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要約

網膜には、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞など、複数の細胞タイプがグルコーストランスポーター(GUT)を発現し、グルコースの細胞への取り込みを可能にします。 ex vivo マウス神経網膜と蛍光グルコースアナログ6-NBDGを用いて、マウス網膜全体におけるグルコース取り込みを比較的迅速かつ安価に測定する方法について述べる。

要約

網膜は、ATPの形でエネルギーを生成するためにグルコースとその誘導体を必要とする複数の細胞タイプを持つ代謝性の高い組織です。内皮細胞、ニューロン、光受容体、グリア細胞などの網膜細胞は、グルコーストランスポーター(GLUT;GLUT1-4など)を発現して、エネルギー生産のためのグルコースの取り込みを可能にします。GLUT1は、網膜で最も豊富に発現するグルコーストランスポーターです。このプロトコルにより、研究者は蛍光グルコースアナログ6-(N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ)-6-デオキシグルコース(6-NBDG)を使用して、ex vivo条件で神経マウス網膜のグルコースの取り込みを測定できます。網膜解剖後、プレートリーダーを使用した蛍光エンドポイント測定により、総網膜6-NBDGレベルを簡単に決定できます。一貫性を保つために、結果を総タンパク質レベルに正規化することをお勧めします。6-NBDGはGLUT1に対して非常に特異的ですが、このアナログの取り込みはGLUT1阻害剤BAY-876の存在下で検出されます。そのため、このアッセイは、GLUT1によって部分的に媒介されるマウス神経網膜全体におけるグルコース取り込みをex vivoで測定するための比較的迅速で安価な方法を提供します。

概要

グルコースは神経網膜の必須代謝産物であり、神経網膜では、アデノシン三リン酸(ATP)1の形でエネルギーを生成するために、解糖系とミトコンドリア呼吸を高速度で促進するために使用されます。グルコースが好ましいエネルギー基質であるため、多くの網膜細胞は、血管系および周囲の組織2からのグルコースの取り込みを促進するためにグルコーストランスポーター(GUT)を発現する。GLUTは、哺乳類細胞へのグルコース輸送に関与する内因性膜糖タンパク質のファミリーで構成されています3。GLUTトランスポーター-1(GLUT1)は、網膜における主要なグルコーストランスポーターであり、網膜層4全体および血液網膜関門(BRB)5を構成する毛細血管内皮細胞によって発現されます。興味深いことに、アルツハイマー病を含む中枢神経系(CNS)の神経変性疾患では、ヒトの脳萎縮とニューロン機能障害に先立って、GLUT1タンパク質レベルとグルコース取り込みの低下が起こります6,7。高眼圧症のラットモデルでは、毛細血管でもGLUT1のレベルが低いことが観察されました8。網膜外側へのグルコースの輸送の減少は、ヒト網膜色素変性症の動物モデルにおける光受容体の喪失に関与しており、緑内障で観察されるような網膜神経変性にも役割を果たしている可能性があります。したがって、神経網膜におけるグルコース輸送の理解は、網膜神経変性におけるその役割を確立するために必要です。

ここでは、 ex vivo マウス神経網膜、すなわち網膜色素上皮および脈絡膜を除外した6-NBDG取り込みを測定するための、新しく安価で簡単な生化学的方法について述べる。2-NBDGなどの他の蛍光類似体と比較して、6-NBDGは、蛍光ニトロベンゾキシジアミノ基が炭素6のヒドロキシル基を置換するグルコース部分で構成されており、ヘキソキナーゼによるリン酸化とさらなる代謝分解を防ぎます9。6-NBDGはGLUT1に対して高い特異性を持ち、グルコース9の300倍高い結合親和性を有するが、我々はGLUT1阻害剤の存在下でこの類似体の取り込みを検出する10。そのため、このアッセイは、部分的にGLUT1が媒介するマウス網膜全体におけるex vivo でのグルコース取り込みを測定するための比較的迅速で安価な方法を提供します。

組織中のグルコース取り込みをリアルタイムで測定することは困難であり、多くの場合、放射性同位元素標識や高解像度イメージング法が必要です。ここでは、蛍光生化学的アッセイを用いて、 ex vivo 条件での複数の網膜サンプルにおける6-NBDGの取り込みを迅速に測定します。このプロトコルは、総網膜グルコース取り込みに関する情報を提供します。6-NBDG取り込みの網膜細胞特異的レベルに関する情報は提供していません。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、ヴァンダービルト大学医療センターの動物施設管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. アッセイの準備

注:調製は、アッセイを実行する直前のアッセイ当日に実施する必要があります。これは、プロトコルの時間に敏感な性質のために必要です。

  1. 実験に先立つ一般的な準備
    注意: 6-NBDGは光に敏感であるため、光から保護する必要があります。すべての6-NBDG溶液をアルミホイルで覆います。
    1. 50% DMSO/1x PBS中の5 mM 6-NBDGのストック溶液は、-20°Cで6ヶ月間安定です。ストック溶液を調製し、将来のアッセイのために500μLのアリコートを保存します。
    2. Neurobasal-A培地(グルコースなし)の50 mL円錐管を氷上に置きます。.
    3. ウォーターバスが37°Cに設定されていることを確認してください。
    4. 網膜あたり4×1.5 mL微量遠心チューブをラベル付けします:1)グルコース飢餓、2)6-NBDGインキュベーション、3)超音波処理、および4)Pierceアッセイ用のサンプル用の収集チューブ(つまり、網膜が合計4つある場合、16本の微量遠心チューブが必要になります)。チューブのセットアップの概要については、 図1 を参照してください。
    5. 氷上の50 mLコニカルチューブから200 μLの神経基礎A培地を標識済みの超音波処理チューブに加え、ステップ2.5.4のために氷上に置きます。
    6. プレートリーダーの電源を入れます。
    7. 蛍光エンドポイントアッセイ機能を使用して、励起483 nm、蛍光550 nm、カットオフ530 nm(6-NBDG用に事前に定義されたパラメータ)を使用して、プレートリーダーソフトウェアでプレート情報を設定します。
  2. 実験に先立つ試薬調製:6-NBDG
    1. ステップ 1.1.1 で調製した 5 mM ストックを希釈することにより、最終濃度 500 μM の neurobasal-A 培地中の 6-NBDG の作業溶液を調製します。
      注意: すべての6-NBDG溶液をアルミホイルで覆うことを忘れないでください。アッセイ全体に対して適切な容量の500 μM 6-NBDG作業溶液を作成します(網膜あたり200 μLの作業用6-NBDG溶液が必要で、エラー用の追加容量とステップ2.4で標準溶液の作成に必要な量を含めます)。
    2. 6-NBDGインキュベーションステップのステップ1.1.4で作成した標識済みチューブに、200 μLの6-NBDGワーキング溶液をピペットで移します。

2. 6-NBDG取り込みアッセイの実行

注: ステップバイステップの概要については、 図 2 を参照してください。

  1. 網膜組織解剖
    1. 吸入イソフルラン麻酔(2%イソフルラン中5%二酸化炭素/ 95%酸素)を使用してマウスを鎮静させます。
      注意: マウスが適切に麻酔されていることを確認するには、両後ろ足のフットパッドをつまんでください。適切に麻酔をかければ、けいれん運動(ペダル引きこもり反射)はありません。反射的な動きがある場合は、手順2.1.1に戻ります。
    2. 子宮頸部脱臼とそれに続く斬首によってマウスを安楽死させ、その後、目を迅速に摘出します。除核した目を、氷上に5〜10 mLの氷冷神経基礎A培地(グルコースなし)を入れたシャーレに入れます。.
      注:以下は、神経網膜解剖(網膜色素上皮と脈絡膜を除く)の基本的なガイドラインです。より詳細な指導およびガイダンスについては、以前に公開されたプロトコル11 を参照し、「マウス網膜解剖」のセクションに従ってください。
    3. ペトリ皿を氷上の解剖顕微鏡の下に置きます。
    4. 糸くずの出ないワイプを小さな正方形に折り、Neurobasal Aメディアで湿らせます。
    5. 広告に移しますamp 糸くずの出ないワイプ プラスチック製の転写ピペットを使用して、端を切り取ります。
      注意: 糸くずの出ないワイプは、解剖中に目が動かないように摩擦を増加させます。
    6. 26 Gの針を取り、角膜の側面を輪部前方に穴を開けます。.
    7. Vannasはさみを使用して、穿刺点から輪部に沿って切断し、角膜を取り除きます。
    8. 角膜を切除したら、一対の鉗子で輪部と視神経乳頭の中間にある強膜をつかみます。反対側の手で別の鉗子を使用して、レンズをつかみ、1回の素早い動きですばやく取り外します。
      注意: レンズをゆっくりと取り外すと、網膜がレンズに付着したままになり、解剖が困難になります。
    9. アイカップを氷の上の冷たい神経基礎Aを入れたペトリ皿に移します。
    10. 両手に鉗子を使用して、アイカップを取り、オラセラータでカップを慎重に保持します。
      1. 網膜カップを強膜から解放するには、網膜組織を固定しないように注意しながら、鉗子を使用して強膜を固定します。
      2. 網膜全体が輪部から解放されるまで、鉗子を強膜組織と全地球の網膜組織の間に慎重にスライドさせます。
    11. Vannasのはさみを使用して、リンバスの強膜に小さな切開を行います。
    12. 鉗子を使用して切開部の端をつかみ、強膜組織を視神経頭領域まで剥がします。利き手ではない手で鉗子を使用して強膜をつかみ、利き手で閉じた鉗子を使用して網膜を強膜からそっと離します。
    13. 視神経頭をハサミで切り取り、網膜を強膜と残っている視神経から完全に切り離します。
    14. トリミングされたトランスファーピペットを使用して、ステップ1.1.4からグルコース飢餓のために事前に準備された1.5mL微量遠心チューブに網膜を移します。これには、チューブあたり200μLの神経基礎A培地(グルコースなし)-1網膜が含まれています。.
  2. グルコース飢餓ステップ
    1. ステップ2.1.14のチューブを37°Cのウォーターバスに移し、37°Cで20分間インキュベートします。
  3. NBDGインキュベーション
    1. ステップ1.1.4の6-NBDGインキュベーション用の新しい標識済みチューブに各網膜を移し、ステップ1.2.2の神経基礎A培地に200μLの500μM 6-NBDGが含まれています。
      注:網膜は、損傷を最小限に抑えて網膜を移すために、先端を拡大するために切断された移し替えピペットを使用して移乗する必要があります。さらに、これは、損傷なしに網膜を移植する能力に自信がある場合、ピンセットで行うことができます。
    2. チューブを37°Cのウォーターバスに移し、37°Cで60分間インキュベートします。
  4. 6-NBDG標準試料の調製(濃度範囲0 μM-40 μM)
    注:60分間の6-NBDGインキュベーション期間(ステップ2.3.2)中に標準試料を調製します。標準試料は室温で調製できます。光から溶液を保護します。
    1. 1.5 mLの微量遠心チューブ#1-8を8つの標準試料にラベル付けします( 図3を参照)。
    2. 標準#1(40 μM 6-NBDG)の場合、ステップ1.2.1で作製した500 μM 6-NBDGストック溶液32 μLをピペットで使用します。
    3. 368 μLのニューロベースルA培地を微量遠心チューブに加え、ピペッティングで上下に完全に混合します。
    4. 標準品#2-8の場合、次のようにサンプルを連続希釈します。
      1. 200 μLのニューロベースルA培地をチューブ#2-8にピペットで移します。
      2. 標準チューブ#1から200μLを取り出し、チューブ#2にピペットで移し、ピペットで上下に動かして完全に混合します。
      3. 標準チューブ#2から200μLを取り出し、標準チューブ#3にピペットで移します。ピペットでピペッティングを上下させて完全に混合します。
      4. 標準チューブ#3から200μLを取り出し、チューブ#4にピペットで移し、ピペッティングで上下させて十分に混合します。
      5. 標準チューブ#4から200μLを取り出し、チューブ#5にピペットで移し、ピペッティングで上下に完全に混合します。
      6. 標準チューブ#5から200μLを取り出し、チューブ#6にピペットで移し、ピペッティングで上下に完全に混合します。
      7. 標準チューブ#6から200μLを取り出し、チューブ#7にピペットで移し、ピペッティングで上下に動かして完全に混合します。
      8. チューブ#8に追加の溶液は追加しません(つまり、ステップ2.4.4.1で追加した神経基礎A培地は200μLのみを含む必要があります)。
  5. サンプル収集のための洗浄、超音波処理、および遠心分離
    1. 60分間の6-NBDGインキュベーションが完了したら、37°Cのウォーターバスからすべてのチューブを取り外してください。
    2. 各網膜を500μLの氷冷した神経基礎A培地でできるだけ早く慎重に洗浄します。
      1. 洗浄するには、6-NBDG溶液をピペットで取り出し、網膜組織に触れたり邪魔したりしないように注意してください。
        注:ピンセットで網膜を6-NBDGインキュベーションチューブから500uLの神経基礎A培地を持つ新しいチューブに移すオプションもあります。その後、さらに3回の洗濯を行うだけで済みます。ピンセットで網膜を傷つけない能力に満足している場合は、これを行います。
      2. その後、溶液を適切な廃棄物容器に廃棄します。すぐに500μLの冷たい神経基礎-同じチューブに培地をピペットで入れて、除去した溶液を交換します。洗浄の合間に氷の上のチューブを交換します。
    3. さらに3回繰り返して、合計4回の洗濯を行います。
    4. トリミングされたエッジまたはピンセットを備えたトランスファーピペットを使用して、網膜を氷上の神経基礎A培地を含む超音波処理チューブに慎重に移します(ステップ1.1.4を参照)。
    5. 小さな解剖ハサミを使用して網膜を細かく刻みます。
      注:他のサンプルを交差汚染しないように、各網膜を刻む間にツールをエタノールで洗ってください。
    6. 各網膜を振幅10で5〜10秒間超音波処理し、すぐに氷の上に戻します。
      注:サンプル間の超音波処理プローブを100%エタノールとそれに続く超高純度H2Oで必ず洗浄してください。この時点で、遠心分離機を4°Cに予冷するか、可能な場合は4°Cのウォークイン冷蔵室で遠心分離機を利用します。
    7. 21130 x g未満の場合は、最大速度21130 x g oで4°Cで15分間遠心分離します。
      注:ステップ2.5.7の15分間の遠心分離中に、ステップ2.4で調製した標準品#1-8の100μLを黒色の透明な底部96ウェルプレートにピペットで移します。
  6. プレートリーダーでのサンプルの読み取り
    1. 15分間の遠心分離が終了したら、100 μLの上清を取り出し、96ウェルプレートにピペットで移します。
    2. プレートをプレートリーダーに挿入します。
      注:プレートには、各サンプルが100μL、各標準試料が100μL必要です。
    3. プレートリーダーソフトウェアで、ステップ1.1.7で選択したパラメーターで蛍光エンドポイントアッセイを選択します。
    4. アッセイを実行し、結果を保存します。
    5. 96ウェルプレートからサンプルをピペットで1.1.4の標識済みチューブにピペットで移し、Pierceアッセイを行います。
      注:この時点で、サンプルはすぐにタンパク質についてアッセイするか(下記参照)、または-80°Cで保存することができます。
  7. タンパク質の標準化のためのPierceアッセイ
    注:Pierceアッセイは、精度を高めるために、(標準試料とサンプルの両方)二重に実行する必要があります。
    1. Pierceアッセイの希釈済みタンパク質アッセイスタンダードを使用して、各10 μLを96ウェルの透明な底板に2回ずつピペットで移します。
    2. ステップ2.6.5から各サンプル10μLを2回分ずつ96ウェルプレートにピペットで移します。
    3. 150 μLのPierce試薬を、標準品またはサンプルを含むすべてのウェルに添加します。96ウェルプレートを覆い、プレートシェーカーで中速で1分間混合します。
    4. プレートを室温(RT)で5分間インキュベートします。
    5. プレートをプレートリーダーに挿入します。吸光度エンドポイントアッセイを選択し、波長を660nmに設定します。
    6. 標準物質とサンプルの吸光度を測定し、結果を保存します。標準曲線をプロットして、各サンプルの総マイクログラムタンパク質を計算します。
  8. レチナール6-NBDG取り込みの計算。
    注:網膜のサイズが不均一であるため、6-NBDGの結果は総タンパク質含有量に正規化する必要があります。
    1. ステップ 2.6 で取得した蛍光強度値を使用して、所定の標準試料からの蛍光測定値を使用して 6-NBDG 蛍光標準曲線をプロットし、各サンプルの 6-NBDG 濃度(μM)を定量します。
    2. サンプル結果を対応するタンパク質量に正規化して、[6-NBDG] μM/μgタンパク質を決定します。

結果

図4は、WTマウス網膜を6-NBDGと異なる期間インキュベートした代表的なグルコース蛍光測定値を示しています。30分間のインキュベーション後、6-NBDGのレベルは平均336±27.91AUでしたが、60分後、6-NBDGのレベルは平均616.3±8.38AUに増加しました。さらに30分間のインキュベーションにより、6-NBDG(506.4 ± 5.3 AU)のレベルが低下しました。60分では、結果の?...

ディスカッション

要約すると、記載されている方法により、基礎科学研究者は、 ex vivo マウス神経網膜における蛍光グルコース類似体である6-NBDGの取り込みを測定することができます。グルコースは神経網膜の必須代謝産物であり、その取り込みは、アデノシン三リン酸(ATP)1の形でエネルギーを生成するために必要な解糖系とミトコンドリア呼吸の高率をサポ...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この作業は、Lauren K. Warehamに授与された無制限の部門資金によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
# 5 forcepsKatenaK5-6550Used for retina dissection
1.5 mL microcentrifuge tubesThermo Fisher Scientific05-408-129
26 G x 5/8" needlesol-M112658Used to puncture cornea during dissection
5 mL tubesMTC bioc2540
50 mL tubesAvantor by VWR89039-656
6-NBDGInvitrogenN23106Fluorescent gucose analog
96 well plates black with clear bottomThermo Fisher Scientific265301
Anesthetic Charcoal Filter CannisterReFreshEZ-258Used in anesthesia set up
BAY-876Millipore SigmaSML1774For inhibition of GLUT1.
Centrifuge at 4 °CEppendorfEPP-5424
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)AirgasUN3156Used in anesthesia set up
curved forcepsRoboz surgical instrumentRS-5137Used for retina dissection
DDH2OElga LabWaterElga PureLab UltraUsed after ethanol to clean sonicator in between samples
Dissecting microscopeOlympusszX12Used for retina dissection
Ethanol 200 proofDecon laboratories2701To be used to clean sonicator in between samples
Foam floating tube rackThermo Fisher Scientific36-099-2328For tubes during incubation in water bath steps
General scissorsRoboz surgical instrumentRS-680Used for retina dissection
Isoflurane 250 mL bottlePiramal critical careNDC  6679401725Anesthesia
Isoflurane equipmentVetequip sold by VWR89012-492Used to anesthetize prior to euthanasia
Kim wipesVWR82003-820
Microplate readerMolecular devicesSpectraMax M2 microplate readerUsed to read sample
Neurobasal- A mediaGibco12349-015
Nose cone (low profile anesthesia mask)Kent ScientificSOMNO-0801Used to deliver ansethesia
Objective on dissecting microscopeOlympusDF plapo 1x pfUsed for retina dissection
Petri dishVWR25384-088Used during retina dissection
Pierce assay reagentThermo Fisher Scientific1861426
Pipette tips P20Olympus Plastics26-404
Pipette tips P200, P1000, P10 XLVWR76322-150, 76322-154, 76322-132
Pipetteman pipettes P200, P1000, P20, P10VWRF144055M, F144056M, F144058M, F144059M
SoftMax Pro software on computerMolecular devicesSoftMax Pro 7 softwareSoftware used to read sample
Sonic dismembratorThermo Fisher ScientificFB50110Sonicate sample (retina)
Transfer pipettesFisherbrand13-711-9AMUsed to transfer retina from one tube to another
Vannas spring scissorsKatenaK4-5000Used for retina dissection
Water bath set to 37 °CN/AN/AUsed for incubation

参考文献

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6 NBDG GLUT1 ex vivo GLUT1 BAY 876

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