Medindo a captação do análogo da glicose, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-6-desoxiglicose, na retina neural murina intacta

Resumo

Vários tipos de células na retina, incluindo células endoteliais, neurônios e células gliais, expressam transportadores de glicose (GLUTs) para permitir a captação de glicose nas células. Usando a retina neural de camundongo ex vivo e o análogo fluorescente de glicose 6-NBDG, descrevemos um método relativamente rápido e barato para medir a captação de glicose em toda a retina do camundongo.

Resumo

A retina é um tecido altamente metabólico com vários tipos de células que requerem glicose e seus derivados para produzir energia na forma de ATP. As células da retina, incluindo células endoteliais, neurônios, fotorreceptores e células gliais, expressam transportadores de glicose (GLUTs; por exemplo, GLUT1-4) para permitir a captação de glicose para a produção de energia. O GLUT1 é o transportador de glicose mais abundantemente expresso na retina. Este protocolo permite que os pesquisadores meçam a captação de glicose na retina murina neural em condições ex vivo usando o análogo fluorescente da glicose 6-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-6-Desoxiglicose (6-NBDG). Após a dissecção da retina, os níveis totais de 6-NBDG da retina podem ser facilmente determinados por meio da medição do ponto final de fluorescência usando um leitor de placas. Para consistência, recomendamos normalizar os resultados para os níveis totais de proteína. Embora o 6-NBDG seja altamente específico para o GLUT1, a captação desse análogo é detectada na presença do inibidor de GLUT1 BAY-876. Como tal, este ensaio fornece um método relativamente rápido e barato para medir a captação de glicose ex vivo em toda a retina neural de camundongos, que é parcialmente mediada por GLUT1.

Introdução

A glicose é um metabólito essencial para a retina neural, onde é usada para alimentar altas taxas de glicólise e respiração mitocondrial para produzir energia na forma de trifosfato de adenosina (ATP)¹. Como a glicose é o substrato energético preferido, muitas células da retina expressam transportadores de glicose (GLUTs) para facilitar a captação de glicose da vasculatura e do tecido circundante². Os GLUTs compreendem uma família de glicoproteínas de membrana intrínsecas que são responsáveis pelo transporte de glicose para as células de mamíferos³. O transportador GLUT-1 (GLUT1) é o transportador primário de glicose na retina, expresso em todas as camadas retinianas⁴ e pelas células endoteliais capilares que compõem a barreira hemato-retiniana (BRB) ⁵. Curiosamente, em doenças neurodegenerativas do sistema nervoso central (SNC), incluindo a doença de Alzheimer, uma redução nos níveis de proteína GLUT1 e captação de glicose precede a atrofia cerebral e a disfunção neuronal em humanos ^6,7. Em um modelo de hipertensão ocular em ratos, níveis mais baixos de GLUT1 também foram observados nos capilares⁸. O transporte reduzido de glicose para a retina externa está implicado na perda de fotorreceptores em modelos animais de retinite pigmentosa humana e também pode desempenhar um papel na neurodegeneração da retina, como a observada no glaucoma. Portanto, é necessária uma compreensão do transporte de glicose na retina neural para estabelecer seu papel na neurodegeneração da retina.

Aqui, descrevemos um método bioquímico novo, barato e direto para medir a captação de 6-NBDG na retina neural murina ex vivo , ou seja, excluindo o epitélio pigmentado da retina e a coroide. Comparado com outros análogos fluorescentes, como o 2-NBDG, o 6-NBDG é composto por uma porção de glicose na qual um grupo nitrobenzoxididiazoamino fluorescente substitui o grupo hidroxila no carbono 6, impedindo a fosforilação pela hexoquinase e posterior degradação metabólica⁹. Embora o 6-NBDG tenha alta especificidade para o GLUT1, com uma afinidade de ligação 300 vezes maior que a glicose⁹, detectamos captação desse análogo na presença de inibidores do GLUT1¹⁰. Como tal, este ensaio fornece um método relativamente rápido e barato para medir a captação de glicose ex vivo em toda a retina do camundongo, que é parcialmente mediada por GLUT1.

A medição da captação de glicose no tecido em tempo real é desafiadora, muitas vezes exigindo marcação de radioisótopos ou métodos de imagem de alta resolução. Aqui, empregamos um ensaio bioquímico fluorescente para determinar rapidamente a captação de 6-NBDG em várias amostras de retina em condições ex vivo . O protocolo fornece informações sobre a captação total de glicose na retina; não fornece informações sobre os níveis específicos de captação de 6-NBDG nas células da retina.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Vanderbilt University Medical Center.

1. Preparação para o ensaio

NOTA: A preparação deve ser realizada no dia do ensaio imediatamente antes da execução do ensaio. Isso é necessário devido à natureza sensível ao tempo do protocolo.

1. Preparação geral antes do experimento
   NOTA: 6-NBDG é sensível à luz e deve ser protegido da luz. Cubra todas as soluções de 6-NBDG com papel alumínio.
   1. Uma solução estoque de 5 mM 6-NBDG em 50% de DMSO / 1x PBS é estável a -20 ° C por 6 meses. Faça uma solução de estoque e armazene alíquotas de 500 μL para ensaios futuros.
   2. Coloque um tubo cônico de 50 mL de meio Neurobasal-A (sem glicose) no gelo.
   3. Certifique-se de que o banho-maria está regulado para 37 °C.
   4. Rotule 4 × tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por retina: 1) falta de glicose, 2) incubação de 6-NBDG, 3) sonicação e 4) tubo de coleta para amostra para ensaio de Pierce (ou seja, se você tiver quatro retinas no total, precisará de 16 tubos de microcentrífuga). Consulte a Figura 1 para obter um resumo da configuração do tubo.
   5. Adicione 200 μL de meio A neurobasal do tubo cônico de 50 mL no gelo aos tubos de sonicação pré-rotulados e coloque no gelo para a etapa 2.5.4.
   6. Ligue o leitor de placas.
   7. Configure as informações da placa no software do leitor de placas usando o recurso de ensaio de ponto final de fluorescência com os seguintes parâmetros: excitação 483 nm, emissão 550 nm e corte 530 nm (parâmetros predeterminados para 6-NBDG).
2. Preparação do reagente antes do experimento: 6-NBDG
   1. Fazer uma solução de trabalho de 6-NBDG em meio neurobasal-A a uma concentração final de 500 μM, diluindo o stock de 5 mM produzido no passo 1.1.1.
      NOTA: Lembre-se de cobrir todas as soluções 6-NBDG com papel alumínio. Faça um volume apropriado de 500 μM de solução de trabalho 6-NBDG para todo o ensaio (precisa de 200 μL de solução de trabalho 6-NBDG por retina; inclua volume extra para erro e quantidades necessárias para criar soluções padrão na etapa 2.4.).
   2. Pipetar 200 μL de solução de trabalho 6-NBDG nos tubos pré-rotulados feitos na etapa 1.1.4 para a etapa de incubação 6-NBDG.

2. Executando o ensaio de captação de 6-NBDG

NOTA: Consulte a Figura 2 para obter uma visão geral passo a passo.

1. Dissecção do tecido retiniano
   1. Sedar o camundongo usando anestesia inalatória com isoflurano (isoflurano a 2% em 5% de dióxido de carbono/95% de oxigênio).
      NOTA: Confirme se o mouse está adequadamente anestesiado apertando a almofada do pé em ambas as patas traseiras. Se devidamente anestesiado, não deve haver movimento brusco (reflexo de retirada do pedal). Se houver um movimento reflexo, retorne ao passo 2.1.1.
   2. Eutanasiar o camundongo por luxação cervical seguida de decapitação e, em seguida, enuclear rapidamente os olhos. Coloque os olhos enucleados em uma placa de Petri cheia de 5-10 mL de meio neurobasal-A gelado (sem glicose) no gelo.
      NOTA: Abaixo estão as diretrizes básicas para dissecção neural da retina (excluindo epitélio pigmentar da retina e coróide); Para obter instruções e orientações mais detalhadas, consulte um protocolo^{publicado anteriormente 11} e siga a seção "Dissecção da retina do camundongo".
   3. Coloque a placa de Petri sob um microscópio de dissecção no gelo.
   4. Dobre um lenço sem fiapos em um pequeno quadrado e umedeça-o com a mídia Neurobasal A.
   5. Transfira um olho para o pano úmido e sem fiapos usando uma pipeta de transferência de plástico com a extremidade aparada.
      NOTA: O pano sem fiapos fornece maior atrito para evitar que o olho se mova durante a dissecção.
   6. Pegue uma agulha de 26 G e perfure o lado da córnea anterior ao limbo.
   7. Use uma tesoura Vannas para cortar ao longo do limbo a partir do ponto de punção para remover a córnea.
   8. Uma vez removida a córnea, segure a esclera a meio caminho entre o limbo e a cabeça do nervo óptico com um par de pinças. Usando outro par de pinças na mão oposta, segure a lente e remova-a rapidamente em um movimento rápido.
      NOTA: Se a lente for removida lentamente, a retina permanecerá presa à lente e se tornará difícil de dissecar.
   9. Transfira a ocular para uma placa de Petri com Neurobasal A frio no gelo.
   10. Usando uma pinça com as duas mãos, pegue a ocular e segure cuidadosamente a taça na ora serrata.
       1. Para liberar o copo da retina da esclera, aperte a esclera usando uma pinça, tomando cuidado para não prender o tecido da retina.
       2. Deslize a pinça cuidadosamente entre o tecido escleral e o tecido da retina ao redor de todo o globo até que toda a retina seja liberada do limbo.
   11. Usando uma tesoura Vannas, faça uma pequena incisão na esclera no limbo.
   12. Pegue uma pinça para agarrar as bordas da incisão e descasque o tecido escleral até a região da cabeça do nervo óptico. Segure a esclera usando uma pinça na mão não dominante e guie suavemente a retina para longe da esclera usando uma pinça fechada na mão dominante.
   13. Corte a cabeça do nervo óptico com uma tesoura para separar completamente a retina da esclera e de qualquer nervo óptico que reste.
   14. Transfira a retina usando uma pipeta de transferência aparada para o tubo de microcentrífuga pré-preparado de 1,5 mL para falta de glicose da etapa 1.1.4, que contém 200 μL de meio neurobasal-A (sem glicose)-1 retina por tubo.
2. Etapa de falta de glicose
   1. Transferir os tubos do passo 2.1.14 para um banho-maria a 37 °C e incubar a 37 °C durante 20 min.
3. Incubação NBDG
   1. Transfira cada retina para um novo tubo pré-marcado para incubação de 6-NBDG a partir da etapa 1.1.4, que contém 200 μL de 500 μM de 6-NBDG em meio neurobasal-A da etapa 1.2.2.
      NOTA: A retina deve ser transferida usando uma pipeta de transferência que foi cortada para aumentar a ponta de modo a transferir a retina com o mínimo de dano. Além disso, isso pode ser feito com pinças se estiver confiante na capacidade de transferir retina sem danos.
   2. Transferir os tubos para banho-maria a 37 °C e incubar a 37 °C durante 60 min.
4. Preparação de padrões 6-NBDG (faixa de concentração 0 μM-40 μM)
   NOTA: Prepare os padrões durante o período de incubação de 60 minutos 6-NBDG (etapa 2.3.2.). Os padrões podem ser preparados à temperatura ambiente. Proteja as soluções da luz.
   1. Rotule os tubos de microcentrífuga de 1.5 mL #1-8 para os 8 padrões (consulte a Figura 3).
   2. Para o padrão #1 (40 μM 6-NBDG), pipetar 32 μL de solução-mãe 6-NBDG 500 μM feita na etapa 1.2.1.
   3. Adicione 368 μL de meio neurobasal-A no tubo de microcentrífuga e misture bem pipetando para cima e para baixo.
   4. Para os padrões #2-8, diluir as amostras em série da seguinte forma:
      1. Pipete 200 μL de meio neurobasal-A nos tubos #2-8.
      2. Pegue 200 μL do tubo padrão # 1 e pipete-o no tubo # 2, depois misture bem com a pipeta pipetando para cima e para baixo.
      3. Pegue 200 μL do tubo padrão # 2 e pipete para o tubo padrão # 3. Misture bem com a pipeta pipetando para cima e para baixo.
      4. Pegue 200 μL do tubo padrão # 3 e pipete-o para o tubo # 4, depois misture bem pipetando-o para cima e para baixo.
      5. Pegue 200 μL do tubo padrão # 4 e pipete-o para o tubo # 5, depois misture bem pipetando-o para cima e para baixo.
      6. Pegue 200 μL do tubo padrão # 5 e pipete-o para o tubo # 6, depois misture bem pipetando-o para cima e para baixo.
      7. Pegue 200 μL do tubo padrão # 6 e pipete-o para o tubo # 7, depois misture bem pipetando-o para cima e para baixo.
      8. Não adicione nenhuma solução adicional ao tubo # 8 (ou seja, ele deve conter apenas 200 μL de meio neurobasal-A adicionado na etapa 2.4.4.1.).
5. Lavagem, sonicação e centrifugação para coleta de amostras
   1. Remova todos os tubos do banho-maria a 37 °C assim que a incubação de 60 minutos com 6-NBDG estiver concluída.
   2. Lave cada retina com 500 μL de meio neurobasal-A gelado o mais rápido e cuidadosamente possível.
      1. Para lavar, remova a solução de 6-NBDG com uma pipeta, certificando-se de não tocar ou perturbar o tecido retiniano.
         NOTA: Há também a opção de transferir a retina com uma pinça do tubo de incubação 6-NBDG para um tubo novo que tenha 500 uL de meio neurobasal-A. Então, você só precisa fazer 3 lavagens adicionais. Faça isso se estiver confortável com sua capacidade de não danificar a retina com uma pinça.
      2. Em seguida, descarte a solução em um recipiente de lixo apropriado. Pipete imediatamente 500 μL de meio frio neurobasal-A no mesmo tubo para substituir a solução que foi removida. Substitua os tubos no gelo entre as lavagens.
   3. Repita mais 3 vezes para um total de 4 lavagens.
   4. Usando uma pipeta de transferência com borda aparada ou pinça, transfira cuidadosamente a retina para os tubos de sonicação contendo meio A neurobasal em gelo (consulte a etapa 1.1.4).
   5. Corte a retina em pedaços pequenos usando uma pequena tesoura de dissecação.
      NOTA: Certifique-se de lavar as ferramentas em etanol entre o corte de cada retina para não contaminar outras amostras.
   6. Sonicar cada retina por 5-10 s em uma amplitude de 10 e imediatamente colocá-la de volta no gelo.
      NOTA: Certifique-se de limpar a sonda de sonicação entre as amostras com etanol 100% seguido de H₂O ultrapuro. Neste ponto, pré-resfrie a centrífuga a 4 °C ou utilize a centrífuga em uma câmara fria a 4 °C, se disponível.
   7. Centrifugar a 4 °C durante 15 min à velocidade máxima de 21130 x g or, se for inferior a 21130 x g.
      NOTA: Durante a centrífuga de 15 minutos na etapa 2.5.7, pipete 100 μL dos padrões # 1-8 feitos na etapa 2.4 em uma placa preta de fundo transparente de 96 poços.
6. Lendo amostras em um leitor de placas
   1. Após o término da centrífuga de 15 minutos, remova 100 μL de sobrenadante e pipete para a placa de 96 poços.
   2. Insira a placa no leitor de placas.
      NOTA: A placa deve ter 100 μL de cada amostra e 100 μL de cada padrão.
   3. No software do leitor de placas, selecione o ensaio de ponto final de fluorescência com os parâmetros selecionados na etapa 1.1.7.
   4. Execute o ensaio e salve os resultados.
   5. Pipetar amostras de placa de 96 poços para os tubos pré-marcados de 1.1.4 para o ensaio de Pierce.
      NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser imediatamente analisadas para proteína (veja abaixo) ou armazenadas a -80 ° C.
7. Ensaio de Pierce para normalização de proteínas
   NOTA: O ensaio de Pierce deve ser executado em duplicata (padrões e amostras) para maior precisão.
   1. Usando os padrões de ensaio de proteína pré-diluída do ensaio de Pierce, pipete 10 μL de cada um em duplicata em uma placa inferior transparente de 96 poços.
   2. Pipetar 10 μL de cada uma das amostras em duplicado do passo 2.6.5 para a placa de 96 poços.
   3. Adicione 150 μL de reagente Pierce a todos os poços contendo padrões ou amostras. Cubra a placa de 96 poços e misture em um agitador de placas em velocidade média por 1 min.
   4. Incube a placa à temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
   5. Insira a placa no leitor de placas. Selecione o ensaio do ponto final de absorbância e defina o comprimento de onda para 660 nm.
   6. Meça a absorbância de padrões e amostras e salve os resultados. Calcular o total de microgramas de proteína em cada amostra traçando uma curva padrão.
8. Calculando a captação de 6-NBDG da retina.
   NOTA: Os resultados do 6-NBDG precisam ser normalizados para o conteúdo total de proteína devido aos tamanhos irregulares da retina.
   1. Usando os valores de intensidade de fluorescência obtidos na etapa 2.6, use as leituras de fluorescência de padrões predeterminados para traçar uma curva padrão de fluorescência de 6-NBDG e quantificar a concentração de 6-NBDG (μM) em cada amostra.
   2. Normalize os resultados da amostra para as quantidades de proteína correspondentes para determinar a proteína [6-NBDG] μM / μg.

Resultados

A Figura 4 mostra medições representativas de fluorescência de glicose da retina de camundongos WT incubados com 6-NBDG por diferentes períodos de tempo. Após 30 min de incubação, os níveis de 6-NBDG foram em média de 336 ± 27,91 UA, enquanto após 60 min, os níveis de 6-NBDG aumentaram para uma média de 616,3 ± 8,38 UA. Uma incubação adicional de 30 min levou a um nível reduzido de 6-NBDG (506,4 ± 5,3 UA). Aos 60 min, a variabilidade nos re...

Discussão

Em resumo, o método descrito permite que pesquisadores de ciências básicas meçam a captação do análogo fluorescente da glicose, 6-NBDG, na retina neural murina ex vivo . A glicose é um metabólito essencial para a retina neural, sua captação suporta as altas taxas de glicólise e respiração mitocondrial necessárias para produzir energia na forma de trifosfato de adenosina (ATP)¹. Como a glicose é o substrato energético preferido, muitas cé...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
# 5 forceps	Katena	K5-6550	Used for retina dissection
1.5 mL microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
26 G x 5/8" needle	sol-M	112658	Used to puncture cornea during dissection
5 mL tubes	MTC bio	c2540
50 mL tubes	Avantor by VWR	89039-656
6-NBDG	Invitrogen	N23106	Fluorescent gucose analog
96 well plates black with clear bottom	Thermo Fisher Scientific	265301
Anesthetic Charcoal Filter Cannister	ReFresh	EZ-258	Used in anesthesia set up
BAY-876	Millipore Sigma	SML1774	For inhibition of GLUT1.
Centrifuge at 4 °C	Eppendorf	EPP-5424
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)	Airgas	UN3156	Used in anesthesia set up
curved forceps	Roboz surgical instrument	RS-5137	Used for retina dissection
DDH2O	Elga LabWater	Elga PureLab Ultra	Used after ethanol to clean sonicator in between samples
Dissecting microscope	Olympus	szX12	Used for retina dissection
Ethanol 200 proof	Decon laboratories	2701	To be used to clean sonicator in between samples
Foam floating tube rack	Thermo Fisher Scientific	36-099-2328	For tubes during incubation in water bath steps
General scissors	Roboz surgical instrument	RS-680	Used for retina dissection
Isoflurane 250 mL bottle	Piramal critical care	NDC  6679401725	Anesthesia
Isoflurane equipment	Vetequip sold by VWR	89012-492	Used to anesthetize prior to euthanasia
Kim wipes	VWR	82003-820
Microplate reader	Molecular devices	SpectraMax M2 microplate reader	Used to read sample
Neurobasal- A media	Gibco	12349-015
Nose cone (low profile anesthesia mask)	Kent Scientific	SOMNO-0801	Used to deliver ansethesia
Objective on dissecting microscope	Olympus	DF plapo 1x pf	Used for retina dissection
Petri dish	VWR	25384-088	Used during retina dissection
Pierce assay reagent	Thermo Fisher Scientific	1861426
Pipette tips P20	Olympus Plastics	26-404
Pipette tips P200, P1000, P10 XL	VWR	76322-150, 76322-154, 76322-132
Pipetteman pipettes P200, P1000, P20, P10	VWR	F144055M, F144056M, F144058M, F144059M
SoftMax Pro software on computer	Molecular devices	SoftMax Pro 7 software	Software used to read sample
Sonic dismembrator	Thermo Fisher Scientific	FB50110	Sonicate sample (retina)
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM	Used to transfer retina from one tube to another
Vannas spring scissors	Katena	K4-5000	Used for retina dissection
Water bath set to 37 °C	N/A	N/A	Used for incubation