ラットにおける非侵襲的ACL損傷後の膝関節変性の可視化

ソース:リンジー・K・レプリー^1,2, スティーブン・M・デイビ¹, ティモシー・A・バターフィールド^3,4とシナ・シャーバズモハマディ⁵,

¹コネチカット大学キネシオロジー学科、ストールス、CT;²コネチカット大学ヘルスセンター、ファーミントン、CT整形外科³ケンタッキー大学リハビリテーション科学科、レキシントン、KY;⁴ケンタッキー大学生理学科筋生物学センター、レキシントン、KY;⁵コネチカット大学生物医学工学部、ストールズ、CT

膝の前十字靭帯(ACL)損傷は、約3分の1の個人がACL損傷後の最初の10年以内に放射線PTOAを実証するので、心的外傷後変形性関節症(PTOA)のリスクを劇的に増加させる。ACL再構成(ACLR)は膝関節の安定性を正常に回復しますが、ACLRおよび現在のリハビリテーション技術はPTOAの発症を妨げありません。したがって、ACL損傷は、外傷性関節損傷後のPTOAの発症を研究するのに理想的なモデルを表す。

ラットモデルは、PTOAに対するACL損傷の発症および影響を研究するために広く使用されている。ACL損傷の最も広く使用されているモデルはACL切除であり、これは関節を外科的に不安定にする急性モデルである。実用的であるが、このモデルは、傷害に対する天然の生物学的応答を隠す侵襲的および非生理学的傷害手順によるヒトACL傷害を忠実に模倣しない。結果の臨床翻訳を改善するために、我々は最近、脛骨圧縮の単一の負荷を介してACLが破裂するACL傷害の新しい非侵襲的モデルを開発しました。この傷害は人間に関連する傷害条件を密接に複製し、非常に再現可能である。

マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)による関節変性の可視化は、関節全体の変性の急速な、高分解能、非破壊的な3Dイメージングを含む従来のOA染色技術に対するいくつかの大きな進歩を提供します。このデモンストレーションの目的は、げっ歯類モデルで最先端の非侵襲的ACL傷害の状態を導入し、μCTを使用して膝関節変性を定量することです。

ACLは、脛骨の前部間角膜空間から生じる密な結合組織のバンド状の構造であり、大腿骨の側面の後部に上および横に延びる。構造的には、ACLは膝の受動安定剤の両方として機能し、他の靭帯と協調して働き、動的運動中の関節を制御するのに役立ちます。ACLは前脛骨変位に対する主要な拘束であり、膝関節の安定性を維持する上で重要な役割を果たします。構造的な支持を超えて、ACLはまた膝関節と中枢神経系との間の神経情報のための経路として機能する。ACL の最大のストレスは、膝が延長に近い場合に発生し、ACL が怪我の危険性が最も高いのはこの間です。

ACLは、スポーツや仕事に関連する活動中に最も一般的に負傷した膝の靭帯です。非接触 ACL 傷害は、すべての ACL 傷害の約 70% を占めており、ACL の過剰な読み込みにつながる十分な力や膝の瞬間を生成するときに発生します。非接触ACL傷害のメカニズムは、様々な研究モデル(前向き、回顧的、観察、生体内およびインビトロ)を使用して調査されていますが、傷害がどのように起こるかの直接的な決定は依然として不明瞭なままです。ACLの再構成は、多くの場合、個人ハムストリングまたは膝蓋腱の一部をACLの領域に外科的に挿入することによって行われる。外科的再建の目的は、損傷後に失われた膝の安定性および機能能力を最大化することである。外科的再建はスポーツへの安全な復帰を促進し、長期的な膝関節の健康を促進する。しかし、臨床医や研究者の最善の努力にもかかわらず、再建されたACLを持つ患者のほぼ3分の2は、再建後12ヶ月で活動に戻らず、再建されたACLの50%以上が傷害後5〜14年後にPTOA 5-14年の放射線徴候を有する。

動物モデルは、関節の健康に対する治療の自然史と応答を研究するための実用的かつ臨床的に関連する方法の両方を提供します。重要なことに、ラットの膝はヒトの膝と同様の解剖学的構造を有し、ラット膝はACL損傷後にPTOAを研究するのに有用なモデルとなる。結果の臨床翻訳を改善するために、我々は最近、ACLが脛骨圧縮の単一の負荷を介して破裂するACL傷害の新しい非侵襲的モデルを開発しました。この傷害は人間に関連する傷害条件を密接に複製し、非常に再現可能である。

ロード デバイスは、2 つのカスタムビルドの読み込みプラットフォームで構成されています (図 1)。トップ膝ステージは、直鎖状アクチュエータ(DCリニアアクチュエータL16-63-12-P、Phidgets、アルバータ州、CA)に剛性に取り付けられ、右後肢を^30°1-3のドーシフレクションと^100°1の膝屈の位置に配置し、脛骨に対する脛骨の前部サブラックスの余地を設けています。下の段階は屈曲した膝を握り、ロードセル(HDM社、PW6D、サウスフィールド、MI)の真上に取付けられる。傷害の間、ラットは麻酔され、次いで右後肢は8mm/s.1 ACL損傷の速度で脛骨圧縮の単一負荷を受け、カスタムプログラム(LabVIEW、ナショナルインスツルメンツ、オースティン、TX)を介して監視される傷害中の圧縮力の放出によって注目される。外傷後、ACL破裂はラクマンの検査によって臨床的に確認され、前向きの力が脛骨に加えられる間に大腿骨が確保される。前脛骨変換が過剰な場合は、ACL の欠乏を示します。ACLの傷ついた後肢は膝関節の変性を視覚化するためにカスタム3Dプリント装置で延長され、固定することができる。PTOA開発に関連する経角構造の変化を特徴付けるために画像を取得します。⁴

図1:単離された非侵襲的ACL損傷を引き起こす脛骨圧縮負荷。

非侵襲的ACL傷害

1. 適切な個人保護具を着用してください。呼吸マスクを使用できますが、このプロトコルでは必須ではありません。
2. 5%のイソフルランと1 L/分の酸素を有する誘導室を使用してラットを麻酔する。1-3%のアイソフルランと500 mL/minの酸素を持つ鼻コーンを介して麻酔の流れを維持します。装置がバックドラフトまたはダウンドラフトテーブルに設定されていない場合は、テーブルトップシステムとチャコールフィルターを使用して廃ガスが清掃されていることを確認してください。
3. つま先ピンチを実行して、十分な麻酔深度に達していることを確認します。注意してくださいプロトコルはすぐに実行される目の潤滑剤を適用する必要がなく(< 3分)、角膜の乾燥のリスクは最小限です。
4. 大腿骨に対する脛骨の前部亜脱臼のための余地を提供しながら、ドーシフレキションの30°と膝の屈曲の100°で右後肢を配置します。
5. 上部の膝の段階をリニアアクチュエータにしっかりと取り付けます。
6. 曲げ膝を下段に置き、ロードセルの真上に取り付けます。
7. 8 mm/s の速度で脛骨圧縮の単一負荷を使用して ACL 傷害を誘導します。
8. ACL傷害は圧縮力の解放によって注目される。これは、カスタム プログラムを介して監視されます。
9. 外傷後、動物がまだ麻酔の下にいる間に、ACL破裂が起こったことを臨床的に確認するためにラフマンの検査を行う。Lachmanのテストは、矢状計画の安定性を評価することによってACLの完全性を評価するために使用される臨床試験です。大腿骨を安定させながら、脛骨を前方(前方向)に引っ張り、運動量を評価します。無傷のACLは、研究者が脛骨を前方に翻訳することができない「しっかりしたエンドフィール」を生成します。負傷した ACL は、ACL が破れた可能性を示す「ソフトまたはムッシュなエンドフィール」を生成します。
10. 大腿骨と脛骨を触診して骨の大きな損傷を検出します。禁忌が確認されていない場合は、動物をケージに移し、回復を可能にする。この間、動物を監視して、動くことを嫌ったり、発声したり、異常な姿勢を示したりするなど、痛みの兆候が現れないことを確認します。

関節変性の>CTイメージング

2-D画像は、70 kV、電流85.5μAのスキャナ設定を使用して得られます(図2B)。データは完全な180°を通して11.5 μmの分解能で0.6°回転ステップごとに収集される。断面画像は、平滑化されたバックプロジェクション アルゴリズムと再構築されたイメージのスタック上に再構築されます (図 2C)。次に、ソフトウェアのセグメンテーションによってトラベキュラ構造が解析され、1.53mm球が内側および横脛骨高原のエピフィシャルプレートの中心に配置され、経角厚さ(μm)、軌道分離(μm)、および軌道数(1/mm)を決定します。^5、6

1. ACL後4週間の傷害で、誘導室内の_CO2への長時間の暴露でラットを安楽死させる。
2. カスタム 3D プリント デバイスで負傷した ACL の延長とセキュリティ保護 (図 2A)。
3. μCTを使用して画像を取得します。
4. 正面平面のX線写真を取得して、ジョイントスペースを決定します。傷ついた四肢と比較して(大腿骨のコンダイルと脛骨高原の間(mmで測定)狭窄。
5. 70 kV および電流 85.5 μA のスキャナー設定を使用して、2-D イメージを取得します。
6. 完全な180°を通して11.5μmのピクセルサイズで0.6°回転ステップごとにデータを収集します。
7. 再構築された画像のスタック上の平滑化されたバックプロジェクションアルゴリズムを使用して、断面画像を再構築します。
8. 一貫した対象領域を測定するには、内側および外側脛骨高原および大腿骨のエピフィシールプレートに1.53mm球を配置して、経角厚さ(μm)、軌道分離(μm)、および軌道番号(1/mm)を決定します。

図 2:A)μCT、B)2次元画像、およびC)3-D μCTの間に後肢を保持するカスタム印刷装置。

より小さい経電数は、トラベクチュラの厚さとより大きな運動間隔、PTOA発症のすべての特徴的な特性、非侵襲的ACL裂傷の4週間後に明らかであった(表1および図3)。健康な四肢と急性の負傷した四肢の解剖ACLの画像を図5に示す。ACLが脛骨圧縮の単一の負荷を介して破裂するACL傷害の新しい非侵襲的モデルは、ACLの孤立した近位の涙を作り出すことができた。

図3:ラットにおける急性ACL損傷(左)および4週間後ACL損傷(右)の3次元再構成されたμCT画像。

表1: PTOA発症の特性測定値

図4:急性の負傷したACL-limb(左)の画像と、無傷で健康なACLの画像(右)。

このビデオでは、リニアアクチュエータを使用してラットで孤立した非侵襲ACL破裂を生成する方法を示します。この傷害は人間に関連する傷害条件を密接に複製し、非常に再現可能である。従来のOA染色技術のいくつかの主要な制限を克服するために、この方法は、全体の関節変性および形質構造を定量するためにμCTを使用する。

筋骨格リハビリテーションの結果を改善するためのエビデンスに基づく介入は、基本的な生物学の大幅な進歩がリハビリテーションへの変更を示唆しているにもかかわらず、過去20年間でほとんど変化していない非常に重要な領域ですプロトコルの期限が長いです。問題は、古典的なリハビリテーションの専門家が、クリニックに翻訳する前にモデル生物でテストされる情報に基づいた仮説を提供するために、基礎科学ではなく臨床実践を形成するために逸話的なレポートを使用していることです。ここで説明する手順は、ヒトに関連する外傷性関節損傷を密接に複製し、関節の健康の進行を追跡するためにμCTを使用する方法を科学者に提供する。

材料リスト:

1. Maerz T, Kurdziel MD, Davidson AA, Baker KC, Anderson K, Matthew HW. Biomechanical Characterization of a Model of Noninvasive, Traumatic Anterior Cruciate Ligament Injury in the Rat. Ann Biomed Eng. 2015;43(10):2467-2476.
2. Christiansen BA, Anderson MJ, Lee CA, Williams JC, Yik JH, Haudenschild DR. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(7):773-782.
3. Lockwood KA, Chu BT, Anderson MJ, Haudenschild DR, Christiansen BA. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. J Orthop Res. 2014;32(1):79-88.
4. Blair-Levy JM, Watts CE, Fiorentino NM, Dimitriadis EK, Marini JC, Lipsky PE. A type I collagen defect leads to rapidly progressive osteoarthritis in a mouse model. Arthritis Rheum. 2008;58(4):1096-1106.
5. Mohan G, Perilli E, Kuliwaba JS, Humphries JM, Parkinson IH, Fazzalari NL. Application of in vivo micro-computed tomography in the temporal characterisation of subchondral bone architecture in a rat model of low-dose monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2011;13(6):R210.
6. Jones MD, Tran CW, Li G, Maksymowych WP, Zernicke RF, Doschak MR. In vivo microfocal computed tomography and micro-magnetic resonance imaging evaluation of antiresorptive and antiinflammatory drugs as preventive treatments of osteoarthritis in the rat. Arthritis Rheum. 2010;62(9):2726-2735.