Identification and Classification of Position-specific GABA A Receptor Subunit Missense Variants for Their Role In Hippocampal Pyramidal Neurons(해마 피라미드 뉴런에서의 역할에 대한 위치별 GABAA 수용체 소단위 미스센스 변이체의 식별 및 분류)

요약

이 연구는 DNA에서 단백질 기능 및 신경 행동에 이르는 다중 스케일 프레임워크를 소개합니다. 이 연구는 GABA_A 수용체 소단위체에서 예측된 병원성 돌연변이를 조사하기 위한 새로운 접근 방식을 제시하며, 병원성으로 예측되는 간질 유발 돌연변이와 근위 돌연변이가 CA1 피라미드 뉴런 모델에 유사한 효과를 일으킬 수 있다는 가설을 세웁니다.

초록

간질 관련 유전자에서 기능적으로 알려지지 않은 변이의 영향을 이해하는 것은 질병 병태생리학을 밝히고 맞춤형 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다. DNA 염기서열에서 단백질 기능 및 신경 행동에 이르는 다중 스케일 프레임워크를 통해 병원성 돌연변이를 예측하고 조사하기 위한 새로운 접근 방식을 설명하며, GABA_A 수용체 소단위체의 간질 유발 돌연변이와 인근에서 예측된 돌연변이가 CA1 피라미드 뉴런 모델에 유사한 효과를 생성할 수 있다는 가설을 세웁니다. 이 연구는 예측된 병원성 돌연변이와 근위 간질성 돌연변이 사이의 특징적인 관계를 탐구함으로써 간질성 돌연변이가 해마 피라미드 뉴런 시뮬레이션에 미치는 영향을 기반으로 예측된 돌연변이의 영향을 추정하는 것을 목표로 합니다.

이 방법론은 GABA_A 수용체 γ2 서브유닛 유전자 데이터 수집으로 시작하여 사용자 지정 스크립트를 사용하여 R에서 수행된 데이터 정리 및 형식 지정으로 이어집니다. 다음으로, 앙상블 예측기를 적용하여 γ2 subunit의 병원성 미센스 변형을 식별하고 우선 순위를 지정합니다. 간질 유발 돌연변이가 공유하는 소단위 구조 영역에 대한 특정 병원성 변이(예측)를 매핑하는 것이 설명되며, 그 영향에 대한 분자 모델링 및 진화적 보존에 대한 고려가 함께 제공됩니다. 그런 다음 변이체별 메타 분석 및 매개변수 정규화를 수행한 후 상관 관계 분석을 수행하여 예측된 돌연변이와 근위 간질 유발 돌연변이 사이의 중요한 관계를 식별합니다. Python 기반 신경 시뮬레이터를 사용하여 야생형 및 간질 유발 돌연변이의 영향을 반영하는 다중 구획 전도도 기반 뉴런 모델에 대해 설명합니다. 간질성 GABA_A 수용체 아형에 의해 생성된 신경 반응의 시뮬레이션은 예측된 병원성 변이가 신경 반응에 미치는 영향을 대략적으로 추정하기 위해 고려됩니다. 우리가 아는 한, 이것은 간질 연구에 중요한 GABA_A 수용체 변이체가 신경 행동에 미치는 영향을 추정하기 위한 다중 스케일 프레임워크를 탐구하는 최초의 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간질과 관련된 GABA_A 수용체의 잠재적인 병원성 변이체로 인한 세포 표현형의 예측을 향상시키기 위한 기초 역할을 할 수 있습니다.

서문

거의 모든 인간 질병의 경우, 유전적 변이는 개인의 감수성에 중요한 역할을 합니다. 따라서 염기서열 변동이 질병 위험과 어떻게 관련되어 있는지 이해하는 것은 질병 발생과 관련된 주요 과정을 밝히고 예방 및 치료를 위한 새로운 접근 방식을 식별하는 데 유용한 방법을 제공합니다¹. 이는 소아 1차 진료에서 가장 흔한 만성 질환 중 하나인 신경 발달 장애에도 적용된다². 자폐 스펙트럼 장애, 지적 장애, 간질과 같은 질환은 유전적 변이가 발달 중 개인의 감수성에 얼마나 큰 영향을 미치는지를 보여준다³.

발달 중인 뇌는 흥분과 억제 사이의 중요한 균형에서 유전적으로 프로그래밍된 신경 발달 불일치로 인해 성인 뇌보다 간질 발작에 더 취약합니다⁴. 성인 뇌의 주요 억제성 신경전달물질인 GABA(감마 아미노낙산)는 배아 및 출생 후 초기 발달 과정에서 흥분성을 일으키기 때문에 어린 뇌의 발작을 예방하는 데 필요한 안정성에 좋지 않습니다. K-Cl 공동수송체⁵의 충분한 발현 부족으로 인해 발생하는 이러한 일시적인 상태는 기능 장애가 있는 GABA_A 수용체가 존재할 때 발작 활동의 위험을 증가시키는 데 기여할 수 있습니다. GABA_A 수용체는 ^{Cl-ion 6}의 세포 내 농도에 따라 GABA의 흥분성 및 억제 작용을 매개합니다. 따라서 뇌가 성숙해짐에 따라 GABA_A 수용체를 암호화하는 유전자와 다른 이온 채널의 돌연변이는 흥분성을 왜곡시키고, 신경 세포 대사, 세포 신호 전달 및 시냅스 형성⁷에 관여하는 유전자의 돌연변이는 아동기 결석 간질8과 같은 질환을 유발할 수^있다.

신경 발달 장애 치료의 정밀도를 높이기 위해 유전자 분석을 활용하는 임상 개입이 점점 더 많아지고 있습니다². 소아 간질에서 유전자 검사는 정밀 의학 접근법⁹의 잠재적 표적을 제시하며, 치료 결정을 안내하는 데 있어 유전적 변이의 중요성을 강조합니다. 또한, 새로운 돌연변이가 있는 간질 환자의 ~25%가 정밀 의학의 잠재적 표적을 식별하는 유전자 진단을 받았으며, 이는 치료 결정을 안내하는 데 있어 유전적 변이의 중요한 가치를 강조합니다¹⁰. 이는 표적 유전자 패널(targeted gene panels), 전체 엑솜 염기서열분석(whole-exome sequencing), 전체 게놈 염기서열분석(whole-genome sequencing)과 같은 차세대 염기서열분석 기술의 발전에 힘입어 유전자 발견을 극적으로 가속화했습니다¹¹. 그러나 새로운 유전자 발견의 수가 증가함에 따라 질병 발병에서 변이체의 분자 역할에 관한 상충되는 증거 또는 불충분한 정보를 반영하는 분류인 VUS(Unknown Significance)가 발견될 때 문제가 발생합니다. VUS로 분류된 변이체는 ACMG(American College of Medical Genetics and Genomics) 및 AMP(Association for Molecular Pathology)에서 제안한 5단계 변이 분류 체계 내의 한 범주에 해당합니다¹².

기능적으로 알려지지 않은 유전적 변이의 문제를 해결하려면 임상 실습과 연구라는 두 가지 주요 차원에 걸친 노력이 필요합니다. 임상적으로 VUS를 둘러싼 불확실성은 환자 관리 및 의사 결정을 복잡하게 만들 수 있습니다¹³. 과학적 연구의 관점에서, 중요성이 불확실한 변이의 수가 증가함에 따라 병원성 변이를 식별하고 질병 병태생리학 및 표현형 효과에서 이들의 역할을 결정하는 것이 중요하다¹. 한 가지 이상적인 시나리오는 기능적으로 특성화되지 않은 모든 변이체의 분자, 신경 및 네트워크 수준 효과를 정확하게 예측하여 실험실 기반 조사에 필요한 자원, 시간 및 노력을 최소화하는 것입니다. 이러한 측면은 유전성 간질의 정확한 진단을 가능하게 하고, 맞춤형 치료를 지원하며, 잠재적인 약리학적 표적의 발견을 촉진하기 위해 유전적 변이를 정확하게 분류하는 것의 중요성을 강조합니다. 현재의 예측 도구 ^14,15,16,17은 비교적 정확하지만 일반적으로 이분법 분류(병원성 대 양성)만 제공하고 분자 병태생리학, 표현형 결과 및 기본 메커니즘에 대한 질병별 통찰력이 부족합니다. 본 논문은 선별된 GABA_A 수용체 서브유닛 인코딩 유전자의 알려지지 않은 미스센스 변이체에 초점을 맞추고, 분자적, 진화적, 구조적 측면과 같은 변이의 맥락적 요인과 간질 관련 돌연변이의 체외 생물물리학적 데이터에서 파생된 신경 병리학 시뮬레이션을 통합하여 연구 지침을 강화하는 것을 목표로 하는 프레임워크를 제시합니다. 우리의 방법론은 간질 ^18,19,20의 병태생리학에 관여하는 핵심 소단위인 GABA A 수용체의 γ2 소단위체의 알려지지 않은 병원성 변이체의 식별을 다룹니다. 그 다음에는 구조적 및 전기생리학적 데이터를 특징으로 하는 간질 관련 돌연변이와 이러한 예측된 변이의 위치별 일치에 대한 탐색이 이어집니다. 그런 다음 이러한 데이터를 사용하여 빠른 시냅스 억제를 담당하는 γ2, α1 및 β3 소단위(γ2-GABA_A 수용체)로 구성된 GABA_A 수용체 아형을 발현하는 해마 피라미드 뉴런 모델에 대한 변형 효과를 추정하는 데 사용됩니다⁶. GABA_A 수용체는 큰 소단위 풀(α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π 및 ρ1-ρ3)에서 조립되며 소단위 구성에 따라 GABA_A 수용체는 조절, 생물물리학적 특성, 특정 기능과 결합된 지역, 세포 및 세포 내 발현 패턴이 다르다는 점에 유의하는 것이 중요합니다 ^{6,21,22,23, 24,25}. 따라서 본 연구는 γ2-GABA_A 수용체 또는 γ2 함유 GABA_A 수용체에만 초점을 맞춥니다.

GABA_A 수용체 소단위는 긴 N-말단 세포외 도메인(ECD), 4개의 막관통 도메인(TM1 - TM4), TM1 및 TM2를 연결하는 세포 내 링커, TM2 및 TM3를 연결하는 세포 외 링커, TM3와 TM4 사이의 큰 세포 내 루프(TM3-TM4 루프) 및 짧은 세포 외 C 말단 ^{6,26, 27}. GABA_A 수용체는 GABA 결합이 β 및 α 소단위체를 잠그는 복잡한 "잠금 및 당기기" 메커니즘을 통해 기능하여 소단위의 세포외 도메인(ECD)을 당겨 시계 반대 방향으로 회전시키는 것으로 제안됩니다²⁷. 이러한 움직임은 막관통 도메인(TMD)을 구부려 이온 채널⁽²⁷)을 개방합니다. 따라서, 채널 활성은 GABA_A 수용체 내의 구조적 카세트와 함께 조정되는 것으로 보입니다. 간질 돌연변이는 이러한 구조적 카세트의 왜곡을 통해 채널 활동의 기능 장애를 유발하는 것으로 밝혀졌습니다²⁸. 결과적으로, 본 연구는 GABA_A 수용체 소단위체의 특정 구조 카세트에서 기능적으로 확인된 간질성 돌연변이에 근접하여 예측된 병원성 변이가 이러한 간질성 돌연변이의 사례에서 관찰된 바와 같이 채널 기능에서 유사한 전기생리학적 또는 생물물리학적 왜곡 패턴을 나타낼 수 있다는 아이디어에 기반을 두고 있습니다. GABA_A 수용체 서브유닛²⁸에 간질성 구조 카세트가 존재한다는 것은 간접적으로 이 개념을 뒷받침하지만, 본 연구는 간질성 돌연변이의 생물물리학적 매개변수를 예측된 병원성 돌연변이의 매개변수와 상관시키는 것의 복잡성과 도전을 보여줍니다. 이러한 복잡한 관계를 밝히기 위해 당사의 프레임워크는 DNA에서 단백질 기능 및 간질 연구에 중요한 신경 행동에 이르는 다중 스케일 접근 방식을 강조하기 때문에 중요합니다. 이 접근 방식은 컴퓨터 유전학을 분자 모델링 및 신경 시뮬레이션과 통합하는 동시에 채널 구조, 활성 및 신경 흥분성에 대한 돌연변이의 영향을 포착할 수 있는 대규모 데이터 세트에서 훈련된 기계 학습과 같은 보완 방법의 중요성을 강조합니다. 또한, 해마 피라미드 뉴런 모델에서 간질성 γ2-GABA_A 수용체 활성을 시뮬레이션하면 GABA_A 수용체 채널병증과 관련된 체외 세포 표현형을 복제하고 네트워크 기능 장애의 중심에서 변경된 단일 뉴런 반응을 입증할 수 있습니다.

프로토콜

1. 병원성 변이체의 인실리코(In silico ) 예측

1. 변형 데이터 수집
   1. ClinVar 데이터베이스²⁹를 사용하여 웹 사이트를 통해 관심 유전자의 코딩 영역에서 VUS(variants of uncertain significance)를 검색합니다 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. 검색창에 유전자 기호(예: GABRG2)를 입력하고 결과를 필터링하여 단일 뉴클레오티드, 유의성이 불확실한 미센스 변이와 같은 원하는 유형의 변이체만 포함합니다. 데이터를 data.xlxs (보충 파일 4: 보충 표 S1)로 다운로드하여 저장합니다. 다운로드한 데이터의 날짜를 기록합니다.
      참고: 본 프로토콜에서는 GABA_A 수용체의 인간 γ2 소단위체, 특히 호모 사피엔스 감마-아미노낙산형 A 수용체 소단위 감마2(GABRG2), 전사체 변이체 1, mRNA(NCBI 참조 서열: NM_198904.4), γ2L이라고도 함)를 분석합니다. 다른 계산 방법에 따라 다른 식별자가 필요할 수 있기 때문에 다른 데이터베이스(UniProt, ENSEMBL, PDB)에서 관심 유전자의 참조 전사체와 기타 해당 식별자를 기록하는 것이 중요합니다(보충 파일 4: 보충 표 S2). 데이터베이스 또는 계산 도구가 시퀀스 식별자의 버전 번호를 인식하지 못하는 경우 버전 번호가 있는 ID(NM_198904.4)와 버전 번호가 없는 ID(NM_198904)를 모두 시도합니다.
   2. 참고 단백질 기본 정보
      1. NCBI 데이터베이스 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 의 검색 옵션에서 Nucleotide를 선택하고 관심 유전자의 NCBI Ref. seq. ID(NM_198904.4)를 입력합니다. 그런 다음 오른쪽 열을 아래로 스크롤하여 관련 정보 범주 아래의 단백질을 클릭하여 전사체 NM_198904.4에 의해 인코딩된 단백질(NP_944494.1)을 찾습니다. 단백질 NP_944494.1에 대해 제공된 정보를 사용하여 특정 영역의 서열 위치를 표 형태로 기록합니다(보충 파일 4: 보충 표 S3).
         참고: 단백질 도메인, 인산화 부위, 리간드 결합 부위 및 분자 상호 작용 계면과 같은 기능적 및 구조적으로 중요한 영역, 모티프 또는 잔기의 서열 위치에 대한 예비 알려진 정보를 결정하는 것이 중요합니다. 이는 데이터베이스(NCBI, ENSEMBL, UniProt 등)와 문헌 검색을 결합하여 달성할 수 있습니다.
2. 변형 데이터 구성
   1. 선택한 예측 변수에 대한 입력 요구 사항을 충족하도록 데이터를 구성합니다. 검색된 데이터의 형식이 dbNSFP 서버 http://database.liulab.science/dbNSFP 의 요구사항과 일치하도록 구성되었는지 확인하십시오. 이렇게 하려면 data.xlsx 파일(1.1.1단계의 보충 파일 4: 보충 표 S1 )에서 불필요한 열을 제거하고 다음 열만 지정된 순서로 유지합니다.
      "GRCh38Chromosome", "GRCh38Location", "Name", "Protein change"입니다.
   2. 새 파일 이름 "data1.xlsx"(보충 표 S4)으로 파일을 저장합니다. 코드를 실행하여 R에서 data1.xlsx 파일의 형식을 지정합니다(Supplementary File 1: Data_GABAA. R)을 사용하여 형식이 지정된 데이터를 R 프로젝트와 관련된 작업 디렉토리에 data1_output.xlsx (보충 파일 4: 보충 표 S5)으로 저장합니다.
      참고: 계산 방법에 따라 데이터 유형과 형식이 달라야 합니다. 특정 형식 요구 사항에 따라 데이터를 수집하고 구성하는 것은 수십 개의 변형에 대해서도 오류가 발생하기 쉽고 시간이 많이 소요될 수 있으므로 변형 풀이 몇 개의 변형으로만 구성되지 않는 한 이 단계가 중요합니다. 그런 다음 수동 데이터 구성이 가능할 수 있습니다.
3. 병원성 예측
   1. data1_output.xlsx 파일의 내용을 http://database.liulab.science/dbNSFP 를 통해 액세스되는 dbNSFP 서버^30,31의 아카데믹 버전으로 전송합니다. 이렇게 하려면 파일을 복사/붙여넣기하거나 .txt 형식으로 직접 업로드하십시오.
   2. 제출하기 전에 서버에서 HG38(게놈 빌드), ClinPred³² 및 BayesDEL³³ 옵션을 미리 선택하고 확인해야 합니다. 몇 분 내에 서버가 결과를 생성합니다.
      참고: 본 프로토콜에서는 높은 정확도(³⁴)와 실용성을 위해 두 개의 앙상블 예측변수, 즉 BayesDEL³³ 및 ClinPred³²가 선택되었습니다. 그러나, dbNSFP 데이터베이스(^30,31)에서 사용 가능한 AlphaMissense와 같은 다른 예측 변수도 선택할 수 있습니다. 인실리코(in silico) 도구의 선택은 강력한 예측을 위한 충분한 여러 라인의 계산 증거의 생성을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다¹². 여러 예측 알고리즘의 분석을 통합하는 앙상블 예측 변수는 이러한 목적을 달성할 수 있습니다.
   3. 출력 파일(.txt 형식)을 다운로드하여 data2.xlsx 파일로 저장합니다(보충 파일 4: 보충 표 S6).
   4. data2.xlsx(Supplementary File 4: Supplementary Table S6)에서 메뉴에서 필터 옵션을 클릭하고 D를 필터링하여 두 열의 합의 변형을 결정하여 필터를 설정합니다. 이것은 가장 병원성 변이의 목록을 제공합니다. 저장하십시오(보충 표 S6 [ 보충 파일 4]의 합의 탭 참조).
4. 변형 선택
   1. 합의된 병원성 예측 중에서, 문헌에서 얻은 간질성 돌연변이에 근접한 변이체를 결정합니다. 후자가 뉴런 모델링에 적합한 구조적 및 생물물리학적 매개변수를 가지고 있는지 확인합니다.
      참고: 이 단계는 탐색적이며 구조적, 물리화학적, 생물물리학적 매개변수 측면에서 관심 단백질을 조사하는 것과도 관련이 있습니다. 본 연구에서, 이러한 데이터는 간질 관련 돌연변이에 대한 조사와 더불어 Brünger et ^al.35 및 Guo et ^al.36에서 얻은 것입니다. 게다가, 옵션으로, AlphaMissense³⁷ 점수는 dbNSFP 데이터베이스^30,31 반복 단계 1.3 (보충 파일 4 : 보충 표 S7)에서 액세스되었습니다. 자세한 내용은 프로토콜 섹션 2.1.1 및 2.1.2 및 결과("구조적 및 생물물리학적 매개변수에 대한 클러스터링 변형" 참조)에 나와 있습니다.
   2. 기본 시각화를 위해 Protter³⁸ ((https://wlab.ethz.ch/protter/start/) 및 HOPE³⁹ (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/) 서버를 사용하여 선택한 GABRG2 유전자 돌연변이(P302L⁴⁰ 및 K328M(또는 39-잔기 신호 펩타이드를 제외한 경우 K289M⁴¹))의 맥락에서 이전 단계의 변이체를 검사합니다.
      참고: 복잡성이 엄청나기 때문에 변형 효과의 구조적 평가는 여러 수준의 분석에서 수행되어야 합니다. Protter³⁸ 과 같은 도구를 사용하면 단백질의 토폴로지 특징과 관련하여 변이체를 명확하게 시각화할 수 있으며 HOPE³⁹ 와 같은 사용자 친화적인 서버는 분자 모델링을 통해 변이체 효과에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한, 관심 단백질에 대한 포괄적인 문헌 검토는 간질과 관련된 돌연변이에 대한 정보를 식별하고 통합하는 데 중요합니다.
   3. 진화적 보존 및 구조적 통찰력 분석
      1. 단백질의 편집, 시각화 및 분석을 위한 오픈 소스 프로그램인 Jalview 42,43,44를 엽니다.
      2. 정렬을 위해 시퀀스를 가져옵니다. 상단 메뉴에서 File(파일 )을 클릭합니다 | 시퀀스 가져오기; 대화 상자에서 데이터베이스 (예: UniProt)를 선택합니다. ID 검색 탭을 클릭하십시오. 대화 상자에 설명된 대로 인간 및 기타 척추동물 종의 관심 유전자(GABRG2)의 UniProt 식별 ID를 입력합니다: P18507, P22723, Q6PW52, A0A2I3TKX0, F1RR72, A0A8I3MDZ2, A0A8M1P4D6. 확인을 클릭합니다.
         참고: GABRG2 에 의해 암호화된 단백질의 UniProt 등록 번호는 다음과 같습니다: 호모 사피엔스의 경우 P18507 (P18507-2), Mus musculus의 경우 P22723, Pan troglodytes의 경우 A0A2I3TKX0, Sus scrofa의 경우 F1RR72, Canis familiaris의 경우 A0A8I3MDZ2, Danio rerio의 경우 A0A8M1P4D6.
      3. 관심 유전자에 따라 일부 염기서열에는 주석이 표시되지 않을 수 있습니다. 따라서 BLAST 검색을 수행하여 더 나은 컨텍스트 이해를 위해 관련 정보와 잠재적 동질체를 식별합니다. 이 경우 파일 메뉴의 Add Sequences/From 텍스트 상자 옵션을 통해 단백질 염기서열의 FASTA 형식을 업로드하여 원하는 염기서열의 다중 염기서열 정렬을 생성합니다.
      4. 정렬이 로드되면 여러 시퀀스 비교를 위해 표시된 시퀀스를 관찰합니다. 각 행은 시퀀스를 나타내고 각 열은 정렬의 위치를 나타냅니다. 최상의 정렬 방법을 결정하려면 다른 접근 방식을 사용하십시오. 예를 들어, 시퀀스 메뉴에서 웹 서비스를 클릭하고 사전 설정으로 T-Coffee 실행 옵션을 선택하면 최적의 정렬이 가능합니다.
      5. P18507 Homo sapiens 서열(본 연구의 참조 서열)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 참조 서열로 설정합니다. 상단 메뉴에서 Format을 선택하고 Wrap을 클릭하여 화면에서 전체 정렬을 시각화합니다. 동일한 Format 메뉴에서 위의 눈금을 클릭하여 특정 잔류 번호의 시각화를 향상시킵니다. 시각화를 더욱 향상시키려면 Color(색상)로 이동하여 다른 옵션(예: Clustal Color, Chemical Property)을 선택하여 색 구성표를 조정하십시오. 필요한 경우 글꼴 크기를 수정합니다.
      6. 메뉴 표시줄에서 Calculate 를 클릭하고 Autocalculate consensus 를 선택하여 보존된 영역을 강조 표시합니다.
      7. 인실리코(in-silico) 예측 단계에서 식별된 관심 변이체의 위치에 초점을 맞추고 특정 변이체 위치를 조사합니다. 특정 잔여물을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Add Annotation을 선택하여 주석을 추가합니다. 적절한 색상 코드가 있는 레이블(예: 변형 ID)을 작성하고 저장합니다.
         참고: 본 분석에서는 P302L(보라색) 및 A303T(빨간색)를 선택하여 구조 데이터와 함께 다중 시퀀스 정렬로 시각화했습니다(다음 섹션 참조).
   4. 선택된 보존된 잔류물을 보여주는 전체 단백질의 3차원 재구성
      1. 이전 단계에서 얻은 파일에서 참조 시퀀스(GABRG2 human)를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 3D 구조 데이터를 선택합니다.
      2. 드롭다운 메뉴에서 적절한 구조 데이터(7QNE, 체인 C)²⁶ 을 식별하고 Jmol로 새 구조 보기 열기를 선택합니다.
         참고: 이렇게 하면 다중 염기서열 정렬에서 선택한 잔류물을 3D 화학 구조에 대한 오픈 소스 Java 기반 뷰어인 Jmol에 의해 구조 데이터에 통합할 수 있습니다.

2. 파라미터 선택 및 생물물리학적 모델링

1. Variant-specific meta-analysis 및 parameter normalization
   1. 최신 문헌을 조사하여 전기생리학적 데이터 채널 컨덕턴스(g_GABAA), 비활성화 시간(τ_비활성화), 상승 시간(τ_상승) 및 최대 전류 진폭(I_max)을 사용하여 식별된 서브유닛 변형을 수집합니다. 각 사례에 대한 subunit compositions, cell type 및 wild-type 측정값을 제공합니다. 그에 따라 변이체와 그 대조군에 레이블을 지정합니다(예: 생물물리학적 특성이 식별된 변이체 및 각 변이체에 대한 야생형 측정에 대해 알려진 대조군으로 알려짐).
   2. 식별된 생물물리학적 특성을 가진 변이체에 대한 AlphaMissense 병원성 점수를 얻습니다.
      참고: 자세한 내용은 프로토콜 섹션 1.3을 참조하십시오.
   3. 각 변이체에 대한 소단위 및 아미노산 위치, 원래 아미노산과 변경된 아미노산, 병원성 점수 및 문헌에서 얻은 생물물리학적 매개변수가 포함된 데이터 프레임을 만듭니다. 실험적 불일치를 방지하려면 식별된 변이체에 대한 생물물리학적 매개변수를 야생형 측정에서 x-fold 변화로 정규화합니다.
2. 구조적 및 기능적 특성에 의한 비교 변형 분석
   1. 데이터 프레임에서 예측된 변형을 구성합니다. 그에 따라 라벨을 부착합니다(예: 생물물리학적 특성에 대한 문헌이 없는 변이체에 대해 예측됨).
   2. 변이체를 아미노산 서열과 3차 구조에서의 위치에 따라 분류합니다. 데이터 프레임에 구조적 분류 매개변수(예: 알파 나선, 코일, 베타 시트, 세포 외, 세포 내 또는 막관통 도메인의 국소화, 기공 내벽, 작용제 결합, 단백질-단백질 상호 작용)를 추가하고 아미노산 위치와 관련하여 각 변이체에 대한 정보를 제공합니다.
   3. 변형체를 막 중심과 공극 축까지의 거리에 따라 분류합니다. 데이터 프레임에서 pore axis에 대한 거리와 membrane center 매개변수까지의 거리를 추가합니다.
   4. 알려진 변이에 대한 구조적 및 생물물리학적 매개변수 간의 상관관계를 분석합니다. 가능한 경우, 얻어진 상관 관계에 대해 예측된 변형을 평가합니다.
3. Synapse 및 뉴런 모델 구성
   1. 스파이크 신경망을 모델링하고 시뮬레이션하기 위해 Python으로 개발된 오픈 소스 신경 시뮬레이터인 Brian2⁴⁵를 사용하여 다중 구획 전도도 기반 해마 피라미드 뉴런에서 GABAergic 시냅스의 다중 구획 생물물리학 모델을 구축합니다.
   2. 이온 채널 게이팅 동역학, 수동 및 능동 매개변수, 시냅스후 전도도를 정의하여 컨덕턴스 기반 모델을 설계합니다. 모델에 사용된 방정식을 설명하는 Supplementary File 2에 제공된 대로 컨덕턴스 기반 모델을 정의합니다.
      1. 멤브레인 커패시턴스_(Cm)를 1μF^/cm2 로 설정하고 세포 내 저항(_RA)을 200 Ω.cm로 설정합니다.
      2. g_L= 0.0003 S/cm², g_K= 0.036 S/cm², E_L = -76.5 mV, E_Na = 50 mV, E_K = -90 mV인 해마 피라미드 뉴런³⁹에 대해 수정된 Hodgkin-Huxley 유형 전도도를 사용합니다.
      3. g_Na에 대한 Na_V 채널의 밀도 분포를 soma의 경우 0.05 S/cm², 축삭 초기 세그먼트(AIS) 및 Ranvier(NR)의 노드에 대해 0.5 S/cm², 수상돌기의 경우 0.005 S/cm²로 조정합니다. 수초분절에서 g_K 및 g_Na를 0으로 설정합니다.
      4. 보충 파일 2에 설명된 대로 Na_V 및 K_V에 대한 이온 채널 게이팅 역학을 구축합니다.
      5. 시냅스 전류(I_syn)를 구획에 있는 모든 글루타메이터 시냅스와 GABAergic 시냅스의 합으로 소개합니다. 글루타메이터 전류(I_glu)에 빠른 AMPA 수용체 매개 전류(I_AMPA)와 느린 NMDA 수용체 매개 전류(I_NMDA)를 모두 포함합니다. GABAergic 전류(I_GABA)에 빠른 GABA_A 수용체 매개 전류만 포함합니다. 일정한 양의 글루타메이트가 모든 시냅스전 스파이크에 대해 시냅스로 방출된다고 가정합니다. 따라서 수용체의 활성화는 스파이크 시간에 따라 달라지며(s_AMPA 및 s_NMDA) 총 수용체 전도도(g_AMPA 및 g_NMDA)는 모든 이벤트에서 방출되는 글루타메이트의 양을 반영합니다.
      6. 보충 파일 2에 설명된 대로 시냅스 모델을 사용합니다.
         참고: 방정식에 대한 자세한 설명은 모델에 사용된 방정식을 설명하는 보충 파일 2 를 참조하십시오.
   3. 이전 문헌^46,47에서 실험적으로 측정된 소마 및 신경돌기에 대한 직경과 각 신경돌기 구획의 길이 및 분기 패턴을 얻습니다. 세포를 여러 구획으로 나누어 실제 뉴런 형태를 다중 구획 모델로 축소하여 주요 분기 구조를 정확하게 보존하고 양측 대칭을 유지합니다.
   4. 형태학적 (세그먼트 길이 및 직경, 즉, d_soma: 30 μm, l_AH: 5 μm, d_AH_i: 1.5 μm, d_AH_f: 1.3 μm, l_AIS: 40 μm, d_axon: 1 μm, l_myseg: 100 μm, l_NR: 2 μm, l_AxTer: 4 μm, d_AxTer: 2 μm, l_approx: 100 μm, l_apmed: 100 μm; l_apdis: 200 μm; d_approx_i : 4 μm; d_approx_f : 3 μm; d_apmed : 2 μm; d_apdis : 2 μm; l_apLM : 70 μm; d_apLM : 2 μm; l_nAcDbasal: 400 μm; d_nAcDbasal : 1.4 μm; l_nAcDbasal_stem : 20 μm; d_nAcDbasal_stem: 1.5 μm) 및 피라미드 뉴런 모델^46,47의 각 구획에 대한 생물물리학적 매개변수(섹션 2.3.2에 주어진 대로)는 Python 스크립트(보충 파일 3: GABAAvar.py)에도 자세히 설명되어 있습니다.
   5. 2.1.1단계에서 얻은 야생형 제어 측정값을 평가하여 GABAergic 시냅스 모델에 대한 생물물리학적 매개변수를 결정합니다.
4. 뉴런 모델의 토폴로지를 설계하고 이전에 얻은 형태학적 및 분기 정보를 기반으로 구획의 공간 배열 및 상호 연결을 지정하는 것을 포함하는 형태학적 및 생물물리학적 매개변수를 할당합니다. 보충 파일 3: GABAAvar.py 에 설명된 대로 적절한 형태학적(예: 세그먼트 길이 및 직경) 및 생물물리학적 매개변수(섹션 2.3.2)를 모델의 각 구획에 할당합니다.
5. 시냅스 구축 및 전류 주입
   1. "GABAAvar.py"(보충 파일 3)에 지정된 대로 SpikeGeneratorGroup(Brian2 라이브러리의 클래스)을 사용하여 시냅스 전 활동을 만듭니다. Synapses 클래스를 사용하여 스파이크 생성기를 모델 뉴런의 타겟 컴파트먼트에 연결하여 시냅스 연결을 모델링합니다.
   2. 지속적인 정전류(I_inj)를 0.85nA로 설정하고 soma에 배치하여 보충 파일 3: GABAAvar.py 에 설명된 대로 주어진 시간에 기준선 이온 전류 부하에 의해 구동되는 하위 임계값 활동을 모방합니다.
6. 기록 모니터를 구축하려면 StateMonitor 를 사용하여 타겟 컴파트먼트의 전압 트레이스를 기록합니다.
7. 네트워크를 구축하고 실행합니다.
   1. Network를 사용하여 모델 뉴런, 연결, 모니터로 네트워크를 구축합니다.
   2. 시뮬레이션의 시간 단계를 defaultclock.dt (예: 0.01ms)로 설정합니다.
   3. network.run(T*ms)을 사용하여 네트워크에서 시뮬레이션을 실행하며, 여기서 T는 이 예제에서 1,000ms로 설정됩니다.
8. GABA_A 수용체 미감지 돌연변이의 영향 테스트
   1. 2.1.1단계에서 수집된 생물물리학적 매개변수를 통해 채널 동역학에 대한 각 미센스 돌연변이의 영향을 정의합니다.
   2. 이러한 파라미터를 변경하여 자극을 실행하고 "GABAAvar.py"(보충 파일 3)에 지정된 대로 "matplotlib.pyplot"을 사용하여 결과를 플로팅합니다.
9. 발사 패턴과 속도의 변화를 분석하기 위해 매개변수 조합을 테스트합니다. 비교를 위해 결과를 플롯합니다.

결과

이 연구는 간질 병태생리학의 핵심 구성 요소인 GABA_A 수용체의 γ2 소단위체에서 병원성 변이를 예측하고 특성화하기 위해 멀티스케일 접근 방식을 사용합니다. 이 접근 방식은 예측 모델, 분자 모델링, 진화 보존, 구조 검사, 상관 관계 분석 및 신경 시뮬레이션을 사용하여 변이의 분류를 향상시키며, 이는 간질 연구 및 임상 사용에 상당한 관련성을 갖습니다. 방법론의 전체 요약은 그림 1에 나와 있습니다.

인접한 두 γ2 subunit 돌연변이의 비교 평가

GABA_A 수용체 소단위체의 간질성 돌연변이에 인접한 예측된 병원성 돌연변이가 채널 기능과 신경 행동에 유사한 전기생리학적 효과를 생성할 수 있다는 가정을 바탕으로 먼저 잘 알려진 간질성 돌연변이와 γ2 소단위체의 근위 예측 돌연변이 사이의 관계에 대한 간략한 조사를 수행했습니다.

병원성으로 예측된 변이체(보충표 S6) 중, A303T(rs1581439874, ClinVar Accession: VCV000663033.6)를 예로서 선택하였다. 앙상블 모델에 의한 예측 외에도 A303T의 병원성은 AlphaMissense 점수에 의해 확인되었습니다(보충 파일 4: 보충 표 S7). A303T는 그림 2와 같이 GABA_A 수용체 γ2 소단위체의 두 번째 막관통 도메인에 있으며 간질 유발 돌연변이 P302L⁴⁰ 옆에 위치합니다. 분자 모델링을 통해 평가한 바와 같이, γ2P302L 및 γ2A303T 치환은 모두 그림 3과 같이 더 큰 곁사슬을 가진 아미노산을 생성했습니다. 돌연변이체와 야생형 잔기는 모두 γ2P302L 돌연변이에서 무극성인 반면, γ2A303T에서 돌연변이체 잔기는 극성 측쇄를 가지고 있고 야생형 잔기는 비극성 측쇄를 가지고 있습니다. P302 및 Ala303은 모두 β3 소단위체와의 소단위 상호 작용 인터페이스에 있습니다(각각 7QNB 및 7QNA에서 관찰됨). P302와 Ala303은 모두 비슷한 SASA(solvent-accessible surface area)를 가지고 있습니다. 또한, 두 잔류물 모두 척추동물의 진화 기간 동안 100% 보존되어 있습니다(그림 4, 상단 패널). GABA_A 수용체 단백질의 3차원 재구성에서 노란색으로 표시된 것처럼 둘 다 γ2 소단위의 두 번째 막관통 영역(TM2 영역) 인근에 위치합니다(7QNE²⁶, 빨간색으로 표시된 A303은 이 도메인의 첫 번째 잔기입니다(그림 4). 이러한 유사한 특징을 기반으로 피라미드 뉴런 모델을 사용하여 γ2 소단위 돌연변이 P302L⁴⁰과 같은 근위 간질 유발 돌연변이의 시뮬레이션은 신경 반응에 대한 예측된 변이체(γ2A303T)의 영향에 대한 예비 특성화에 사용될 수 있습니다. 다음 단계에서는 GABA_A 수용체 소단위 내의 더 광범위한 변이체로 분석을 확장했습니다.

구조적 및 생물물리학적 매개변수에 대한 클러스터링 변형

이전 섹션에서 인접한 두 돌연변이에 대한 비교 평가에 이어, 변이체 간에 공유되는 분자 특징을 식별할 수 있는지 여부를 평가하기 위한 체계적인 접근 방식을 구현했습니다. 이 단계는 아미노산과 변이체 전반에 걸쳐 구조적, 물리화학적, 생물물리학적 특징에서 일관된 패턴이 나타나는지 여부를 탐색하는 것을 목표로 하여 초기 가설을 추가로 뒷받침했습니다.

본 연구에서 사용된 데이터 프레임 및 참고 문헌은 보충 파일 4: 보충 표 S8 40^{, 48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60}에 제공되고, 61,62,63, 보충표S9³⁶ 및 보충표S10³⁵. 또한, 각 소단위체 및 소단위체 구분 없이 모든 변이체에 대해 구조적 및 생물물리학적 매개변수 간의 상관관계를 측정하였다(보충 파일 4: 보충 표 S11, 보충 표 S12, 보충 표 S13, 보충 표 S14 및 보충 표 S15). 구조적 매개변수(알파 나선, 코일, 베타 시트의 국소화, 세포 외, 세포 내 또는 막관통 도메인, 공극 내벽, 작용제/알로스테릭 결합 및 단백질-단백질 상호 작용)에 대한 정보는 Brünger et ^al.35에서 얻었습니다. 생물물리학적 매개변수는 HEK(Human Embryonic Kidney) 293 세포에 대한 패치-클램프 전기생리학 연구에서 얻었습니다. 값은 각각의 야생형 수용체 활성화 시간(τr) 및 비활성화 시간(τd) 상수로 정규화되었습니다.

본 연구는 GABA_A 수용체 소단위체에서 기능적으로 확인된 돌연변이에 인접하거나 근접한 아미노산 변이체가 이러한 돌연변이의 사례에서 관찰된 바와 같이 채널 기능의 전기생리학적 변화의 유사한 패턴을 나타낼 수 있다는 아이디어에 기반을 두고 있기 때문에 구조적, 물리화학적, 생물물리학적 매개변수 간의 관계 가능성을 탐구했습니다. 멤브레인 중심과 공극 축으로부터의 거리에 대한 변이체의 위치는 그림 5와 그림 6에 나와 있습니다. 이러한 맥락에서 AlphaMissense³⁷의 점수(보충 파일 4: 보충 표 S7)도 사용했습니다. 매우 정확한 단백질 구조 예측 모델인 AlphaFold2⁶⁴에 의해 구동되며, 이는 기본 아미노산 서열을 입력으로 활용할 수 있습니다. AlphaMissense는 단일 아미노산 치환의 구조적 측면에 대한 단서를 제공할 수 있습니다. GABA_A 수용체 소단위체(각각 GABRA1, GABRB3, GABRG2 유전자에 의해 암호화된 α1, β3, γ2 소단위)의 변이체 위치(아미노산 위치, 막 중심까지의 거리, 공극 축까지의 거리)에 대한 알려진(검은색) 및 예측된(빨간색) 변이체에 대한 AlphaMissense 점수의 분포는 그림 7에 나와 있습니다.

그림 7A-C는 아미노산 위치에 걸친 AlphaMissense 점수 분포를 보여주고, 그림 7D-F는 공극 축에서 정규화된 거리에 대한 AlphaMissense 점수 분포를 보여주며, 그림 7G-I는 막 중심으로부터의 거리에 대한 AlphaMissense 점수 분포를 보여줍니다. 그림 7의 상관 관계 분석은 새로 식별된 변이체의 결과를 예측하기 위해 구조적 특성을 통해 기본 관계를 확인하는 것이 어렵다는 것을 보여주었습니다. b2 subunit(GABRB2 유전자에 의해 암호화된) 변이체는 더 넓은 분석을 수행할 수 있도록 클러스터링 및 상관 관계 섹션에 포함되었습니다. 그러나 GABRA1에 의해 인코딩된 α1 소단위체(그림 7A,D,G), GABRB3에 의해 인코딩된 β3 소단위체(그림 7B,E,H) 및 GABRBG2에 의해 인코딩된 γ2 소단위체(그림 7C,F,I)의 변형만 생물물리학 모델에 포함되었는데, 이는 이 모델이 해마 피라미드 뉴런의 기능과 GABA_A의 α1β3γ2 조합에 초점을 맞추기 때문입니다 수용체 소단위(receptor subunit)는 해마에서 가장 널리 퍼진 조합이다⁶⁵. 마찬가지로, α1β3γ2 GABA_A 수용체에서 채널 동역학이 연구되지 않은 α1, β3 또는 γ2의 모든 변형도 시뮬레이션에서 제외되었습니다. 본 분석에서 GABA_A 수용체 돌연변이(보충 파일 4 및 보충 표 S8)의 영향에서 파생된 AlphaMissense 점수와 생물물리학적 매개변수(정규화된 활성화 및 비활성화 시간) 사이에는 가벼운 상관관계(보충 그림 S1 및 보충 그림 S2)가 있었습니다. 이는 병원성으로 예측되는 돌연변이(AlphaMissense 점수에 기반)가 수용체 역학(receptor kinetics)의 측정 가능하고 잠재적으로 파괴적인 변화(예: 활성화 및 비활성화 시간)로 이어질 수도 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 그림 7의 위치 상관 관계 간의 상관 관계가 없기 때문에 인접한 아미노산이 생물물리학적 특성에 대해 유사한 결과를 가질 것이라는 생각에 기반한 가정에 AlphaMissense 점수를 활용하기가 어렵습니다.

알려진 변형체의 활성화 및 비활성화 동역학에 대한 공극 축까지의 정규화된 거리의 분포는 그림 8 및 그림 9에 나와 있습니다. γ2 소단위체에 대한 아밀드 상관관계가 있으며(그림 8C), 이는 인접한 아미노산이 유사한 결과를 가져올 것이라는 가정에 기초한 우리의 가설이 일부 영역, 특히 수용체 채널의 공공 영역인 TM2 영역 근처에서 적용될 수 있음을 시사합니다. 이 영역은 참조 간질 유발 돌연변이(그림 2 및 그림 4; γ2P302)에 인접해 있어 신경 시뮬레이션에 비교적 적합한 후보입니다. 이를 바탕으로 γ2A303T(그림 2 및 그림 4)와 같은 인접 예측 돌연변이의 영향을 대략적으로 추정할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 α1β3γ2에 대한 측정값만 고려합니다. 따라서, 본 모델에서 평가된 변형은 보충 파일 4:보충 표 S16에 제공된 변형으로 제한되었습니다.

GABA에 대한 돌연변이의 효과_CA1 피라미드 뉴런 발화의 수용체 매개 억제

GABA_A 수용체 매개 억제에 대한 돌연변이의 효과는 다중 구획 전도성 기반 CA1 피라미드 뉴런 모델에서 입증되었습니다. GABA_A 수용체 미센스 변이가 해마 피라미드 뉴런 기능에 미치는 영향은 CA3 및 내후각 피질(EC) III 피라미드 뉴런의 돌기에서 뉴런에 대한 정점 입력의 GABAergic 션트를 통해 탐색할 수 있습니다. 즉, GABA_A 수용체의 활성을 시뮬레이션하는 한 가지 방법은 시뮬레이션이 GABAergic 억제의 메커니즘 중 하나인 션트 억제와 같은 수용체의 생리학적 중요성에 대한 현실적인 가정을 나타내는 컨텍스트를 가정하는 것입니다. 일반적으로 정점 수상돌기에 있는 CA1 해마 피라미드 뉴런은 이 영역에서 GABA_A 수용체를 가지고 있으며, 이는 CA3 및 EC III의 뉴런의 돌기에 의해 표적으로 됩니다. 따라서 이 배열은 시뮬레이션에 적합합니다. 이 연구 질문에는 다양한 지연과 강도를 가진 입력 설계가 필요합니다. 따라서, 그림 10과 같이 3개의 서로 다른 글루타메이터 시냅스(gluTmatergic synapse, GluS1/2/3)를 원위 정점, 내측 정점 및 기저 수상돌기에 배치하고 순차적으로 활성화했습니다. 시냅스 입력의 영향을 평가하기 위해 정전류 진폭은 최소 스파이크 트리거 임계값(I_inj <_{I min}) 미만으로 유지되어야 합니다. 야생형 또는 돌연변이 GABA_A 수용체를 가진 피라미드 뉴런 모델은 체마에서 0.85nA의 일정한 전류 주입으로 시작되었습니다. 그런 다음 GABAergic 시냅스를 소마에 배치했습니다. 스파이크 발생기(spike generator)에 의해 모방된 시냅스전 활동(presynaptic activity)은 원위 정점 수상돌기(distal apical dendrite)에서 먼저 시작되었다. 내측 정점 및 기저 수상돌기에 대한 시냅스 입력은 각각 25ms 및 50ms 지연되었습니다. GABAergic 시냅스가 40ms 지연으로 활성화되었습니다. GABAergic 억제 강도는 첫 번째 스파이크를 제외한 전체 스파이크 트레인이 억제되도록 조정되었습니다. 그런 다음 이 설정에서 τ_상승, τ_비활성화 및 g_GABAA를 변경하여 변형의 영향을 탐색합니다.

야생형 및 돌연변이 수용체에 대한 매개변수는 프로토콜 단계 2.1.1에 기술된 수집물로부터 얻어졌으며, 특히 해마 피라미드 뉴런에서 가장 풍부한 소단위 구성인 α1β3γ2로 구성된 수용체에 대해 설명했습니다⁶⁵. 파라미터 분포는 보충 파일 4: 보충 표 S16에 나와 있습니다.

각 소단위 돌연변이는 단일, 이중 및 삼중 글루타메이터 시냅스 사례에서 테스트되었습니다. 간단한 접근 방식으로, 발사 속도와 패턴에 대한 돌연변이의 영향을 평가할 수 있습니다. Δt_ISI 평균과 표준 편차는 발사 패턴의 변화를 추가로 측정하기 위해 추정할 수도 있으며, 여기서 Δt_ISI 는 스파이크 간 간격의 변화를 나타냅니다. 각 사례에 대한 결과는 발화율 및 Δt_ISI(평균 및 표준 편차)로 보충 파일 4: 보충 표 S17 및 보충 그림 S3에 제공됩니다. 발사 패턴을 변경한 변형에 대한 스파이크 트레인 및 전압 트레이스는 그림 11, 그림 12 및 그림 13에 나와 있습니다.

단일(GluS1) 및 삼중(GluS1-2-3) 글루타메이터성 시냅스 활성화의 경우, 뉴런 반응을 변화시킨 돌연변이는₃개의 N110D 및 γ2K328M 돌연변이에서만 β되었습니다. 단일 글루타메이터 투입 사례에서 β3N110D는 억제 장애를 일으켰고, 발사 패턴은 짧은 지연으로 4^번째 시냅스전 스파이크 후 글루타메이터성 스파이크 트레인에 고정되었습니다(그림 11). γ2K328M은 또한 5^번째 시냅스전 스파이크 부근에 불과하지만 억제를 손상시켰고, β3N110D에 비해 시냅스후 스파이크에서 더 큰 지연을 도입했습니다(그림 11). GluS1-2-3 활성화 사례(그림 13)에서 β3N110D와 γ2K328M 돌연변이 간의 반응은 유사했습니다. 두 돌연변이 모두 거의 모든 누적된 시냅스전 스파이크가 감지되고 반응을 유발하는 발사 패턴을 생성했습니다. 두 경우 모두, 뉴런 모델은 시냅스전 활동에 대한 반응으로 스파이크 쌍으로 발사되었습니다.

이중 글루타메이터성 시냅스 활성화는 다른 두 설정과 비교하여 뚜렷한 결과를 산출했습니다(그림 12). 이 경우, GABA_A 수용체 b3 소단위체의 두 돌연변이(β3N110D 및 β3T288N)와 GABA_A 수용체 γ2 소단위체의 두 돌연변이(γ2P302L 및 γ2K328M)가 GABAergic 억제를 손상시켰습니다. γ2P302L 돌연변이를 가진 뉴런 모델은 GluS2와 거의 동시에 발사되었는데, 이는 GluS1-2 사이의 시냅스전 스파이크가 거의 동일한 지연을 가진 GluS1에 대한 지연된 반응일 가능성이 가장 높습니다. β3T288N 돌연변이도 유사한 결과를 보였는데, 두 번째 스파이크의 구별은 여전히 GluS2와 동기화되어 있습니다. β₃N110D 돌연변이를 가진 뉴런 모델은 더 짧은 Δt_ISI로 도입된 GluS1/2의 처음 두 개의 시냅스전 스파이크를 제외하고 거의 모든 누적된 글루타메이트 입력에 반응했습니다. γ2K328M의 발사 패턴은 다시 β3N110D와 같았으며, 두 번째와 세 번째 시냅스전 스파이크의 구별이 누락되었습니다.

이러한 결과는 b3 소단위체( GABRB3 유전자에 의해 암호화됨) 및 γ2 소단위( GABRG2에 의해 암호화됨) 돌연변이가 해마 피라미드 뉴런 활동에 미치는 다양한 효과를 보여줍니다. 흥미롭게도,₃L170R, β₃A305V,_{β 3}E180G, β₃D120N, β₃Y302C, γ₂R82Q β 돌연변이는 신경 활동에 어떠한 변화도 가져오지 않았다. 억제에 대한 가장 심각한 손상은 β₃N110D 및 γ2K328M에 대한 것이었으며, 둘 다 τ_비활성화 가 현저히 낮고 τ_상승이 높았습니다. 우리의 예비 분석은 또한 τ_상승 또는 g_GABAA 의 변화만으로는 억제를 손상시키기에 충분하지 않다는 것을 보여주었습니다(데이터는 표시되지 않음). τ_감소를 유의하게 감소시키는 돌연변이는 τ_상승 증가와 함께 GABAergic 억제를 더 현저하게 손상시킨다고 주장할 수 있습니다.

모든 흥분성 입력을 억제해야 하는 경우, 발화를 초래하는 모든 돌연변이는 비정상적이고 비특이적인 신경 반응을 생성하며, 이는 동일한 돌연변이를 가진 뉴런으로 구성된 신경 회로에서 과장될 가능성이 있습니다. 신경망에서 흥분/억제의 균형은 모든 네트워크 활동의 중요한 구성 요소인 손상된 억제 피드백에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다.

그림 1: 임상 및 연구 목적을 위한 변형 효과 예측 및 분석에 대한 개요로, 특히 인실리코(in silico ) 분석 및 신경 반응 시뮬레이션에 중점을 둡니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: γ2A303T의 위치 및 선택된 환자 돌연변이;γ2P302L 및 γ2K328L은 신경 시뮬레이션에 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 병원성으로 예측된 환자 돌연변이 γ2P302L과 인접 변이체 γ2L(A303T)의 비교 모델링. 두 모델 모두에서 녹색은 야생형을 나타내고 빨간색은 돌연변이 잔기를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 다중 염기서열 정렬 및 구조적 통찰력. 상단 패널은 TM2 가장자리에 있는 환자 돌연변이(P302L)(보라색)와 γ2 소단위의 TM2 시작 부분에 있는 병원성 변이체 A303T(빨간색)의 위치에 있는 잔류물의 진화적 보존을 보여줍니다. 하단 패널은 (A) 3차원 GABA_A 수용체 구조(7QNE)에서 이러한 보존된 잔류물의 시각화를 보여주며, 여기서 γ2 소단위체(7QNE의 사슬 C)는 노란색으로 표시되고 다른 각도(A, B)에서 표시됩니다. 약어: TM2 = 두 번째 막관통 도메인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 포함된 모든 변형의 현지화. (A) 공극 축으로부터의 정규화된 거리 및 (B) 막 중심으로부터의 거리에 대한 알려진(검은색) 및 예측된(빨간색) 변형의 위치가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 각 하위 단위에 대한 변형의 현지화. 공극 축으로부터의 (A, C, E) 정규화된 거리 및 막 중심으로부터의 (B, D, F) 거리에 대한 알려진(검은색) 및 예측된(빨간색) 변이체의 위치가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 변이 위치에 대한 AlphaMissense 점수 분포. (에이씨) 아미노산 위치, 공극 축으로부터의 (D-F) 정규화된 거리, 멤브레인 중심으로부터의 (G-I) 거리에 대한 AlphaMissense 점수 분포는 알려진 변이체(검은색) 및 예측된 변이체(빨간색)에 대해 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: α1(GABRA1) 소단위체, β3(GABRB3) 소단위 및 γ2(GABRG2) 소단위 체에 돌연변이가 있는 GABA_A 수용체의 정규화된 활성화 시간.(A) α1, (B) β3 및 (C) γ2 소단위체의 각 돌연변이에 대한 공극 축으로부터의 정규화된 거리에 대해 실험적으로 얻은 활성화 시간 상수가 표시됩니다. 값은 각각의 야생형 수용체 활성화 시간으로 정규화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: GABA _A 수용체의 α1(GABRA1) 소단위체, GABA _A 수용체의 β3(GABRB3) 소단위 및 γ2(GABRG2) 소단위 체 에 돌연변이가 있는 GABA_A 수용체의 정규화된 비활성화 시간.(A) α1, (B) β3 및 (C) γ2 소단위체의 각 돌연변이에 대한 공극 축으로부터의 정규화된 거리에 대해 실험적으로 얻은 비활성화 시간 상수가 표시됩니다. 값은 각각의 야생형 수용체 비활성화 시간으로 정규화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: CA1 피라미드 뉴런 모델. 모델 뉴런은 (1) 소마, (2) 근위부, 내측 및 원위 구획이 있는 정점 수상돌기로 구성되며 lamina molecularis에서 두 개의 분기로 끝나고, (3) 짧은 기저 수상돌기 줄기 뒤에 두 부분으로 분기되는 두 개의 대칭적으로 구성된 기저 수상돌기, (4) 원뿔형 축삭돌기 언덕으로 시작하여 원통형 축삭돌기 초기 세그먼트가 이어지는 축삭돌기, 수초화된 분절 및 Ranvier의 마디, 구형 축삭 말단으로 끝납니다. 녹색 삼각형은 글루타메이터 시냅스의 위치를 나타내고 빨간색 삼각형은 체세포에 위치한 GABAergic 시냅스를 나타냅니다. 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11: GluS1 활성만 있는 발사 패턴. 시냅스전 뉴런(GluS1(녹색 삼각형) 및 GABAergic(빨간색 원))과 야생형 또는 돌연변이 GABA_A 수용체(검은색 사각형)가 있는 시냅스후 뉴런에 대한 스파이크 트레인이 상단 패널에 제공됩니다. GABAergic 억제가 있거나 없는 야생형 GABA_A 수용체가 있는 뉴런과 GABAergic 억제가 있는 돌연변이 GABA_A 수용체가 있는 뉴런에 대한 개별 전압 트레이스가 하단 패널에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12: GluS1 및 GluS2 활성만 있는 발사 패턴. 시냅스전 뉴런(GluS1/2(녹색 삼각형) 및 GABAergic(빨간색 원))과 야생형 또는 돌연변이 GABA_A 수용체(검은색 사각형)가 있는 시냅스후 뉴런에 대한 스파이크 트레인이 상단 패널에 제공됩니다. GABAergic 억제가 있거나 없는 야생형 GABA_A 수용체가 있는 뉴런과 GABAergic 억제가 있는 돌연변이 GABA_A 수용체가 있는 뉴런에 대한 개별 전압 트레이스가 하단 패널에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 13: GluS1, GluS2 및 GluS3 활성만 있는 발사 패턴. 시냅스전 뉴런(GluS1/2/3(녹색 삼각형) 및 GABAergic(빨간색 원)과 야생형 또는 돌연변이 GABA_A 수용체(검은색 사각형)가 있는 시냅스후 뉴런에 대한 스파이크 트레인이 상단 패널에 제공됩니다. GABAergic 억제가 있거나 없는 야생형 GABA_A 수용체가 있는 뉴런과 GABAergic 억제가 있는 돌연변이 GABA_A 수용체가 있는 뉴런에 대한 개별 전압 트레이스가 하단 패널에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: AlphaMissense 점수 및 생물물리학적 매개변수의 분포(정규화된 비활성화 시간; 본 연구에서 선택된 GABA_A 수용체 소단위 돌연변이의 정규화된 τd). 또한 보충 파일 4: 보충 표 8을 참조하십시오. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: AlphaMissense 점수 및 생물물리학적 매개변수의 분포(정규화된 활성화 시간; 본 연구에서 선택된 GABA_A 수용체 소단위 돌연변이의 정규화된 τr). 또한 보충 파일 4: 보충 표 8을 참조하십시오. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S3: 야생형 및 돌연변이 GABA_A 수용체의 신경 반응에 대한 인터스파이크 간격. 맨 위 플롯은 단일 글루타메이트 입력에 대한 인터스파이크 시간 간격을 나타냅니다. 중간 플롯은 2개를 보여주고, 가장 아래쪽 플롯은 3개의 글루타메이터성 시냅스가 동시에 활성화됨을 보여줍니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 

보충 파일 1: "Data_GABAA. R"은 데이터 포맷을 위해 R에서 실행하는 데 필요합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 컨덕턴스 기반 모델 설계에 사용되는 방정식. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: 신경 시뮬레이션을 위해 Brian2에서 실행 GABAAvar.py 데 필요합니다. 이 파일에는 Brian2 기반 다구획 뉴런 모델(함수: CA1_Pyr), 컨덕턴스 기반 뉴런 및 시냅스 모델에 대한 방정식(함수: model_eqns, syn_eqns) 및 초기 매개변수(함수: biophys_param, morpho_param, syn_param)에 대한 Python 코드가 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 파일 4: 모든 보조 테이블을 포함하는 zip 폴더입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: ClinVar에서 .txt 파일로 다운로드한 후 "data.xlxs"로 저장된 GABRG2 유전자에서 유의성을 알 수 없는 미스센스 변이체. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S2: 연구에 사용된 염기서열의 식별자, 관심 유전자의 참조 전사체(NCBI Ref. seq.) 및 다른 데이터베이스에 걸친 기타 해당 식별자). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S3: 구조적 및 기능적 영역의 위치. 참조 전사체(NM_198904.4)에 의해 암호화된 γ2 소단위 단백질(NCBI 참조 서열: NP_944494.1)의 특정 영역 위치 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S4: "data1.xlxs" 파일의 내용으로, "GRCh38Chromosome", "GRCh38Location", "Name", "Protein change" 열만 포함하는 GABRG2 의 ClinVar 데이터를 나타냅니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S5: 변이 효과 예측을 위해 dbNSFP 서버에 업로드하기 위해 GABRG2 데이터의 미스센스 변형에 필요한 형식을 포함하는 "data1_output.xlsx" 파일의 내용입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S6: GABRG2의 알려지지 않은 미스센스 변형에 대한 변형 효과 예측을 위한 dbNSFP 서버의 출력을 포함하는 "data2.xlsx" 파일의 내용입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S7: GABA_A 수용체 소단위 변이체에 대한 AlphaMissense 점수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S8: 변이체의 생물물리학적 특성. 생물물리학적 매개변수에 대한 값은 전기생리학 실험을 통한 이전 연구에서 얻었습니다. 변이체는 "S"(치환) 유형으로 라벨링되는 반면, 야생형 수용체 매개변수는 각 치환에 대해 제공되고 "C"(대조군)로 라벨링됩니다. τ_d : 비활성화 시간 상수, P_Open : 개방 확률, g_GABA: 수용체 전도도, I_max: 최대 전류, τ_r : 활성화 시간 상수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S9: 변이체의 물리화학적 특성. 생물물리학적 매개변수가 있는 이전에 확인된 변이체는 "S"(치환) 유형으로 표시되는 반면, 예측된 변이체는 "P"로 표시됩니다. H: 소수성의 변화, VSC: 측쇄의 부피 변화, P1: 극성의 변화, P2: 편광의 변화, SASA: 용매에 접근할 수 있는 표면의 변화, NCISC: 순 전하 지수의 변화. 값은 Guo et ^al.36 에서 각 원래 아미노산 및 변이체에 대해 얻어지며 각 매개변수의 변화는 주어진 대로 추정됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S10 : 변형체의 구조적 특성. 생물물리학적 매개변수가 있는 이전에 확인된 변이체는 "S"(치환) 유형으로 표시되는 반면, 예측된 변이체는 "P"로 표시됩니다. 도메인에서 변이체의 국소화는 1로 표시되고, 그렇지 않으면 0으로 표시됩니다. 모든 값은 Brünger et ^al.35에서 얻은 것입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S11: 알려진 모든 변이체에 대한 구조적 및 생물물리학적 매개변수 상관관계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

 보충 표 S12: 알려진 GABRA1 변이체에 대한 구조적, 물리화학적, 생물물리학적 매개변수 상관관계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S13: 알려진 GABRB2 변이체에 대한 구조적, 물리화학적, 생물물리학적 매개변수 상관관계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S14: 알려진 GABRB3 변이체에 대한 구조적, 물리화학적 및 생물물리학적 매개변수 상관관계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S15: 알려진 GABRG2 변이체에 대한 구조적, 물리화학적, 생물물리학적 매개변수 상관관계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S16: 야생형 및 돌연변이 α1β3γ2 GABA_A 수용체에 대한 생물물리학적 매개변수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S17: 야생형 및 돌연변이 GABA_A 수용체를 갖는 단일, 이중 또는 삼중 글루타메이터 시냅스에 대한 반응으로 발사 속도 및 인터스파이크 간격.  이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

컴퓨터 유전학, 분자 모델링 및 신경 시뮬레이션의 조합을 적용함으로써 이 논문에서 제시된 접근 방식은 GABA_A 수용체 변이체의 분류를 개선할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 간질 연구와 임상 응용 모두에 귀중한 통찰력을 제공합니다. 예측된 병원성 돌연변이의 식별 및 우선순위 지정을 위한 포괄적인 분석이 제시되고 단백질에 대한 변이 효과와 세포 표현형 사이의 격차를 잠재적으로 해소하는 프레임워크로 확장됩니다. 해마 피라미드 뉴런 시뮬레이션에 대한 간질성 GABA_A 수용체 활성의 영향을 평가하면 GABA_A 수용체 기능 장애와 관련된 체외 표현형을 복제하고 네트워크 기능 장애의 근원에서 단일 뉴런 반응 변화를 입증할 수 있습니다. 간질 유발 돌연변이에 의해 생성된 신경 반응의 이러한 시뮬레이션을 기반으로 구조적으로 근접하게 예측된 돌연변이의 기능적 효과에 대한 대략적인 추정이 조사되었습니다. 예측된 돌연변이가 채널 동역학에 미치는 영향을 예측하려면 알려진 변이 세트에 대한 철저한 분석이 필요합니다. 이 논문에 제시된 것과 같은 비교 분석 및 신경 활동 시뮬레이션은 단백질 기능 및 신경 병리학에 대한 변이 효과에 초점을 맞춘 예측 모델의 추가 생성 및 개선을 위한 중요한 통찰력을 제공합니다. 또한, 당사의 방법론은 GABA_A 수용체 관련 신경 발달 장애와 관련된 변이 효과를 조사하기 위해 알려지지 않은 변이 중에서 가장 병원성 변이체를 선택하고 우선 순위를 지정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 형광 프로브 66,67,68,69,70으로 태그가 지정되고 예측된 돌연변이를 운반하는 수용체 소단위체는 체외에서 발현되어 이들의 이동, 세포 표면 발현 및 신경 생리학을 연구할 수 있습니다. 게다가, 예쁜꼬마선충(C. elegans)과 같은 동물 모델은 예측된 돌연변이의 효과를 검증하기 위해 고려될 수 있습니다. 예를 들어, CRISPR-Cas9 유전자 편집은 C. elegans GABA_A 수용체인 unc-49의 결실을 생성하는 데 사용되어 unc-49 또는 인간 GABA_A 수용체⁷¹의 하위 단위에서 동형접합 간질 관련 돌연변이를 생성합니다.

일반적으로 변형 분류는 ACMG-AMP¹²에서 권장하는 대로 여러 수준의 컴퓨팅 증거를 사용하는 이점을 얻습니다. 이 접근 방식은 다양한 예측 도구와 데이터 소스를 통합하여 변이 분류의 신뢰성을 강화하여 궁극적으로 임상 평가의 정확성을 높이고 게놈 진단의 전반적인 의사 결정 프로세스를 개선합니다. 우리의 방법론에서는 여러 도구의 예측을 결합하는 앙상블 예측자를 활용하여 여러 라인의 계산 증거에 대한 요구 사항을 충족하고 다른 도구를 별도로 사용할 필요성을 제거하는 것이 이점입니다. 또한 이 접근 방식은 개별 도구에서 서로 다른 출력을 처리하는 문제를 극복하여 예측 프로세스를 간소화하고 효율성을 향상시킵니다. 그럼에도 불구하고 유전자 중심 또는 변이 특이적 분석의 예측 정확도에 대해서는 보장되지 않습니다. 이는 유전자 중심 또는 변이 특이적 예측은 특정 상황과 목표에 맞게 조정된 특정 조건 하에서 수행되어야 한다는 결론으로 이어진다 ^15,72,73,74. 임상적 중재의 경우, 이를 위해서는 특정 질병의 맥락에서 특정 유전자 또는 유전자의 하위 집합에 대한 인실리코(in silico) 도구의 예측 정확도 평가가 필요하며, 종종 개별화된 최적화를 통해⁷⁵. 그러나 예측 정확도의 평가는 충분한 수의 변형이 없기 때문에 제한되는 경우가 많으며, 이는 정확도 평가의 신뢰성에 영향을 미칠 수 있습니다.

문헌에 있는 다양한 도구를 사용할 수 있으며, 그 정확성은 데이터 세트¹⁴에서 테스트되고 검증됩니다. 그러나 대규모 데이터 세트를 기반으로 한 이러한 정확도 결과가 주어진 유전자에 대한 몇 가지 알려지지 않은 변이의 예측에 반드시 반영되는 것은 아닙니다. 이러한 맥락에서, 축적된 문헌에 따르면 개별 예측 변수의 결과를 컴파일하고 계산하는 앙상블 예측 변수가 개별 예측 변수 ^33,76,77,78의 일치보다 더 나은 성능을 발휘하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 본 연구에서는 앙상블 예측 변수, 즉 BayesDEL³³ 및 ClinPred 32의 우수한 성능을 위해 특별히³²를 사용하기로 결정했습니다^{. 34} BayesDEL은 SCN5A(voltage-gated sodium channel alpha subunit 5)와 같은 막관통 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하여 임상적으로 관련된 유전자에서 4,094개의 미스센스 변이체에 대해 비교 평가되었으며 우수한 성능을 보여주었습니다³³. 변형 효과 예측 프로토콜에서 첫 번째 단계로 두 개의 앙상블 예측 변수(BayesDEL 및 ClinPred)의 합의를 고려했습니다. Google DeepMind에서 개발한 딥 러닝 모델인 AlphaMissense³⁷은 AlphaFold ^64,79의 확장이므로 고정밀 단백질 구조 예측 기능을 활용합니다. 앙상블 모델(프로토콜 단계 1.3에 설명된 BayesDEL 및 ClinPred)의 초기 예측 결과를 AlphaMissense의 결과와 비교했을 때, 예측은 부분적으로 서로 일치했으며(보충 파일 4: 보충 표 S15) 병원성 또는 질병 관련 합의에 도달한 앙상블 모델(BayesDEL 및 ClinPred)의 예측과 완전히 일치하지 않았습니다. 분홍색 행으로 도시되어 있다(보충 파일 4: 보충 표 S15). 그러나, 우리가 뉴런 모델에서 사용하고 ClinPred와 BayesDEL에 의해 병원성으로 예측된 GABRG2 돌연변이 R82Q, P302L 및 K328M 근처의 알려지지 않은 변이체(L81F, A303T 및 V329F)는 노란색 하이라이트에서 볼 수 있듯이 AlphaMissense에 의해 병원성으로 예측되었습니다(보충 파일 4: 보충 표 S15).

AlphaMissense²⁹는 염기서열 및 구조적 컨텍스트 예측을 사용하기 때문에 본 연구에서는 막 중심과 공극 축으로부터의 거리를 기반으로 AlphaMissense 점수와 GABA_A 수용체 돌연변이 위치 사이에 연관성이 있는지 확인하고 싶었습니다. 우리의 가설은 기능적으로 확인된 GABA_A 수용체 소단위체의 돌연변이에 인접하거나 근접한 아미노산 변이체의 기능적 영향이 돌연변이의 경우 관찰된 채널 기능에서 유사한 물리화학적 변화 패턴을 보일 수 있다는 아이디어에 기반을 두고 있습니다. GABA_A 수용체 서브유닛 돌연변이 위치와 AlphaMissense 점수 간의 상관관계는 GABA_A 수용체 서브유닛에서 새로운 미스센스 변이체의 기능적 결과를 예측할 수 있는 가설의 틀을 구축하기 위해 사용 가능한 관계를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 그러나 AlphaMissense 점수는 이러한 생물물리학적 매개변수의 변화를 예측하지 못했습니다(그림 7). 분석에서 제한된 표본 크기로 인해 명확한 결론을 도출하기 어렵다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 우리의 분석은 AlphaMissense 점수가 GABA_A 수용체 구조 매개변수와 상관관계가 없다는 것을 발견했습니다. 명확한 위치 상관 관계가 없다는 것(예: 돌연변이의 위치와 AlphaMissense 점수 사이)은 가정의 타당성에 도전합니다. 인접한 잔류물이 실제로 유사한 효과를 가지고 있다면 더 명확한 상관 관계를 볼 수 있을 것으로 기대할 수 있습니다. 그렇지 않기 때문에 AlphaMissense 점수를 가정을 테스트하기 위한 신뢰할 수 있는 도구로 사용하는 기능이 약해집니다.

흥미롭게도, 본 연구에서 GABRG2 유전자 돌연변이체에 대한 변이체에서 공극 축까지의 거리와 정규화된 채널 활성화 시간 사이에 가벼운 상관관계가 있음을 발견했습니다. 따라서, 인접한 아미노산이 유사한 결과를 가질 것이라는 우리의 예비 가정은 기공의 영역이나 게이팅과 관련된 주요 부위와 같은 채널의 일부 영역에서는 사실일 수 있지만 다른 영역에서는 명확하지 않을 수 있습니다. 데이터 세트가 작으면 이러한 변동성을 식별할 수 있는 능력이 제한되지만 향후 데이터 또는 더 자세한 구조 분석은 가설의 이러한 측면을 구체화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 분자 역학 시뮬레이션(molecular dynamics simulations⁸⁰ )은 특히 본 연구에서 수행된 두 개의 인접한 γ2 소단위 돌연변이, 즉 간질 유발 돌연변이 γ2P302L⁴⁰ 및 근위 예측 돌연변이 γ2A303T(rs1581439874)에 대한 비교 평가의 맥락에서 이러한 예비 결과를 추가로 조사하기 위한 강력한 보완적 접근 방식이 될 수 있습니다. 앞으로 이 접근 방식은 특히 우리 연구에서 제시된 신경 시뮬레이션과 통합될 때 세포 표현형에 대한 알려지지 않은 변이의 영향을 보다 정확하게 추정할 수 있게 할 수 있습니다.

또한 GABA_A 수용체 소단위의 구조적 및 물리화학적 특성을 다른 기능과 함께 사용하여 채널, 뉴런, 네트워크 및 질병 표현형에 대한 새로운 변이 효과의 기능적 예측을 위한 강력한 기계 학습 모델을 훈련할 수 있는지 여부를 탐구하는 것은 흥미로울 것입니다. 자동화된 머신러닝 접근법의 출현으로 우리는 의사와 습식 실험실 과학자들이 보다 민주화된 환경에서 자신의 모델을 개발할 수 있는 지점에 도달했다⁸¹. 따라서 이러한 기술을 임상 실습에 통합하면 잠재적으로 프로세스를 간소화하여 맞춤형 의약품에 대한 접근성을 높이고 기능적 변이 분석을 위한 고도로 전문화된 전문 지식에 대한 의존도를 줄일 수 있습니다. 이러한 맥락에서 우리의 접근 방식은 수용체의 구조적 및 기능적 역학에 대한 통찰력을 제공하여 변이 효과의 기능적 예측을 위한 향후 연구에 잠재적으로 도움이 될 수 있습니다.

현재 단백질 구조 예측의 진전과 AlphaFold⁶⁴로 대표되는 돌파구에도 불구하고 모델⁷⁹를 훈련하는 데 필요한 데이터가 부족하기 때문에 돌연변이 및 단백질 기능의 영향을 정확하게 예측하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 변이 효과의 예측을 위해 AlphaMissense는 예측 모델의 하위 집합에 비해 더 높은 성능을 보였지만 본 연구에 사용된 앙상블 예측 변수 BayesDEL²⁵ 및 ClinPred²⁴는 이 비교²⁹에 포함되지 않았습니다. 본 연구에서는 인실리코(in silico) 도구인 BayesDEL, ClinPred 및 AlphaMissense가 서로 다른 목적으로 사용되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 앙상블 예측 변수인 BayesDEL과 ClinPred는 주로 병원성 예측에 사용된 반면, AlphaMissense는 γ2 소단위체의 돌연변이의 영향에 대한 점수와 알려진 데이터 간의 관계를 탐색하는 데 특별히 사용되었습니다. 구체적으로 말하자면, 본 가설은 예측된 병원성 변이, 특히 GABA_A 수용체 소단위체에서 기능적으로 확인된 돌연변이 근처 또는 인접에 위치한 변이가 기능적으로 특성화된 돌연변이에서 관찰된 것과 유사한 생물물리학적 매개변수를 나타낼 것이라고 가정합니다. 이를 조사하기 위해 AlphaMissense를 선택한 이유는 기본 펩타이드 염기서열을 활용하여 단일 아미노산 치환의 결과를 예측하는 매우 정확한 AlphaFold2⁶⁴ 모델로 구동되기 때문입니다.

결과적으로, 본 연구의 주요 한계는 주로 실험 데이터의 제한된 가용성에 기인합니다. 예를 들어, 우리의 뉴런 모델은 GABA_A 수용체의 α1β3γ2 소단위 조합에서 파생된 데이터의 발현을 기반으로 하며, 이는 본질적으로 문헌에서 연구된 돌연변이를 이 특정 수용체 조합의 일부로 발현된 소단위체로 제한합니다. 또한, 우리는 HEK 세포에서 이러한 소단위체의 발현에서만 파생된 전기생리학적 데이터에 의존하여 문헌에서 사용 가능한 데이터의 범위를 더욱 좁혔습니다. 알려지지 않은 변이의 영향을 추정하기 위해 신경 모델링을 사용하는 것은 알려진 돌연변이에 근접한 알려지지 않은 변이체(워크플로에서 병원성으로 예측됨)가 문헌에 설명된 돌연변이 효과의 채널 동역학 매개변수 또는 물리화학적 특성에서 유사한 패턴을 나타낼 것이라고 가정합니다. 이러한 가정은 HEK293 세포의 특정 수용체 어셈블리에 대한 전기생리학적 데이터의 필요성과 결합되어 모델링에 사용할 수 있는 실험 데이터의 양을 줄입니다. 이러한 제약 조건으로 인해 사용 가능한 데이터를 통해 α1β3γ2 subunit에서 제한된 수의 변형만 모델링할 수 있었습니다. 그러나 소단위체별 세포, 회로 및 네트워크 수준의 영향을 미치는 α1β2γ2 소단위 조합, α1β2δ 또는 α4β3δ 소단위 조합과 같은 다양한 소단위 어셈블리에 대해 뉴런 모델을 훈련하면 다양한 간질 유형 및 신경 발달 장애에 대한 적용 가능성이 더 넓어질 수 있습니다. 미래에는 사용 가능한 전기생리학적 데이터와 잘 정의된 수용체 어셈블리 및 특정 세포 유형의 돌연변이에 초점을 맞춘 연구가 증가함에 따라 당사의 접근 방식의 일반화 가능성과 정확성을 향상시키는 것이 가능해질 수 있습니다.

다중 구획 전도도 기반 뉴런 모델은 단일 뉴런 반응의 수용체 변이체의 기능적 중요성에 대한 예측을 생성하는 강력한 도구를 제공합니다. 이 도구를 사용하면 셀룰러/시냅스 매개변수와 해당 위치를 유연하게 정의하여 특정 질문을 테스트할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 간단한 스파이크 발생기는 미세 회로 활동을 연구하기 위해 다른 뉴런 모델로 대체할 수 있습니다. 프로토콜의 중요한 단계는 또한 가장 제한적인 단계이며, 이는 변경된 채널 동역학(modified channel kinetics) 측면에서 모든 수용체 변이체를 정의하는 것입니다. 필요한 정보는 패치 클램프 전기 생리학 연구를 통해 이상적으로 제공됩니다. 그러나 임상적 유의성이 예측된 아미노산 치환에 대한 컴퓨터 분석 및 알려진 치환과의 비교도 몇 가지 통찰력을 제공할 수 있습니다. 우리의 연구와 설명된 프로토콜은 신경 활동 시뮬레이션을 예측 도구가 아니라 돌연변이의 영향을 탐색하는 도구로 사용하여 단일 뉴런 활동에 대한 GABA_A 수용체의 변경된 생물물리학적 특성의 결과에 대한 더 넓은 전망을 지원합니다. 신경 시뮬레이션에서 실험 데이터에 대한 의존성은 우리 접근 방식의 중요한 제한 사항이며, 이는 구조와 기능 사이의 격차를 해소하기 위해 고급 분자 모델링의 이점을 얻을 수 있습니다.

프로토콜에서 특정 단계를 비판적으로 평가해야 합니다. 첫째, 프로토콜의 첫 번째 부분에서 사용된 예측 모델의 선택이 중요할 수 있습니다. 인실리코(in silico) 도구의 선택은 강력한 예측을 위한 충분한 여러 라인의 계산 증거의 생성을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다¹². 여러 예측 알고리즘의 분석을 통합하는 앙상블 예측변수는 이 권장 사항에 더 적합하므로 개별 예측자에 비해 선호됩니다. 다양한 예측 변수가 있으며 그 정확도는 일반적으로 대규모 데이터 세트에서 테스트되며, 이는 특정 유전자에 위치한 알려지지 않은 변이 효과에 사용되는 예측 모델의 정확도를 반드시 보장하지는 않습니다. 이는 여러 예측 변수에서 예측 결과를 수집하고 계산하는 두 개의 앙상블 모델을 사용하여 보상됩니다. 또한, 목적이 주로 가장 병원성 변이체를 식별하는 것인 경우 특이성을 높이기 위해 예측 모델의 컷오프를 조정할 수 있습니다. 적절한 컷오프를 설정하는 것은 민감도와 특이성 간의 균형을 맞추고 변형을 정확하게 분류하는 데 중요합니다. 우리 연구에서는 기본 컷오프를 사용했습니다. 특히 병원성일 가능성이 더 높은 변이체를 캡처하기 위해 컷오프를 변경하지 않았는데, 이는 워크플로우에 설명된 대로 분석의 여러 수준에서 검사할 변이체의 범위를 줄일 수 있기 때문입니다. 또한 관심 단백질의 3차원 재구성을 위한 구조 데이터를 선택할 때 문헌의 구조 데이터에 대한 예비 검토가 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. GABA_A 수용체의 구조적 검사는 최근 서로 다른 조건에서 서로 다른 수용체 어셈블리의 3차원 구조를 보고하는 강력한 구조 연구로 추진력을 얻었습니다 26,27,82,83,84,85. 이러한 데이터의 가용성을 감안할 때, 본 연구에서는 구조 데이터의 재구성을 위해 실험적으로 결정된 구조에 초점을 맞췄습니다. 그러나 AlphaFold⁶⁴의 예측은 실험적으로 결정된 데이터가 없는 다른 단백질의 분석에 유리할 수 있습니다. 실험 연구에서 파생된 구조 데이터의 경우 아미노산 번호 매기기에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 아미노산의 PDB 번호는 단백질 성숙 중에 제거되는 신호 펩타이드를 포함하지 않을 수 있기 때문에 UniProt 번호 지정과 다를 수 있습니다. 게다가, 실험 시스템에서 발현된 키메라 단백질은 불일치를 유발할 수 있습니다. 이 경우, 구조 데이터에서 파생된 염기서열과 관심 염기서열을 쌍으로 정렬하면 일관성을 유지하는 데 도움이 됩니다. 문헌에서 γ2 소단위 단백질에 대한 구조 데이터는 전자 현미경(EM)과 같은 실험 방법과 AlphaFold의 고정밀 예측 방법을 포함한 다양한 방법을 기반으로 합니다. 실험 방법이 원하는 염기서열을 고해상도로 완전히 커버하지 못하는 경우 AlphaFold 예측을 사용할 수 있습니다. 본 연구에서는 7QNE²⁶ 구조가 인간 전장 시냅스 α1β3γ2 GABA_A 수용체의 극저온 전자 미시 구조에 해당하기 때문에 선택되었습니다. 이것은 본 연구의 초점이었던 전체 길이 소단위 조합을 정확히 나타냅니다.

또한 비교 분석을 위해 채널 동역학의 정규화된 매개변수를 사용하는 것이 선호되어야 하는데, 이러한 매개변수의 값은 수용체 소단위체 구성 및 실험 설정에 따라 달라질 수 있으므로 이러한 매개변수의 값이 달라질 수 있습니다. 예를 들어, τ_상승 및 τ_비활성화 는 야생형 제어 값에 대한 x-fold 변화에 대해 결정해야 합니다. 프로토콜 단계 2.5에서는 알려진 변이체 수가 적은 경우 모수 또는 범주형 상관 관계 분석과 rho 및 p 값 결정이 선호될 수 있습니다. 이상적으로는 주성분 분석과 같은 방법이 더 정확한 관계를 생성할 것으로 예상되지만 더 많은 수의 표본이 필요합니다.

시뮬레이션 환경은 변경될 수 있습니다. 이 연구에서 Brian2는 다음과 같은 이유로 선호되었습니다.Brian2의 spatialneuron 클래스는 신경 활동을 시뮬레이션하는 유용한 도구를 제공합니다. Brian2는 사전 정의된 "블랙박스" 모델에 의존하는 대신 미분 방정식을 사용하여 연속 동역학을 설명하고 이산 이벤트에 대한 명령문을 업데이트하는 데 상당한 이점이 있으며, 모델의 모든 측면이 단일 Python 스크립트에서 명시적으로 정의될 수 있고 모델 방정식은 수학적 표기법으로 명시되어 있으며 Brian 특정 어휘는 극히 일부만 사용되기 때문에 뛰어난 코드 가독성과 적응성을 제공합니다³⁷. 모델이 명시적으로 설명되기 때문에 모든 기능이 문서화되고 기본 시뮬레이션 설명 파일에서 찾을 수 있으므로 Stimberg et ^al.45,86의 연구에서 언급한 바와 같이 이전에 의존했던 "블랙박스" 모델의 필요성을 제거합니다.

현재 뉴런 모델은 Na⁺, K⁺ 및 누설 전류가 있는 수정된 Hodgkin-Huxley 유형 컨덕턴스⁴⁶을 사용합니다. 이 컨덕턴스 기반 모델은 Ca²⁺ 채널과 같은 몇 가지 다른 채널 유형을 포함하여 더욱 확장될 수 있습니다. 시냅스 모델의 경우, 이러한 매개변수는 특정 소단위 구성에 대해 얻어야 하며, 이러한 구성으로 측정된 매개변수가 있는 변형만 평가해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 연구에서는 α1β3γ2 수용체 조성을 선택했습니다. 따라서 α1β3γ2 GABA_A 수용체에서 측정된 채널 동역학 매개변수가 있는 α1, β3 또는 γ2의 변형체만 포함되었습니다.

세포 생물물리학의 추정에는 세포를 여러 개의 원통형 구획으로 분할하는 것이 포함되며, 각 구획은 잠재적으로 다양한 전도성 특성을 가질 수 있습니다. 뉴런의 수상돌기의 불규칙성에도 불구하고, 그들은 국부적으로 균질한 가닥으로 볼 수 있습니다. 이러한 모델은 세포의 복잡한 구조와 기능을 이해하는 데 도움이 됩니다. 모델 설계는 이러한 기능을 반영할 수 있는 실제 형태의 단순화된 버전에 중점을 둡니다.

변형된 아미노산의 위치와 물리화학적 특성은 채널 동역학에 대한 영향을 결정합니다. 예를 들어, 더 큰 측쇄를 가진 아미노산을 생성하는 아미노산 치환은 채널의 공극을 감싸고 있는 아미노산에서 이러한 변화가 발생하는 경우 채널의 전도도를 감소시킵니다. 교체는 채널의 열기/닫기에도 영향을 줄 수 있습니다. 이 모델의 단순화를 위해 GABA 결합 역학은 사용 가능한 수용체의 비율로만 감소됩니다. 그러나 리간드 결합 친화도를 변경하는 치환의 가능한 영향을 연구하기 위해 이러한 상호 작용을 포함하도록 보다 상세한 모델을 설계할 수 있습니다.

결론적으로, 본 연구는 전산 방법을 사용하여 GABA_A 수용체 소단위에서 병원성 변이를 예측하고 해마 피라미드 뉴런 모델에서 간질 관련 돌연변이 시뮬레이션을 기반으로 가능한 세포 표현형을 정성적으로 추정합니다. 우리가 아는 한, 이것은 DNA에서 단백질 기능 및 신경 행동에 이르기까지 여러 수준의 복잡성에 걸쳐 유전적 변이가 GABA_A 수용체 기능 장애에 어떻게 기여할 수 있는지 평가하기 위해 컴퓨터 유전학, 분자 모델링 및 신경 시뮬레이션의 결합된 응용 프로그램을 탐구하는 최초의 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간질에서 잠재적으로 해로운 변이체 및 관련 신경 병리학의 추정을 개선하기 위한 기초를 제공할 수 있습니다. 또한, 관련 신경 발달 및 네트워크 장애의 기본 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하는 다른 채널병증 연구에 활용될 수 있습니다. 이를 바탕으로 GABA_A 수용체의 구조적, 물리화학적 평가를 통합하여 변이체의 기능적 영향과 GABA_A 수용체의 채널 동역학에 대한 통합을 조사함으로써 향후 보다 정확한 분석을 개발할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brian2	Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, France; Imperial College London, United Kingdom	2.8.0.4	Stimberg et al., 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
dbNSFP server	Genos Bioinformatics LLC, USA	v3.0	Liu et al., 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
HOPE	Centre for Molecular and Biomolecular Informatics CMBI, Radboud University, Netherlands	1.1.1	Venselaar et al., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
Jalview	University of Dundee, UK	JV2	Waterhouse et al., 2009 (https://www.jalview.org/)
Jupyter Notebook	Project Jupyter, USA		https://jupyter.org/install
Phyton	Python Software Foundation, USA	3.13	https://www.python.org/downloads/
Protter	ETH Zurich, Switzerland	Version 1.0	Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R	The R Foundation for Statistical Computing, USA	R version 4.3.2	https://www.r-project.org/
RStudio	Posit software, PBC, USA	RStudio 2023.12.1+402 "Ocean Storm" Release	https://posit.co/downloads/