2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

要約

樹状細胞による二次リンパ器官における抗原提示がT細胞媒介免疫応答の開始に重要です。ここでは、マウス樹状細胞を骨髄由来の文化、活性化、および2光子イメージングのための標識を示す。

要約

マウス樹状細胞の調製のためのいくつかの方法が文献で見つけることができます。ここで、我々は文化の中では85％以上のCD11c高樹状細胞を生成する手法を提案することを皮下注射し、抗原特異的T細胞（ビデオを参照）に存在する抗原を後に流入領域リンパ節へのホーム。さらに、我々は、10日目に、培養細胞の形態は、成熟樹状細胞の典型的であり、細胞の<85％がCD11chighである、樹状細胞の成熟を、追跡するためにエッセン楽器Incucyteを使用してください。 2光子イメージングによる末梢リンパ節における抗原提示の研究では、樹状細胞とT細胞の相互作用^1、2の3つのフェーズが存在することを明らかにした。フェーズIは、樹状細胞^1、2を運ぶ非常に運動性の抗原特異的T細胞と抗原との間の短いシリアル接点で構成されています。第二段階は、樹状細胞^1、2をもつ抗原特異的T細胞と抗原との間の長期にわたる接触によってマークされます。最後に、第III相は、運動性を回復し^、1、2を分割し始めて、樹状細胞から切り離すT細胞によって特徴付けられる。これは、抗原負荷細胞トラッカー色素標識樹状細胞の二光子励起イメージングによって解析することができる抗原特異的相互作用のタイプの一例です。

プロトコル

1）1つのマウスから、両方の大腿骨の骨を削除します。

1. 筋肉を切り取ると、関節の上下の大腿骨（膝と腰を）公開する解剖鋏を使用してください。解剖ピンセットで大腿骨の中央をつかみ、可能な限りそのまま骨端を残すために、上記と関節の下にカット。
2. 小さな解剖鋏を使用して、できるだけ多くの筋肉のように拭き取ります。 RPMIの皿に大腿骨を移す。
3. 全ての手順は、滅菌媒体、楽器、ピペットチップと培養皿を使用して、この時点からフードの中で行われるべきである。

2）大腿骨の滅菌：

1. フードの中で、氷上で70％エタノールで満たされた小さな培養皿にRPMIから骨を転送する。
2. 骨は氷上で5分間エタノールに浸して許可する。

3）無菌条件下で骨髄を収集します。

1. 滅菌濾過したプライマリDCの培養培地を含む小さな培養皿に骨を移す。
2. 滅菌ピンセットで、廃棄ディッシュやチューブを介して骨を保持し、滅菌済みのハサミで、（骨の前端）各epiphesisを断つ。カットは、骨の中央部に明るい赤色になって骨髄を公開する必要があります。
3. 滅菌シリンジ（26-28ゲージの針）で、滅菌媒体の約100-200 mLを吸い上げる。
4. 滅菌媒体の新鮮な料理以上の滅菌ピンセットで骨を持ち、骨の片側に針を挿入する。骨の上部付近に針の先端を置き、徐々に滅菌メディアで骨を洗う。あなたが骨の中心にある場合、針は簡単にスライドするはずです。
5. 骨髄は、小さな断片にまたは一体としてのいずれか、洗う。それは骨のと滅菌媒体の皿に出フラッシュされるべきである。
6. 完全に骨から骨髄を洗い流すために、必要に応じてこの手順を繰り返します。
7. 骨がきれいになると、それは白と透明になります。
8. 他の大腿骨では、この手順を繰り返します。それがきれいになると、それぞれの大腿骨を捨てる。

4）再度中断し、骨髄細胞をスピンダウンする。

1. 滅菌ファルコンチューブに細胞を移す。
2. 骨髄はまだ変更されていない場合は、非常に穏やかに単一の細胞懸濁液中に骨髄を分割するために、皿の中で上下にメディアをピペット。これには数分かかる場合がありますし、薄手の力で細胞を殺すことを避けるために徐々に行う必要があります。
3. あなたが他の哺乳動物細胞と同じように細胞を遠心分離します。

5）細胞の溶解：

1. スピンが行われた後遠心機からチューブを外し、ボンネットの小さな廃棄物（50mlファルコンチューブ）に（別の容器に移す）メディアをオフに注ぐ。
2. 優しくチューブの底をフリックでペレットを再懸濁します。
3. 滅菌濾過した水と10倍DPBSまたは10倍PBSを使用して、次のボリュームを使用して赤血球（RBC）を除去する水の溶解を行う。
   • 900mLの滅菌ろ過された水
   • 100mLの10倍DPBSまたは10倍のPBS
4. 水を加えた後に10倍PBS 5〜10秒の100 mLを加え。それはすぐにこれだけの赤血球が溶解​​されていることをこれを行う非常に重要です。それは満たされたと準備ピペットの両方を持つことは良い考えです。
5. 滅菌DC基本的なメディアの10mLの - 5 mLを追加します。

6）セルを数える：

1. フードの中で、静かにわずかな反転、45度のチルト（メディアは、チューブの上部に触れるしないように）でチューブを渦巻くことで骨髄細胞の6から11 mLを混ぜる
2. カウント用滅菌チューブに、メディアの10mLを削除します。
3. 再キャップ細胞、再度遠心する。

7）めっきの樹状細胞：

1. 細胞は、1 × 106/mLの密度でプレートしてください。
2. メッキのプライマリDCのメディアの適切な量で遠心から細胞、デカンテーションメディアと再サスペンドセルを削除します。
3. 組織培養インキュベーター内の場所。

8）文化のケアと熟成。

常により多くのメディアを追加したり、実験に使用する前に、文化を確認してください。細胞の一般的な健康状態をチェックし、潜在的な汚染を探します。

0日目：樹状細胞はメッキ。

3日目：メディアと非adherant細胞の75％を削除し、バックプライマリDCのメディアを追加。

6日目：初期細胞のプレーティング後：次の手順を使用して再板細胞：

1. （あなたが接着細胞が乾燥しないようにする）は非常にわずかに湿ったプレートを残して、滅菌50mlファルコンチューブにいくつかの非adherantこの時点で樹状細胞、および場所が含まれているはずのメディアを、削除する
2. 各プレートにPBSで3 mMのEDTAを追加し、5分間静置することができます。
3. 45度の角度でプレートを持ち、優しく穏やかに非adherant細胞を取り除くために、プレートの底部に対して上下メディアをピペット。
4. EDTA / PBSが厚いことを示す細胞がの底から収集されているとなるべきプレート。
5. この数分後、細胞の混合物を50 mlのFalconチューブに転送することができます。
6. 各プレートごとにこの手順を実行した後にすべてのセルを回転させる。
7. カウントとプレート新しい滅菌10cmの培養皿で二次DCのメディアでプレートあたり1の密度で細胞× 10 ^ 6。組織培養インキュベーターにセルを返します。

DAY 10月11日

刺激/抗原負荷の準備ができて成熟DC。

9）樹状細胞刺激のため：

1. 活性化とペプチドのローディングのための所望のペプチドとの組み合わせでLPS（lipopolyscaccharide）を使用してください。 LPSの、ソースに応じて、異なる刺激の条件がより良い結果を与える可能性があります。さらに、DCのプレゼンテーションのためのペプチドの所望の量を最適化する必要があります。このプロトコルの刺激条件は100 ng / mLのLPSおよび100 ug / mlとOVA（卵白アルブミン）であった。
2. 負荷の抗原は、/使用/収穫前に18〜24時間LPSで扱う。

樹状細胞メディア：すべてのものが追加された後に滅菌済みフィルター

異なる樹状細胞の培養条件の見直しのため、結果樹状細胞の表現型のディスカッションセクションを参照してください。これらの培養条件は、効率的にその所属リンパ節へ急速に家庭成熟樹状細胞、皮下注射し、抗原を提示した後18〜24時間を生成するように設計されています。

プライマリDCメディア：すべてのものが追加された後に滅菌済みフィルター

• 500mLのIMDM（500ミリリットル、最終的なボリューム55-60 mLを削除）
• 50mLの熱不活性化FBS
• 200mMのL - Glnの5mLの、2 mMの最終濃度
• 100 IU / mlペニシリンおよび100 mg / mlストレプトマイシン（10,000 IU / mLのペンおよび10,000 mg / mLの連鎖球菌株の5mL）を
• 50μMのB -ミー（14.3 M B - Meの株式は、化学フード中で1:100に希釈、50マイクロモル濃度は、100 mLのメディアあたり35 ulを使用してください）
• 20〜30 ng / mLのGM - CSF
• 100〜400 IU / mLのIL - 4の約10〜40 ng / mLの

成熟*のSecondaryDCメディア

100 ng / mLのTNF -α（プライマリDCのメディアへの追加）

* 注 ：GM - CSF + IL - 4は、未成熟樹状細胞を生成する必要があります。 GM - CSFを使用して+ IL4（400 IU / UL）+ TNF -α（100 ug / mlとは）成熟した単球由来樹状細胞に似た細胞が作成されます。成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞と培養液として効率的に抗原を取ることが知られています内因性のTNF - ⁴間質細胞から遊離している可能性があります。

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ディスカッション

樹状細胞は適応免疫応答と日付に特徴づけられる最も効率的な抗原提示細胞の主要なメディエーターである。文学におけるヒトとマウスの樹状細胞培養のための方法は異なる樹状細胞型の開発に影響を与えるために使用されるサイトカインの種類が異なります。特に、GM - CSF、flt3L、IL4、IL13、TNF -αとIFN -γは、成熟未成熟、炎症性および定常状態の試験管^3-7に樹状細胞由来のマウス骨髄のように生成?...

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