골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

요약

돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

초록

murine 돌기 세포의 준비를 위해 여러 가지 방법이 문헌에서 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 문화에 이상 85% CD11c 높은 돌기 세포를 생산하는 방법을 제시 것을 피하 주입 및 항원 구체적인 T 세포 (동영상 참조) 현재 항원 후 배수 림프절의 고향. 또한, 우리는 일 10시 교양 세포의 형태가 성숙 돌기 세포와 세포의 <85% CD11chigh 아르의 전형이며, 돌기 세포 성숙을 추적하기 위해 에센 악기에게 Incucyte을 사용합니다. 2 - 광자 이미징에 의해 주변 림프절에 항원 프레 젠 테이션의 연구는 돌기 세포와 T 세포 상호 작용 ^{1, 2의} 세 개의 서로 다른 단계가있다는 것을 밝혔다. 페이즈 I는 매우 운동성이있는 특정 항원 T 세포와 돌기 세포 ^{1, 2를} 들고 항원 사이의 간단한 시리얼 연락처로 구성되어 있습니다. 차 두 항원에 특정한 T 세포와 돌기 세포 ^{1, 2} 베어링 항원 사이에 장시간 접촉에 의해 표시됩니다. 마지막으로, 단계 III는 운동성을 회복하고 ^{1, 2,을} 분할하기 시작, 돌기 세포에서 분리 T 세포에 의해 특징입니다. 이것은 항원 -로드 셀 추적 염료 분류 돌기 세포의 2 광자 영상으로 분석할 수 항원 특정 상호 작용의 유형의 한 예입니다.

프로토콜

1) 쥐 한마리에서 모두 대퇴골의 뼈를 제거

1. 근육 버려야하고 (무릎 및 고관절) 이상과 관절 아래의 대퇴골 뼈를 노출 해부 가위를 사용합니다. 해부의 족집게로 대퇴골의 중심을 파악하고 최대한 그대로 epiphysis의를 떠나 위의와 관절 아래 컷.
2. 작은 해부 가위를 사용하여 가능한 한 많은 근육으로 닦아. RPMI 한 접시에 몽둥이를 전송합니다.
3. 모든 절차는 무균 미디어, 악기, 피펫 팁 문화 요리를 사용하여,이 시점부터 후드에서 수행되어야합니다.

2) 대퇴골의 뼈를 소독 :

1. 후드에서 RPMI에서 얼음에 70 % 에탄올로 가득 작은 문화 요리에 유골​​을 전송할 수 있습니다.
2. 뼈가 얼음에 5 분 에탄올에 담그다 수 있습니다.

3) 무균 조건 하에서 골수를 수집합니다

1. 무균 여과 기본 DC 문화 매체를 포함하는 작은 문화 요리에 유골​​을 전송합니다.
2. 멸균 핀셋으로 폐기 접 관을 통해 뼈를 보유하고 멸균 가위로 (뼈의 종료) 각 epiphesis 잘라. 절단은 뼈의 중앙에 밝은 빨간색으로 골수를 노출해야합니다.
3. 멸균 주사기 (26-28 게이지 바늘)으로 살균 미디어 100-200에 대해 ML을 빨아.
4. 무균 미디어 신선한 음식을 통해 멸균 핀셋으로 뼈를 잡고 뼈의 한쪽에 바늘을 삽입합니다. 뼈 상단의 바늘의 끝 위치를 천천히 멸균 미디어 뼈를 씻으십시오. 당신이 뼈의 중심에있다면, 바늘은 쉽게 슬라이드한다.
5. 골수는 작은 조각 또는 한 조각으로 역시 밖으로 씻는다. 그것은 뼈 및 살균 미디어의 그릇에 밖으로 플러시해야합니다.
6. 완전히 뼈의 골수를 씻어 필요에 따라이 단계를 반복합니다.
7. 뼈를 깨끗하게되면, 그것은 흰색과 반투명 것입니다.
8. 다른 대퇴골 뼈이 절차를 반복합니다. 깨끗하게되면 각각의 대퇴부 뼈를 폐기하십시오.

4) 다시 일시 중지 및 골수 세포를 스핀 다운 :

1. 멸균 팰컨 튜브에 세포를 전송합니다.
2. 골수이 아직도 그대로있다면, 아주 부드럽게 단일 세포 현탁액으로 골수를 깨고, 접시에 미디어를 피펫 아래. 이것은 몇 분 정도 걸릴 수 있으며 깎아지른듯한 강제로 세포를 죽이는 않도록 천천히 이루어져야합니다.
3. 어떤 다른 포유 동물 세포처럼 세포 원심 분리기.

5) 셀 용해 :

1. 회전이 완료 후 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 후드에있는 작은 쓰레기 (50 ML 팔콘 튜브)로 미디어에서 (가만히 따르다)를 부어.
2. 부드럽게 튜브의 바닥을 flicking하여 Resuspend 펠릿.
3. 무균 여과 물 10X DPBS 또는 10X PBS를 사용하여 다음 볼륨을 사용하여 적혈구 (RBCs)를 제거하는 물 용해를 수행 :
   • 900 ML 무균 여과 물
   • 100 ML 10X DPBS 또는 10X PBS
4. 물을 추가한 후 10X PBS 50-10초 100 ML을 추가합니다. 그것은 즉시만을 RBCs가 lysed 것을 이렇게 매우 중요합니다. 그것은 두 pipettes 준비 채워 가지고하는 것이 좋습니다.
5. 무균 DC 기본 미디어 10 ML - 5 ML을 추가합니다.

6) 셀 카운트 :

1. 후드에서 부드럽게 약간 역전, 45도 기울기 (미디어 튜브의 상단을 접촉하지 않도록)와 튜브를 소용돌이 치는하여 골수 세포의 6-11 ML를 섞어
2. 계산을위한 멸균 튜브에 미디어 10 ML를 제거합니다.
3. 다시 모자 세포 원심 다시.

7) 도금 돌기 세포 :

1. 전지는 1 X 106/mL의 밀도에 도금해야합니다.
2. 도금에 대한 기본 DC 미디어의 해당 금액의 원심 분리기에서 세포, 가만히 따르다 미디어와 다시 중단 세포를 제거합니다.
3. 조직 문화의 인큐베이터에 놓습니다.

8) 문화 케어 및 성숙 :

항상 더 많은 미디어를 추가하거나 실험에 사용하기 전에 문화를 확인하십시오. 세포의 일반적인 건강을 확인하고 잠재적인 오염을 찾습니다.

DAY 0 : 돌기 세포 도금.

DAY 3 : 미디어 비 adherant 세포의 75 %를 제거하고 다시 기본 DC 미디어를 추가합니다.

DAY 6 : 초기 셀 도금 후 다음 절차를 사용하여 다시 판 전지 :

1. (당신은 자기편 세포가 건조하고 싶지 않아요) 매우 약간 서부 유럽 표준시 번호판을 떠나, 살균 50 ML 팔콘 튜브의 일부가 아닌 adherant이 시점에서 DC가, 장소를 포함한다 미디어를 제거
2. 각 플레이트에 PBS 3 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 5 분 앉아 수 있습니다.
3. 45도 각도에서 접시를 잡고 부드럽게 부드럽게 비 adherant 세포를 이동시키다하는 접시의 바닥에 대한 미디어를 피펫 아래.
4. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) / PBS는 두껍게 나타내는 세포의 바닥에서 수집되는 되야지판.
5. 이 몇 분 후에 세포 혼합물은 50 ML 팔콘 튜브로 전송하실 수 있습니다.
6. 각 플레이트에 대해이 절차를 수행한 후 모든 셀을 스핀.
7. 1 밀도에 카운트 및 플레이트 세포 X 10 ^ 새로운 살균 10cm 문화 요리 보조 DC 미디어 6 회 판. 조직 문화의 인큐베이터로 세포를 반환합니다.

DAY 10-11

자극 / 항원 로딩 준비 성숙 DC가.

9) 돌기 세포 자극 :

1. 활성화 및 펩티드 로딩을​​ 위해 원하는 펩타이드와 함께 LPS를 (lipopolyscaccharide)를 사용합니다. LPS의 소스에 따라 서로 다른 자극 조건은 더 나은 결과를 제공할 수 있습니다. 또한, DC 프레 젠 테이션을 위해 펩타이드의 원하는 금액을 최적화해야합니다. 이 프로토콜의 자극 조건은 10​​0 NG / ML LPS 100 UG / ML OVA (ovalbumin)되었습니다.
2. 로드 항원 / 사전 수확 18-24시간에 대한 LPS와 치료 / 사용합니다.

돌기 세포 미디어 : 모든 후 무균 필터가 추가되었습니다

다른 돌기 세포 배양 조건을 검토하고 그 결과 돌기 세포 표현형에 대한 토론 섹션을 참조하십시오. 이러한 문화 조건이 성숙 돌기 세포를 생산하도록 설계되는 급속 18~24시간 피하 주사하고 효율적으로 현재의 항원 후 배수 림프절에 집.

기본 DC 미디어 : 모든 후 무균 필터가 추가되었습니다

• 500 ML IMDM (500mL 최종 볼륨 55-60 ML 제거)
• 50 ML 열 inactivated FBS
• 200 MM L - Gln, 2 mm의 최종 농도 5 ML
• 100 IU / ML 페니실린과 100 MG / ML 스트렙토 마이신 (10,000 IU / ML 펜 및 만 MG / ML Strep 주식 5 ML)
• 50 음 B - 나 (14.3 M B - 내 물건은 화학 후드에 1:100을 희석, 50 micromolar 집중력 100 ML 미디어 당 35 UL 사용)
• 20-30 NG / ML GM - CSF
• 100-400 IU / ML IL - 4 약 10-40 NG / ML

성숙의 *에 대한 SecondaryDC 미디어

100 NG / ML TNF - 알파 (기본 DC 미디어에 추가)

* 참고 : GM - CSF + IL - 4는 어려서 돌기 세포를 생산한다. GM - CSF를 사용하여 + IL4 (400 IU / UL) + TNF - 알파 (100 UG / ML)은 성숙 단핵구 파생 돌기 세포 유사 세포를 생성합니다. 중년 여인 돌기 세포는 미숙 돌기 세포와 문화가 내생 TNF - stromal 세포에서 출시 ⁴ 수 있습니다 한한 효율적으로 항원을 차지하지 알려져 있습니다.

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토론

돌기 세포는 적응 면역 반응과 날짜에 특징이 가장 효율적인 항원 제시 세포의 핵심 중재자입니다. 문학 인간 및 마우스의 돌기 세포 배양을위한 방법은 다른 돌기 세포 유형의 발전에 영향을 미치는 데 사용 크린 시토킨의 종류에 차이가 있습니다. 특히, GM - CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF - 알파와 IFN - 감마는 성숙 미숙, 염증 및 정상 상태 체외 ^3-7에서 돌기 세포를 파생 murine 골수와 같은 생산하는 다른 조합에 사...

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