi de gérer des sorties disparates d’outils individuels, rationalisant ainsi le processus de prédiction et améliorant l’efficacité. Néanmoins, il n’y a aucune garantie concernant l’exactitude prédictive des analyses centrées sur les gènes ou spécifiques aux variants. Cela conduit à la conclusion que les prédictions centrées sur les gènes ou spécifiques aux variants doivent être effectuées dans des conditions spécifiques ajustées aux contextes et objectifs spécifiques 15,72,73,74. Pour les interventions cliniques, cela nécessiterait l’évaluation de l’exactitude prédictive des outils in silico pour un gène spécifique ou un sous-ensemble de gènes dans le contexte d’une maladie donnée, souvent avec une optimisation individualisée75. Cependant, l’évaluation de la précision prédictive est souvent limitée par l’absence d’un nombre suffisant de variantes, ce qui peut affecter la fiabilité de l’évaluation de la précision.

Différents outils dans la littérature sont disponibles, et leur précision est testée et validée dans les ensembles de données14. Cependant, ces résultats de précision basés sur de grands ensembles de données ne se reflètent pas nécessairement dans la prédiction de quelques variants inconnus pour un gène donné. Dans ce contexte, de plus en plus de littérature suggère que les prédicteurs d’ensemble, qui compilent et calculent les résultats des prédicteurs individuels, sont connus pour être plus performants que la concordance des prédicteurs individuels 33,76,77,78 et donc, dans la présente étude, nous avons choisi d’utiliser des prédicteurs d’ensemble, à savoir BayesDEL 33 et ClinPred32 spécifiquement pour leur performance supérieure32, 34 BayesDEL a été évalué comparativement pour 4 094 variants faux-sens dans des gènes cliniquement pertinents, y compris des gènes codant pour des protéines transmembranaires telles que la sous-unité 5 du canal sodique voltage-dépendant (SCN5A), et a montré des performances supérieures33. Dans notre protocole de prédiction de l’effet des variants, dans un premier temps, nous avons considéré le consensus de deux prédicteurs d’ensemble (BayesDEL et ClinPred). AlphaMissense37, un modèle d’apprentissage profond développé par Google DeepMind, est une extension d’AlphaFold 64,79, utilisant ainsi la puissance de la prédiction de la structure des protéines de haute précision. Lorsque nous avons comparé les résultats de prédiction initiaux des modèles d’ensemble (BayesDEL et ClinPred tels que décrits à l’étape 1.3 de notre protocole) avec les résultats d’AlphaMissense, les prédictions étaient partiellement en accord les unes avec les autres (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S15) et ne correspondaient pas entièrement aux prédictions des modèles d’ensemble (BayesDEL et ClinPred), qui ont atteint un consensus de pathogène ou associé à une maladie, en rose (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S15). Cependant, les variants inconnus (L81F, A303T et V329F) proches des mutations R82Q, P302L et K328M de GABRG2, que nous avons utilisés dans notre modèle de neurones, et prédits comme pathogènes à la fois par ClinPred et BayesDEL, ont également été prédits comme pathogènes par AlphaMissense, comme le montrent les surbrillances jaunes (Fichier supplémentaire 4 : Tableau supplémentaire S15).

Comme AlphaMissense29 utilise la prédiction de séquence et de contexte structurel, dans notre étude, nous avons également voulu voir s’il y avait une association entre les scores AlphaMissense et les emplacements de mutation du récepteur GABAA en fonction de leurs distances par rapport au centre de la membrane et à l’axe des pores. Notre hypothèse est basée sur l’idée que l’impact fonctionnel des variants d’acides aminés adjacents ou proximaux aux mutations fonctionnellement identifiées des sous-unités du récepteur GABAA peut montrer des modèles similaires de changements physicochimiques dans la fonction du canal observés dans les cas de mutations. Une corrélation entre les positions de mutation des sous-unités du récepteur GABAA et les scores AlphaMissense nous aiderait à identifier une relation utilisable pour construire un cadre pour notre hypothèse permettant la prédiction des conséquences fonctionnelles de nouvelles variantes faux-sens dans les sous-unités du récepteur GABAA . Cependant, les scores AlphaMissense n’étaient pas prédictifs des changements dans ces paramètres biophysiques (figure 7). Il est important de noter que la taille limitée de l’échantillon dans notre analyse rend difficile de tirer des conclusions définitives. Cependant, notre analyse a révélé que les scores AlphaMissense n’étaient pas corrélés avec les paramètres structurels des récepteurs GABAA . L’absence d’une corrélation positionnelle claire (par exemple, entre les positions des mutations et les scores AlphaMissense) remet en question la validité de notre hypothèse. Si les résidus adjacents avaient vraiment des effets similaires, nous nous attendrions à voir une corrélation plus claire. Comme ce n’est pas le cas, cela affaiblit la capacité d’utiliser les scores AlphaMissense comme un outil fiable pour tester notre hypothèse.

Il est intéressant de noter que dans notre étude, nous avons trouvé une légère corrélation entre la distance entre la variante et l’axe des pores et le temps d’activation normalisé du canal pour les mutants du gène GABRG2 . Ainsi, notre hypothèse préliminaire selon laquelle les acides aminés adjacents auront des conséquences similaires peut être vraie dans certaines régions du canal, telles que les régions du pore ou aux sites clés impliqués dans le gating, mais peut ne pas être aussi nette dans d’autres régions. Le petit ensemble de données limite la capacité de discerner cette variabilité, mais des données futures ou une analyse structurelle plus détaillée pourraient aider à affiner cet aspect de notre hypothèse. Les simulations de dynamique moléculaire80 pourraient constituer une approche complémentaire puissante pour approfondir ces résultats préliminaires, en particulier dans le cadre de l’évaluation comparative de deux mutations adjacentes de la sous-unité γ2, à savoir la mutation épileptogène γ2P302L40 et la mutation proximale prédite γ2A303T (rs1581439874), réalisées dans notre étude. À l’avenir, cette approche pourrait permettre une estimation plus précise de l’effet d’une variante inconnue sur le phénotype cellulaire, en particulier lorsqu’elle est intégrée aux simulations neuronales présentées dans notre étude.

De plus, il sera intéressant d’explorer si les propriétés structurelles et physicochimiques des sous-unités du récepteur GABAA , ainsi que d’autres caractéristiques, peuvent être utilisées pour former de puissants modèles d’apprentissage automatique pour la prédiction fonctionnelle de nouveaux effets de variants sur le canal, le neurone, le réseau et le phénotype de la maladie. Avec l’avènement des approches d’apprentissage automatique automatisé, nous avons atteint un point où les médecins et les scientifiques de laboratoire humide peuvent également développer leurs propres modèles dans un environnement plus démocratisé81. Par conséquent, l’intégration de ces technologies dans la pratique clinique pourrait potentiellement rationaliser le processus, rendre la médecine personnalisée plus accessible et réduire la dépendance à l’égard d’une expertise hautement spécialisée pour l’analyse des variantes fonctionnelles. Dans ce contexte, notre approche fournit des informations sur la dynamique structurelle et fonctionnelle du récepteur, ce qui pourrait aider à de futures études pour la prédiction fonctionnelle de l’effet variant.

Malgré les progrès actuels dans la prédiction de la structure des protéines et la percée représentée par AlphaFold64, la prédiction précise de l’effet des mutations et de la fonction des protéines reste un défi en raison du manque de données nécessaires à l’entraînement du modèle79. Pour la prédiction de l’effet variant, AlphaMissense montre des performances supérieures par rapport à un sous-ensemble de modèles prédictifs, mais les prédicteurs d’ensemble BayesDEL25 et ClinPred24, qui ont été utilisés dans notre étude, n’ont pas été inclus dans cette comparaison29. Il est important de noter que, dans notre étude, les outils in silico BayesDEL, ClinPred et AlphaMissense ont été utilisés à des fins distinctes. Les prédicteurs d’ensemble, BayesDEL et ClinPred, ont été principalement utilisés pour la prédiction de la pathogénicité, tandis qu’AlphaMissense a été spécifiquement utilisé pour explorer la relation entre ses scores et les données connues sur l’impact des mutations dans la sous-unité γ2. Plus précisément, notre hypothèse suppose que les variants pathogènes prédits, en particulier ceux situés à proximité ou à proximité de mutations fonctionnellement identifiées dans les sous-unités du récepteur GABAA , présenteront des paramètres biophysiques similaires à ceux observés dans les mutations fonctionnellement caractérisées. Pour étudier cela, nous avons choisi AlphaMissense en raison du fait qu’il est alimenté par le modèle très précis AlphaFold264 , qui utilise la séquence peptidique de base pour prédire les conséquences des substitutions d’acides aminés uniques.

Par conséquent, une limitation majeure de notre étude est principalement due à la disponibilité limitée des données expérimentales. Par exemple, notre modèle neuronal est basé sur l’expression des données dérivées de la combinaison de sous-unités α1β3γ2 des récepteurs GABAA , ce qui limite intrinsèquement les mutations étudiées dans la littérature aux sous-unités exprimées dans le cadre de cette combinaison de récepteurs spécifique. De plus, nous nous sommes appuyés sur des données électrophysiologiques dérivées exclusivement de l’expression de ces sous-unités dans les cellules HEK, réduisant encore la portée des données disponibles dans la littérature. Notre utilisation de la modélisation neuronale pour estimer les effets des variants inconnus suppose que les variants inconnus (prédits comme pathogènes dans notre flux de travail) situés à proximité de mutations connues présenteront des modèles similaires dans les paramètres de cinétique des canaux ou les propriétés physicochimiques des effets de mutation décrits dans la littérature. Cette hypothèse, associée à la nécessité de disposer de données électrophysiologiques pour des assemblages de récepteurs spécifiques dans les cellules HEK293, réduit la quantité de données expérimentales disponibles pour la modélisation. En raison de ces contraintes, les données disponibles nous ont permis de ne modéliser qu’un nombre limité de variants dans les sous-unités α1β3γ2. Cependant, l’entraînement du modèle neuronal pour différents assemblages de sous-unités tels que les combinaisons de sous-unités α1β2γ2, les combinaisons de sous-unités α1β2δ ou α4β3δ, qui ont des implications spécifiques aux sous-unités au niveau cellulaire, du circuit et du réseau, montrera probablement une applicabilité plus large à divers types d’épilepsie et troubles neurodéveloppementaux. À l’avenir, avec l’augmentation des données électrophysiologiques disponibles et des études axées sur les mutations dans des assemblages de récepteurs bien définis et des types de cellules spécifiques, il pourrait devenir possible d’améliorer la généralisabilité et la précision de notre approche.

Les modèles de neurones basés sur la conductance multicompartimentale fournissent un outil puissant pour générer des prédictions sur la signification fonctionnelle des variantes de récepteur de la réponse du neurone unique. Cet outil permet de définir de manière flexible les paramètres cellulaires/synaptiques et leurs emplacements pour tester n’importe quelle question spécifique. De simples générateurs de pointes utilisés dans ce protocole peuvent être remplacés par d’autres modèles de neurones pour étudier l’activité des microcircuits. L’étape critique du protocole est aussi l’étape la plus limitative : la définition de toute variante de récepteur en termes de cinétique de canal altérée. Les informations nécessaires sont idéalement fournies par des études électrophysiologiques par patch-clamp ; Cependant, l’analyse computationnelle des substitutions d’acides aminés avec une signification clinique prédite et les comparaisons avec les substitutions connues peuvent également fournir des informations. Notre étude et le protocole décrit intègrent l’utilisation de simulations d’activité neuronale non pas comme un outil prédictif, mais plutôt comme un outil pour explorer les effets des mutations afin de soutenir une perspective plus large sur les conséquences des caractéristiques biophysiques modifiées du récepteur GABAA sur l’activité d’un seul neurone. La dépendance à l’égard des données expérimentales dans les simulations neuronales est une limitation importante de notre approche, qui pourrait bénéficier d’une modélisation moléculaire avancée pour combler le fossé entre la structure et la fonction.

Dans notre protocole, certaines étapes doivent faire l’objet d’une évaluation critique. Tout d’abord, le choix du modèle prédictif utilisé dans la première partie de notre protocole peut être critique. Le choix des outils in silico dépend de plusieurs facteurs, notamment de la génération de plusieurs lignes de preuves informatiques suffisantes pour une prédiction puissante12. Les prédicteurs d’ensemble intégrant l’analyse de plusieurs algorithmes prédictifs correspondent mieux à cette recommandation, donc privilégiés par rapport aux prédicteurs individuels. Il existe différents prédicteurs, et leur précision est généralement testée dans de grands ensembles de données, ce qui ne garantit pas nécessairement l’exactitude du modèle prédictif utilisé pour les effets de variants inconnus situés dans un gène spécifique. Ceci est compensé par l’utilisation de deux modèles d’ensemble, qui collectent et calculent les résultats de la prédiction à partir de plusieurs prédicteurs. De plus, les seuils des modèles prédictifs peuvent être ajustés pour augmenter la spécificité si l’objectif principal est d’identifier les variants les plus pathogènes. Il est important de fixer des seuils appropriés pour équilibrer le compromis entre sensibilité et spécificité et assurer une classification précise des variants. Dans notre étude, nous avons utilisé les seuils par défaut. En particulier, nous n’avons pas modifié le seuil en faveur de la capture des variants qui peuvent être plus susceptibles d’être pathogènes, car cela réduirait la portée des variants à examiner à plusieurs niveaux de notre analyse, comme décrit dans notre flux de travail. Il est également important de noter que lors du choix des données structurales pour la reconstruction tridimensionnelle de la protéine d’intérêt, il est nécessaire de procéder à un examen préliminaire des données structurales dans la littérature. L’examen structurel des récepteurs GABAA a récemment pris de l’ampleur avec des études structurelles robustes rapportant la structure tridimensionnelle de différents assemblages de récepteurs dans différentes conditions 26,27,82,83,84,85. Compte tenu de la disponibilité de ces données, dans notre étude, nous nous sommes concentrés sur les structures déterminées expérimentalement pour la reconstruction des données structurelles. Cependant, la prédiction d’AlphaFold64 peut être privilégiée pour l’analyse d’autres protéines qui manquent de telles données déterminées expérimentalement. Pour les données structurales dérivées d’études expérimentales, il est important de prêter attention à la numérotation des acides aminés. La numérotation PDB des acides aminés peut être différente de la numérotation UniProt, car la première peut ne pas inclure le peptide signal qui est éliminé pendant la maturation des protéines. De plus, les protéines chimériques exprimées dans le système expérimental peuvent provoquer des divergences. Dans ce cas, l’alignement par paires de la séquence d’intérêt avec la séquence dérivée des données structurelles aidera à préserver la cohérence. Dans la littérature, les données structurelles de la protéine de la sous-unité γ2 sont basées sur différentes méthodes, y compris des méthodes expérimentales telles que la microscopie électronique (EM) et la méthode de prédiction de haute précision AlphaFold. Si la méthode expérimentale ne couvre pas entièrement la séquence souhaitée avec une haute résolution, les prédictions AlphaFold peuvent être utilisées. Dans la présente étude, la structure 7QNE26 a été choisie car elle correspond à la structure cryogénique en microscopie électronique du récepteur synaptique humain α1β3γ2 GABAA. Cela représente exactement la combinaison de sous-unités de pleine longueur, qui était au centre de la présente étude.

De plus, pour l’analyse comparative, l’utilisation de paramètres normalisés de la cinétique des canaux doit être préférée, car les valeurs de ces paramètres peuvent varier en fonction de la composition de la sous-unité du récepteur et des paramètres expérimentaux. Par exemple,l’élévation τ et ladésactivation τ doivent être déterminées sur des variations x-fold sur les valeurs de contrôle de type sauvage. À l’étape 2.5 du protocole, pour un petit nombre de variants connus, une analyse de corrélation paramétrique ou catégorielle et la détermination des valeurs rho et p peuvent être préférées. Idéalement, on s’attend à ce que des méthodes telles que l’analyse en composantes principales produisent des relations plus précises, mais nécessitent un plus grand nombre d’échantillons.

L’environnement de simulation peut être modifié. Dans cette étude, Brian2 a été préféré pour les raisons suivantes : la classe spatialneuron de Brian2 fournit un outil précieux pour simuler l’activité neuronale. Brian2 a un avantage significatif en utilisant des équations différentielles pour décrire la dynamique continue et mettre à jour les instructions pour les événements discrets au lieu de s’appuyer sur des modèles prédéfinis de « boîte noire », ce qui conduit à une excellente lisibilité et adaptabilité du code puisque chaque aspect du modèle peut être explicitement défini dans un seul script Python, avec les équations du modèle énoncées en notation mathématique et seulement une infime quantité de vocabulaire spécifique à Brian utilisée37. Étant donné que le modèle est explicitement décrit, toutes les caractéristiques sont documentées et peuvent être trouvées dans le fichier de description de la simulation primaire, ce qui élimine le besoin de recourir aux modèles de « boîte noire » précédemment utilisés, comme mentionné dans les études de Stimberg et al.45,86.

Le modèle de neurone actuel utilise des conductances modifiées de type Hodgkin-Huxley46 avec Na+, K+ et courant de fuite. Ce modèle basé sur la conductance peut être encore élargi par l’inclusion de plusieurs autres types de canaux, tels que les canaux Ca2+ . Pour les modèles synapsiques, il est important de noter que ces paramètres doivent être obtenus pour des compositions de sous-unités spécifiques, et que seules les variantes avec des paramètres mesurés avec ces compositions doivent être évaluées. Dans cette étude, la composition du récepteur α1β3γ2 a été sélectionnée ; par conséquent, seules les variantes de α1, β3 ou γ2, avec des paramètres de cinétique de canal mesurés sur un récepteur α1β3γ2 GABAA , ont été incluses.

L’estimation de la biophysique cellulaire implique de segmenter la cellule en plusieurs compartiments cylindriques, chacun possédant potentiellement des caractéristiques de conductivité variables. Malgré les irrégularités dans les dendrites d’un neurone, elles peuvent être considérées comme des brins localement homogènes. De tels modèles aident à comprendre la structure complexe et le fonctionnement des cellules. La conception du modèle se concentre sur une version simplifiée de la morphologie réelle qui peut refléter ces caractéristiques.

L’emplacement et les caractéristiques physicochimiques de l’acide aminé altéré déterminent l’impact sur la cinétique du canal. Par exemple, une substitution d’acides aminés résultant en un acide aminé avec une chaîne latérale plus grande diminuera la conductance du canal si ce changement se produit sur un acide aminé tapissant le pore du canal. Les substitutions peuvent également affecter l’ouverture/fermeture du canal. Pour simplifier ce modèle, la cinétique de liaison au GABA n’est réduite qu’à un rapport de récepteurs disponibles ; Cependant, des modèles plus détaillés peuvent être conçus pour inclure cette interaction afin d’étudier l’impact possible des substitutions qui modifient l’affinité de liaison du ligand.

En conclusion, la présente étude utilise des méthodes informatiques pour prédire les variants pathogènes dans les sous-unités du récepteur GABAA et estimer qualitativement le phénotype cellulaire possible sur la base de la simulation de mutations associées à l’épilepsie dans le modèle de neurone pyramidal de l’hippocampe. À notre connaissance, il s’agit du premier protocole à explorer l’application combinée de la génétique computationnelle, de la modélisation moléculaire et des simulations neuronales pour évaluer comment les variantes génétiques peuvent contribuer au dysfonctionnement du récepteur GABAA à plusieurs niveaux de complexité, de l’ADN à la fonction des protéines et au comportement neuronal. Ce protocole peut fournir une base pour améliorer l’estimation des variants potentiellement délétères et de la pathologie neuronale associée dans l’épilepsie. De plus, il peut être utilisé dans l’étude d’autres canalopathies, ce qui permet de mieux comprendre le mécanisme sous-jacent des troubles neurodéveloppementaux et des réseaux pertinents. Sur cette base, en intégrant les évaluations structurelles et physicochimiques du récepteur GABAA pour examiner l’impact fonctionnel des variants et leur intégration dans la cinétique des canaux du récepteur GABAA , une analyse plus précise pourra être développée à l’avenir.

Déclarations de divulgation

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts lié à ce travail.

Remerciements

Nous remercions Çağla Koca pour son aide dans la construction du neurone modèle.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Brian2 Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, France; Imperial College London, United Kingdom2.8.0.4Stimberg et al., 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
dbNSFP server  Genos Bioinformatics LLC, USAv3.0Liu et al., 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
HOPE  Centre for Molecular and Biomolecular Informatics CMBI, Radboud University, Netherlands 1.1.1Venselaar et al., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
Jalview  University of Dundee, UKJV2Waterhouse et al., 2009 (https://www.jalview.org/)
Jupyter NotebookProject Jupyter, USAhttps://jupyter.org/install 
PhytonPython Software Foundation, USA3.13https://www.python.org/downloads/
Protter  ETH Zurich, SwitzerlandVersion 1.0Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R The R Foundation for Statistical Computing, USAR version 4.3.2  https://www.r-project.org/ 
RStudioPosit software, PBC, USARStudio 2023.12.1+402 "Ocean Storm" Releasehttps://posit.co/downloads/

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