Mesure de l’absorption de l’analogue du glucose, le 6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-6-désoxyglucose, dans la rétine neurale murine intacte

Résumé

Plusieurs types de cellules de la rétine, y compris les cellules endothéliales, les neurones et les cellules gliales, expriment des transporteurs de glucose (GLUT) pour permettre l’absorption du glucose dans les cellules. En utilisant la rétine neurale de souris ex vivo et l’analogue fluorescent du glucose 6-NBDG, nous décrivons une méthode relativement rapide et peu coûteuse pour mesurer l’absorption de glucose dans l’ensemble de la rétine de la souris.

Résumé

La rétine est un tissu hautement métabolique avec plusieurs types de cellules nécessitant du glucose et de ses dérivés pour produire de l’énergie sous forme d’ATP. Les cellules rétiniennes, y compris les cellules endothéliales, les neurones, les photorécepteurs et les cellules gliales, expriment des transporteurs de glucose (GLUT, par exemple, GLUT1-4) pour permettre l’absorption du glucose pour la production d’énergie. GLUT1 est le transporteur de glucose le plus abondamment exprimé dans la rétine. Ce protocole permet aux chercheurs de mesurer l’absorption du glucose dans la rétine neurale murine dans des conditions ex vivo à l’aide de l’analogue fluorescent du glucose 6-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-6-Deoxyglucose (6-NBDG). Après le curage ganglionnaire rétinien, les taux totaux de 6-NBDG rétiniens peuvent être facilement déterminés par mesure du point final de fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques. Pour plus de cohérence, nous recommandons de normaliser les résultats aux niveaux totaux de protéines. Bien que le 6-NBDG soit très spécifique de GLUT1, l’absorption de cet analogue est détectée en présence de l’inhibiteur de GLUT1, BAY-876. En tant que tel, ce test fournit une méthode relativement rapide et peu coûteuse pour mesurer l’absorption du glucose ex vivo dans la rétine neurale de souris entière, qui est partiellement médiée par GLUT1.

Introduction

Le glucose est un métabolite essentiel pour la rétine neurale, où il est utilisé pour alimenter des taux élevés de glycolyse et de respiration mitochondriale pour produire de l’énergie sous forme d’adénosine triphosphate (ATP)¹. Le glucose étant le substrat énergétique privilégié, de nombreuses cellules rétiniennes expriment des transporteurs de glucose (GLUT) pour faciliter l’absorption du glucose par le système vasculaire et les tissus environnants². Les GLUT comprennent une famille de glycoprotéines membranaires intrinsèques qui sont responsables du transport du glucose dans les cellules de mammifères³. Le transporteur GLUT-1 (GLUT1) est le principal transporteur de glucose dans la rétine, exprimé dans les couches rétiniennes⁴ et par les cellules endothéliales capillaires qui composent la barrière hémato-rétinienne (BRB)⁵. Il est intéressant de noter que dans les maladies neurodégénératives du système nerveux central (SNC), y compris la maladie d’Alzheimer, une réduction des niveaux de protéine GLUT1 et de l’absorption de glucose précède l’atrophie cérébrale et le dysfonctionnement neuronal chez l’homme ^6,7. Dans un modèle d’hypertension oculaire chez le rat, des niveaux plus faibles de GLUT1 ont également été observés dans les capillaires⁸. La réduction du transport du glucose dans la rétine externe est impliquée dans la perte de photorécepteurs dans les modèles animaux de rétinite pigmentaire humaine et peut également jouer un rôle dans la neurodégénérescence rétinienne, comme celle observée dans le glaucome. Par conséquent, une compréhension du transport du glucose dans la rétine neurale est nécessaire pour établir son rôle dans la neurodégénérescence rétinienne.

Ici, nous décrivons une méthode biochimique nouvelle, peu coûteuse et simple pour mesurer l’absorption de 6-NBDG dans la rétine neurale murine ex vivo , c’est-à-dire à l’exclusion de l’épithélium pigmenté rétinien et de la choroïde. Comparé à d’autres analogues fluorescents tels que le 2-NBDG, le 6-NBDG est composé d’un groupement glucose sur lequel un groupe nitrobenzoxydiazoamino fluorescent remplace le groupe hydroxyle au carbone 6, empêchant la phosphorylation par l’hexokinase et la dégradation métabolique⁹. Bien que le 6-NBDG ait une spécificité élevée pour GLUT1, avec une affinité de liaison 300 fois supérieure à celle du glucose⁹, nous détectons l’absorption de cet analogue en présence d’inhibiteurs de GLUT1¹⁰. En tant que tel, ce test fournit une méthode relativement rapide et peu coûteuse pour mesurer l’absorption de glucose ex vivo dans l’ensemble de la rétine de la souris, qui est partiellement médiée par GLUT1.

La mesure de l’absorption du glucose dans les tissus en temps réel est difficile, nécessitant souvent un marquage radio-isotopique ou des méthodes d’imagerie à haute résolution. Ici, nous utilisons un test biochimique fluorescent pour déterminer rapidement l’absorption du 6-NBDG dans plusieurs échantillons rétiniens dans des conditions ex vivo . Le protocole fournit des informations sur l’absorption totale de glucose rétinien ; il ne fournit pas d’information sur les niveaux spécifiques des cellules rétiniennes de l’absorption du 6-NBDG.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre médical de l’Université Vanderbilt.

1. Préparation du test

REMARQUE : La préparation doit être effectuée le jour de l’essai, immédiatement avant l’exécution de l’essai. Cela est nécessaire en raison de la nature sensible au temps du protocole.

1. Préparation générale en amont de l’expérience
   REMARQUE : Le 6-NBDG est sensible à la lumière et doit être protégé de la lumière. Recouvrez toutes les solutions 6-NBDG de papier d’aluminium.
   1. Une solution mère de 5 mM de 6-NBDG dans 50 % de DMSO/1x PBS est stable à -20 °C pendant 6 mois. Préparez une solution mère et conservez 500 μL d’aliquotes pour les tests futurs.
   2. Placez un tube conique de 50 mL de milieu Neurobasal-A (sans glucose) sur de la glace.
   3. Assurez-vous que le bain-marie est réglé à 37 °C.
   4. Étiquetez 4 × des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL par rétine : 1) privation de glucose, 2) incubation de 6-NBDG, 3) sonication et 4) tube de prélèvement d’échantillon pour le test Pierce (c.-à-d. si vous avez quatre rétines au total, vous aurez besoin de 16 tubes de microcentrifugation). Voir la figure 1 pour un résumé de la configuration du tube.
   5. Ajouter 200 μL de milieu neurobasal A du tube conique de 50 mL sur de la glace aux tubes de sonication pré-étiquetés et laisser reposer sur de la glace pour l’étape 2.5.4.
   6. Mettez le lecteur de plaques sous tension.
   7. Configurez les informations sur les plaques dans le logiciel de lecture de plaques à l’aide de la fonction de test de point final de fluorescence avec les paramètres suivants : excitation 483 nm, émission 550 nm et coupure 530 nm (paramètres prédéterminés pour le 6-NBDG).
2. Préparation du réactif avant l’expérience : 6-NBDG
   1. Produire une solution de travail de 6-NBDG dans un milieu neurobasal-A à une concentration finale de 500 μM en diluant la substance de 5 mM obtenue à l’étape 1.1.1.
      REMARQUE : N’oubliez pas de couvrir toutes les solutions 6-NBDG avec du papier d’aluminium. Prévoir un volume approprié de solution de travail de 6-NBDG de 500 μM pour l’ensemble du test (besoin de 200 μL de solution de travail de 6-NBDG par rétine ; inclure le volume supplémentaire pour l’erreur et les quantités nécessaires à la création de solutions standard à l’étape 2.4.).
   2. Pipeter 200 μL de solution de travail 6-NBDG dans les tubes pré-étiquetés fabriqués à l’étape 1.1.4 pour l’étape d’incubation 6-NBDG.

2. Exécution du test d’absorption du 6-NBDG

REMARQUE : reportez-vous à la Figure 2 pour une vue d’ensemble étape par étape.

1. Dissection tissulaire rétinienne
   1. Endormir la souris à l’aide d’un anesthésique à l’isoflurane inhalé (2 % d’isoflurane dans 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène).
      REMARQUE : Vérifiez que la souris est correctement anesthésiée en pinçant le coussinet du pied sur les deux pattes arrière. S’il est correctement anesthésié, il ne devrait pas y avoir de mouvement saccadé (réflexe de retrait de la pédale). S’il y a un mouvement réflexe, revenez à l’étape 2.1.1.
   2. Euthanasier la souris par luxation cervicale suivie d’une décapitation, puis énucléer rapidement les yeux. Placez les yeux énucléés dans une boîte de Pétri remplie de 5 à 10 ml de milieu neurobasal-A glacé (sans glucose) sur de la glace.
      REMARQUE : Vous trouverez ci-dessous des directives de base pour la dissection neurale de la rétine (à l’exclusion de l’épithélium pigmentaire rétinien et de la choroïde) ; Pour des instructions et des conseils plus approfondis, reportez-vous à un protocole¹¹ publié précédemment et suivez la section « Dissection rétinienne de souris ».
   3. Placez la boîte de Pétri sous un microscope de dissection sur de la glace.
   4. Pliez une lingette non pelucheuse en un petit carré et humidifiez-la avec un média Neurobasal A.
   5. Transférez un œil sur la lingette humide et non pelucheuse à l’aide d’une pipette de transfert en plastique avec l’extrémité coupée.
      REMARQUE : La lingette non pelucheuse offre une friction accrue pour empêcher l’œil de bouger pendant la dissection.
   6. Prenez une aiguille de 26 G et percez le côté de la cornée en avant du limbe.
   7. Utilisez des ciseaux Vannas pour couper le long du limbe à partir du point de ponction afin d’enlever la cornée.
   8. Une fois la cornée retirée, saisissez la sclérotique à mi-chemin entre le limbe et la tête du nerf optique avec une paire de pinces. À l’aide d’une autre paire de pinces dans la main opposée, saisissez la lentille et retirez-la rapidement d’un seul mouvement rapide.
      REMARQUE : Si le cristallin est retiré lentement, la rétine restera attachée au cristallin et deviendra difficile à disséquer.
   9. Transférez l’œilleton dans une boîte de Pétri avec du neurobasal A froid sur de la glace.
   10. À l’aide d’une pince à deux mains, prenez l’œilleton et tenez soigneusement la tasse au niveau de l’ora serrata.
       1. Pour libérer la cupule rétinienne de la sclère, clampez la sclérotique à l’aide d’une pince en prenant soin de ne pas clamper le tissu rétinien.
       2. Faites glisser la pince avec précaution entre le tissu scléral et le tissu rétinien sur l’ensemble du globe jusqu’à ce que toute la rétine soit libérée du limbe.
   11. À l’aide de ciseaux Vannas, faites une petite incision dans la sclérotique au niveau du limbe.
   12. Prenez une pince pour saisir les bords de l’incision et décollez le tissu scléral jusqu’à la région de la tête du nerf optique. Saisissez la sclérotique à l’aide d’une pince dans la main non dominante et guidez doucement la rétine loin de la sclère à l’aide d’une pince fermée dans la main dominante.
   13. Coupez la tête du nerf optique avec des ciseaux pour détacher complètement la rétine de la sclérotique et de tout nerf optique restant.
   14. Transférez la rétine à l’aide d’une pipette de transfert taillée dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL préparé à l’avance pour la privation de glucose à l’étape 1.1.4, qui contient 200 μL de rétine neurobasale-A (sans glucose)-1 par tube.
2. Étape de privation de glucose
   1. Transvasez les tubes de l’étape 2.1.14 dans un bain-marie à 37 °C et incubez à 37 °C pendant 20 min.
3. Incubation NBDG
   1. Transférez chaque rétine dans un nouveau tube prémarqué pour l’incubation du 6-NBDG à partir de l’étape 1.1.4, qui contient 200 μL de 500 μM de 6-NBDG dans le milieu neurobasal-A de l’étape 1.2.2.
      REMARQUE : La rétine doit être transférée à l’aide d’une pipette de transfert qui a été coupée pour agrandir l’extrémité afin de transférer la rétine avec un minimum de dommages. De plus, cela peut être fait avec une pince à épiler si l’on est sûr de sa capacité à transférer la rétine sans dommage.
   2. Transvaser les tubes à 37 °C et incuber à 37 °C pendant 60 min.
4. Préparation d’étalons de 6-NBDG (plage de concentration 0 μM-40 μM)
   REMARQUE : Préparez les étalons pendant la période d’incubation de 60 minutes au 6-NBDG (étape 2.3.2.). Les étalons peuvent être préparés à température ambiante. Protégez les solutions de la lumière.
   1. Étiquetez les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL #1-8 pour les 8 étalons (voir la figure 3).
   2. Pour l’étalon #1 (40 μM 6-NBDG), pipette 32 μL de 500 μM de solution mère 6-NBDG effectuée à l’étape 1.2.1.
   3. Ajoutez 368 μL de milieu neurobasal-A dans le tube de microcentrifugation et mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas.
   4. Pour les normes #2-8, diluer en série les échantillons comme suit :
      1. Pipeter 200 μL de milieu neurobasal-A dans les tubes #2-8.
      2. Prenez 200 μL du tube standard #1 et pipetez-le dans le tube #2, puis mélangez soigneusement avec la pipette en pipetant de haut en bas.
      3. Prélever 200 μL du tube standard #2 et pipeter dans le tube standard #3. Mélangez soigneusement avec la pipette en pipetant de haut en bas.
      4. Prenez 200 μL du tube standard #3 et pipetez-le dans le tube #4, puis mélangez soigneusement en le pipetant de haut en bas.
      5. Prenez 200 μL du tube standard #4 et pipetez-le dans le tube #5, puis mélangez soigneusement en le pipetant de haut en bas.
      6. Prenez 200 μL du tube standard #5 et pipetez-le dans le tube #6, puis mélangez-le soigneusement en le pipetant de haut en bas.
      7. Prenez 200 μL du tube standard #6 et pipetez-le dans le tube #7, puis mélangez-le soigneusement en le pipetant de haut en bas.
      8. N’ajoutez pas de solution supplémentaire au tube #8 (c’est-à-dire qu’il ne doit contenir que 200 μL de milieu neurobasal-A ajouté à l’étape 2.4.4.1.).
5. Lavage, sonication et centrifugation pour la collecte d’échantillons
   1. Retirer tous les tubes du bain-marie à 37 °C une fois l’incubation de 60 minutes au 6-NBDG terminée.
   2. Lavez chaque rétine avec 500 μL de milieu neurobasal-A glacé aussi rapidement et soigneusement que possible.
      1. Pour le lavage, prélever la solution de 6-NBDG à l’aide d’une pipette, en veillant à ne pas toucher ou déranger le tissu rétinien.
         REMARQUE : Il est également possible de transférer la rétine à l’aide d’une pince à épiler du tube d’incubation 6-NBDG à un tube frais contenant 500 μL de média neurobasal-A. Ensuite, vous n’avez plus qu’à faire 3 lavages supplémentaires. Faites-le si vous êtes à l’aise avec votre capacité à ne pas endommager la rétine avec une pince à épiler.
      2. Ensuite, jetez la solution dans une poubelle appropriée. Pipeter immédiatement 500 μL de milieu neurobasal-A froid dans le même tube pour remplacer la solution qui a été retirée. Replacez les tubes sur de la glace entre les lavages.
   3. Répétez l’opération 3 fois de plus pour un total de 4 lavages.
   4. À l’aide d’une pipette de transfert à bord taillé ou d’une pince à épiler, transférez soigneusement la rétine dans les tubes de sonication contenant du milieu neurobasal A sur de la glace (voir étape 1.1.4).
   5. Coupez la rétine en petits morceaux à l’aide de petits ciseaux de dissection.
      REMARQUE : Assurez-vous de laver les outils à l’éthanol entre chaque rétine afin de ne pas contaminer d’autres échantillons.
   6. Sonicez chaque rétine pendant 5 à 10 secondes sur une amplitude de 10 et remettez-la immédiatement sur de la glace.
      REMARQUE : Assurez-vous de nettoyer la sonication entre les échantillons avec de l’éthanol à 100 % suivi de H₂O ultra-pur. À ce stade, pré-refroidissez la centrifugeuse à 4 °C ou utilisez-la dans une chambre froide à 4 °C si disponible.
   7. Centrifugeuse à 4 °C pendant 15 min à 21130 x g ouvitesse maximale si inférieure à 21130 x g.
      REMARQUE : Au cours de la centrifugeuse de 15 minutes à l’étape 2.5.7, pipeter 100 μL des étalons #1 à 8 effectués à l’étape 2.4 dans une plaque noire à fond transparent à 96 puits.
6. Lecture d’échantillons sur un lecteur de plaques
   1. Une fois la centrifugeuse de 15 minutes terminée, prélever 100 μL de surnageant et pipeter dans la plaque à 96 puits.
   2. Insérez la plaque dans le lecteur de plaques.
      REMARQUE : La plaque doit contenir 100 μL de chaque échantillon et 100 μL de chaque étalon.
   3. Dans le logiciel du lecteur de plaques, sélectionnez le test de fluorescence avec les paramètres sélectionnés à l’étape 1.1.7.
   4. Exécutez le test et enregistrez les résultats.
   5. Pipetez les échantillons de la plaque de 96 puits dans les tubes pré-étiquetés de la version 1.1.4 pour le test Pierce.
      REMARQUE : À ce stade, les échantillons peuvent être immédiatement analysés pour les protéines (voir ci-dessous) ou stockés à -80 °C.
7. Dosage par perçage pour la normalisation des protéines
   REMARQUE : Le test Pierce doit être effectué en double (à la fois sur les étalons et les échantillons) pour une précision accrue.
   1. À l’aide des étalons de dosage des protéines pré-diluées du test Pierce, pipeter 10 μL de chaque en double dans une plaque inférieure transparente à 96 puits.
   2. Pipeter 10 μL de chacun des échantillons en double de l’étape 2.6.5 dans la plaque à 96 puits.
   3. Ajouter 150 μL de réactif Pierce dans tous les puits contenant des étalons ou des échantillons. Couvrir la plaque à 96 puits et mélanger sur un agitateur à vitesse moyenne pendant 1 min.
   4. Incuber la plaque à température ambiante (RT) pendant 5 min.
   5. Insérez la plaque dans le lecteur de plaques. Sélectionnez le test du point final d’absorbance et réglez la longueur d’onde sur 660 nm.
   6. Mesurez l’absorbance des étalons et des échantillons et enregistrez les résultats. Calculez le microgramme total de protéines dans chaque échantillon en traçant une courbe standard.
8. Calcul de l’absorption rétinienne de 6-NBDG.
   REMARQUE : Les résultats du 6-NBDG doivent être normalisés en fonction de la teneur totale en protéines en raison de la taille inégale de la rétine.
   1. À l’aide des valeurs d’intensité de fluorescence obtenues à l’étape 2.6, utilisez les lectures de fluorescence des étalons prédéterminés pour tracer une courbe d’étalon de fluorescence 6-NBDG et quantifier la concentration de 6-NBDG (μM) dans chaque échantillon.
   2. Normaliser les résultats de l’échantillon en fonction des quantités de protéines correspondantes pour déterminer la protéine [6-NBDG] μM/μg.

Résultats

La figure 4 montre des mesures représentatives de la fluorescence du glucose à partir de la rétine de souris WT incubées avec du 6-NBDG pendant différentes périodes de temps. Après 30 minutes d’incubation, les concentrations de 6-NBDG étaient en moyenne de 336 ± 27,91 UA, tandis qu’après 60 min, les concentrations de 6-NBDG ont augmenté à une moyenne de 616,3 ± 8,38 UA. Une autre incubation de 30 minutes a permis d’obtenir une réduction d...

Discussion

En résumé, la méthode décrite permet aux chercheurs en sciences fondamentales de mesurer l’absorption de l’analogue fluorescent du glucose, le 6-NBDG, in vivo de la rétine neurale murine. Le glucose est un métabolite essentiel pour la rétine neurale, son absorption soutient les taux élevés de glycolyse et de respiration mitochondriale nécessaires pour produire de l’énergie sous forme d’adénosine triphosphate (ATP)¹. Le glucose étant l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
# 5 forceps	Katena	K5-6550	Used for retina dissection
1.5 mL microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
26 G x 5/8" needle	sol-M	112658	Used to puncture cornea during dissection
5 mL tubes	MTC bio	c2540
50 mL tubes	Avantor by VWR	89039-656
6-NBDG	Invitrogen	N23106	Fluorescent gucose analog
96 well plates black with clear bottom	Thermo Fisher Scientific	265301
Anesthetic Charcoal Filter Cannister	ReFresh	EZ-258	Used in anesthesia set up
BAY-876	Millipore Sigma	SML1774	For inhibition of GLUT1.
Centrifuge at 4 °C	Eppendorf	EPP-5424
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)	Airgas	UN3156	Used in anesthesia set up
curved forceps	Roboz surgical instrument	RS-5137	Used for retina dissection
DDH2O	Elga LabWater	Elga PureLab Ultra	Used after ethanol to clean sonicator in between samples
Dissecting microscope	Olympus	szX12	Used for retina dissection
Ethanol 200 proof	Decon laboratories	2701	To be used to clean sonicator in between samples
Foam floating tube rack	Thermo Fisher Scientific	36-099-2328	For tubes during incubation in water bath steps
General scissors	Roboz surgical instrument	RS-680	Used for retina dissection
Isoflurane 250 mL bottle	Piramal critical care	NDC  6679401725	Anesthesia
Isoflurane equipment	Vetequip sold by VWR	89012-492	Used to anesthetize prior to euthanasia
Kim wipes	VWR	82003-820
Microplate reader	Molecular devices	SpectraMax M2 microplate reader	Used to read sample
Neurobasal- A media	Gibco	12349-015
Nose cone (low profile anesthesia mask)	Kent Scientific	SOMNO-0801	Used to deliver ansethesia
Objective on dissecting microscope	Olympus	DF plapo 1x pf	Used for retina dissection
Petri dish	VWR	25384-088	Used during retina dissection
Pierce assay reagent	Thermo Fisher Scientific	1861426
Pipette tips P20	Olympus Plastics	26-404
Pipette tips P200, P1000, P10 XL	VWR	76322-150, 76322-154, 76322-132
Pipetteman pipettes P200, P1000, P20, P10	VWR	F144055M, F144056M, F144058M, F144059M
SoftMax Pro software on computer	Molecular devices	SoftMax Pro 7 software	Software used to read sample
Sonic dismembrator	Thermo Fisher Scientific	FB50110	Sonicate sample (retina)
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM	Used to transfer retina from one tube to another
Vannas spring scissors	Katena	K4-5000	Used for retina dissection
Water bath set to 37 °C	N/A	N/A	Used for incubation