1. ナノ粒子注入と臓器収穫

1. 麻酔化されたマウスにナノ粒子を静脈内に注入し、パッシブターゲティングを可能にします。
2. 所望の時点で、すなわち、1、4および8週間、注射後、米国獣医学会(AVMA)ガイドラインに従ってマウスを人道的に安楽死させる。
3. 体腔を開き、外科的に目的の器官を取り除きます。試料調製までポリプロピレン容器に10%リン酸緩衝ホルマリンに臓器を入れます。

2. 組織サンプル調製

1. 鉗子を使用して、固定剤からリン酸緩衝生理食塩分(PBS)にマウス組織を移します。サンプルを30分間ロックし、PBSを10分ごとに交換します。
2. ティッシュを取り出し、キムワイプで乾かします。次に、最適な切断温度化合物(OCT)を含むプラスチック金型に入れます。一晩-80°Cで保管してください。
3. 翌日、試料をクライオスタットに移し、温度を-23°Cに設定する。
4. 臓器タイプとナノ粒子サイズでスライドにラベルを付け、クライオスタットの棚に置きます。
5. クリオスタットチャックをOCTで覆い、サンプルを上に置きます。サンプルの上に抽出器プランジャーを下げ、3〜5分間平衡化できるようにします。
6. チャックを試料ホルダーに取り付け、ブレードが凍ったサンプルをまっすぐ横切ることができるように向きを決める。サンプルをブレードの近くに持って来て、粗い向きにします。厚さを30μmに設定し、均等にカットされたスライスが生成されるまでいくつかのセクションをスライスします。
7. 断面厚さを7~8μmに減らし、微細な面に切り替えます。スライス上のラベル付きガラススライドを押して、スライスされたセクションを収集します。各スライドに 2 つのスライドを配置し、スライド ラックに保管します。室温で乾燥させます。
8. 乾いたら、スライドラックを50%エタノールに浸して3分間脱水し、OCTを取り除きます。その後、ラックを3分間80%エタノールに移し、-20°Cで10分間、冷たいメタノールをアセトンに1:1の比率で置きます。
9. スライドラックを取り外し、ペーパータオルで余分な溶剤を排出します。20~30分後、スライドをスライドボックスに入れ、イメージングするまで-20°Cの冷凍庫に保管します。

3. SEMおよびEDSを使用した高解像度イメージング

1. 「生体試料のSEMイメージング」の説明に従ってサンプルを準備します。次に、サンプルを SEM に読み込みます。
2. SEMをオンにし、作動距離を約5mmに調整し、加速電圧とビーム電流を25 keVに調整します。しかし、サンプルは導電性および保護のためにコーティングされる。
3. イメージングを開始し、約 1,000 ~2,000 倍の倍率にズームして、ナノ粒子を含む構造を確認します。バックスキャッタ検出(BSD)がないと、一定の深さの下でそれらを区別できないことに注意してください。
4. 同じパラメータの下に BSD を挿入し、Z 方向のステージを以前と同じ作業距離に移動します。
5. 同じ倍率でイメージングを開始し、ナノ粒子の存在下で高コントラストが見えることを確認します。画像を保存します。
6. 異なるBSD構成(検出器の電荷が揃う)を使用して、ナノ粒子のコントラストが最も高いものを選択します。
7. ナノ粒子またはナノ粒子の塊を示す高コントラスト領域にズームインする。
8. チャンバーの2^番目のカメラを開き、SEMアタッチメントのダウンボタンを押してEDSをシステムに挿入する時を見ます。EDSが閉じたが、BSDまたは銃に触れなくなったら、ボタンを放します。
9. EDSコンピュータ(まだワークステーション)でAztecプログラムを開き、SEMから画像を取得します。
10. EDSは、その点からの特徴的なX線のスペクトルを示します。グラフ上で識別されるバリウムとチタンのピークの両方を探します。これは、あなたが見ているものは、実際にナノ粒子であり、汚染の種類ではないことを確認します。
11. サンプルに戻り、Atlas ソフトウェアを使用してスライド上のオルガンの境界線をマッピングします。エリアのモザイク画像を作成するための「オルガン」プロトコルを選択し、それを実行させます(これはせいぜい数時間かかることがあります)。
12. 合成イメージが作成され、ソフトウェアによってステッチされたら、Tif ファイルとして書き出します。
13. オープンソースソフトウェアのImageJでTifファイルを開き、コントラストしきい値を調整して、非常に高いコントラスト(ナノ粒子)の領域を強調します。組み込み関数を使用して、Organ プロトコルで定義されたピクセル サイズを使用してナノ粒子の体積を定量化します (約 100 nm である必要があります)。
14. この手順はマウス肺の1週間のサンプルのみを指しますが、この手順は他の週および他の器官からのサンプルと繰り返され、分布を示すグラフをコンパイルします。
15. 各週の各臓器の生体分布を計算した後、生体分布グラフは、8週間の間にナノ粒子の生体分布と濃度の変化を示します。これらはピーク濃度を示し、また、ナノ粒子が器官からクリアするのにかかる時間に関する情報を提供します。