この作品は、SKとヒース助成R01EB008722の国立研究所の国立科学財団大学院研究フェローシップでサポートされていました。

A.材料の調製と滅菌<ol><li>事前の準備を封止材料に混合し、37数日間℃でインキュベートすることによって、、（PBS）リン酸緩衝生理食塩水の光開始剤イルガキュア2959（I2959）の0.5重量％の溶液を調製解決策は、シリンジ滅菌のためにフィルタリングし、長期的な使用のために室温で保存することができます。 </li><li>合成しようとするゲルの所望の組成に基づいて、（Microsoft Excelなどのスプレッドシートプログラムを使用して）必要なポリマーと架橋剤の重量を計算する。ポリマーの特定の重量はヒドロゲル中の所望の濃度を達成するために定義された総量に溶解する必要があるため、合計ゲルの体積の架橋剤と高分子溶液の部分は、スプレッドシートを使用して決定する必要があります。任意のペンダント部分（例えば、オリゴペプチドを含有する接着剤RGDまたはYGSRが）前の架橋に組み込まれる場合、同様の計算がなされるべきである。 </li><li>エッペンドルフチュー​​ブにポリマーと架橋剤と場所の必要量を秤量する。得られたポリマーの実際の重量のためにそれに応じて計算のスプレッドシートを調整します。 （ 注 ：ボリュームは得られたポリマーと架橋剤の実際の質量を補償するために変更することができます）。 </li><li>個別包装滅菌1 mLの使い捨て注射器の上部をカットオフするためにカミソリの刃を使用してゲルの金型を準備します。フラットカットが光パターン形成のゲルに使用する金型のために作られていることを確認します。 </li><li>シリンジ型、エッペンドルフチュー​​ブ（キャップ​​を開いた状態で）、および殺菌用光源（通常は生物学的安全キャビネットに組み込まれている）の下にその他の必要な材料を置き、30分間滅菌する。 </li></ol> B.セルの調製<ol><li>滅菌に続いて、適切な滅菌緩衝ボリュームを追加する（表計算ごとに、バッファの選択は、異なるPBSおよびトリエタノールアミンなどの弱塩基のバッファは、通常、フリーラジカルとマイケル型架橋、それぞれに使用されることができますが）ポリマーエッペンドルフとする（オプション）ペンダントの部分に含まれる（例えば、接着性ペプチド）と溶解するために渦（無菌フードラップの外側にパラフィルムでエッペンドルフをボルテックスする場合）。 </li><li>ポリマー溶液にペンダント部分のソリューションの適切な量を追加し、パラフィルムでシールを包む。 37簡潔にボルテックスし、インキュベート° Cが細胞の準備中に（可能であれば、回転式攪拌プレートの上）に反応する。ペプチドが最終的なヒドロゲルのペンダント基として含まれているようにこれは、アクリル酸またはメタクリル酸のペプチドのチオールの反応を（システイン基を介して）が含まれます。 </li><li>トリプシン処理および細胞とゲルのセットごとに適切な数を含んでいる部分に分離して数える。たとえば、10万細胞/個々のコニカルチューブに加え、独立した150万細胞の密度で、3つの50μLのゲルのセットのため。それはこれ以上4よりゲルはゲル化のタイミング（：ゲルの複数のセットを合成する場合、すべてのセットに対して、ポリマー溶液の適切な量を含む単一のエッペンドルフは、調製することができる注）により、個々のセットで準備することをお勧めします。 </li><li>細胞を遠心分離します。 </li><li>細胞は、スピンダウンしている間<ol class="lalpha"><li> 光は、フリーラジカル架橋を開始 ：総ゲルセットボリューム（0.05重量％の最終的な開始剤濃度用）の10％に相当するポリマー溶液に0.5重量％I2959ソリューションを追加します。 </li><li> マイケル型（加算）架橋 ：適切な濃度溶液を達成するために架橋剤にバッファを追加する。 </li><li> シーケンシャル架橋のために ：これらのゲルは、架橋の両方のタイプを組み込むと、前の手順の両方が必要です。 </li></ol></li></ol> C.ハイドロゲル形成<ol><li>遠心分離した細胞の部分から上清を吸引除去する。細胞ペレットを中断することなく、できるだけ多くのメディアを削除するには、最初の吸引および再吸引後に安定する液体のを待ちます。 </li><li>細胞が均等に分散されるまで、ポリマー溶液で細胞ペレットを再懸濁します。溶液をゆっくりピペッティングして気泡の形成を最小限にし、ダウン（およそ10サイクルは、細胞を分散するために十分なはずです）。 </li><li>架橋ゲル<ol><li>シリンジの先端の金型に分注して、適切な量を： 光は、フリーラジカル架橋を開始した 。ラジカル架橋のために紫外線にシリンジを公開する（例えば、波長365nm〜10分露光、4 mW/cm2紫外光は、アクリレート官能化ポリマーが一般的です）。このステップは、UV光を露光する前にセトリングセルを最小限に抑えるために迅速に実行する必要があります。 </li><li> マイケル型（加算）架橋 ：広いオリフィスのピペットチップを使用して、ポリマー/セルソリューションへの架橋剤溶液を適切な量を追加し、希望する個々のゲルのボリュームにピペットを設定し、上下への解決策をピペッティングホモジナイズし、シリンジの先端の金型に分注し。このステップは、細胞の均一な分布を確保するために迅速に実行する必要があります。架橋用の培養フードの10-30分は（個々のシステムに応じて）インキュベーション許可する。 </li><li> シーケンシャル架橋 ：これは、その後、ミカエル型加算の最初の反応と第二架橋のために光照射を伴う。唯一の理論的架橋の割合は、最初の架橋時に反応させることが必要として無菌マスクが前に滅菌ピンセットを用いて光照射にゲルの表面に直接適用する必要があります。それはゲル（図2の根本的に架橋した地域で優先的に組み込むことになるための官能化染料（例えば、20nmのゲル中の最終濃度でメタクリルローダミン（MeRhoが））また、パターニングを視覚化するために最初の溶液に添加されることがあります）。 </li></ol></li></ol> D.細胞培養と分析<ol><li>以下の架橋、インキュベーションおよび分析のためにメディアを含む組織培養プレートのウェルに突入するのゲル（次の手順を参照）。 </li><li>蛍光デッド/ライブ染色キットを（図3と図4）を使用してと生存率、細胞が形態の光学顕微鏡（一般的に、合成されたハイドロゲルは、透明な図3）を使用するための視覚化できます。細胞アクチン（例えば、ローダミンまたはフルオレセインファロイジン標識された）と核（例えば、4&#39; - 6 -ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI））の染色は、以下の手順で標準の固定と透過処理手順（図4）を使用して実行することができます。 <ol class="laplha"><li> PBSで5分間3X構造をすすぐ。 </li><li>室温で30分間1 mLの4％ホルムアルデヒド中でのインキュベーションにより、ゲルを固定してください。 </li><li> 3％（w / v）のBSAと0.5％（w / v）のPBSでTweenを含むブロッキング溶液で3倍の構造をすすいでください。 </li><li> 0.25％（w / v）の20分間ブロッキング溶液のトリトンXで膜を透過処理。 </li><li>ブロッキング溶液で3倍の構造をすすいでください。 </li><li>室温で2時間ブロッキング溶液で0.66μg/ mLのFITCまたはローダミンファロイジンでF -アクチンのために染色。 </li><li>ブロッキング溶液で3倍すすいでください。 </li><li> 20分間、0.4μL/ PBS中DAPIを使用して細胞核を染色する。 </li><li> PBSで3倍リンス。 </li><li>落射蛍光または共焦点顕微鏡を用いて細胞を視覚化する。 </li></ol></li><li>ゲル内の細胞の増殖は、一般的に市販のアッセイ（例えば、全DNAまたは生化学的なコンテンツ）を用いて評価される。 PicoGreenは、二本鎖DNAを（歌手ら。）定量化するための染色、一般的に使用されると感受性蛍光核酸である。セルもカウントし、ステップ2で説明されている可視化メソッドを使用して初期の管理番号に正規化することができる。 </li><li>組織学的切片と染色は、細胞を可視化し、マトリックスを形成するために使用することができます。 3Dハイドロゲルの脱水とセクショニングの以下のプロトコルは、スライドガラス上に断面スライスを得るために使用されることがあります。 <ol class="lalpha"><li> 固定と脱水 <ol class="lroman"><li> PBSで3倍試料をすすぐ。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒドで30分 - 5を修正しました。 </li><li> PBSで3倍試料をすすぐ。 </li><li> 25℃EtOH中でサンプルをインキュベート° C以下のエタノール（v / v）の水の濃度（順番に）のそれぞれで1時間：50％、70％、95％、95％、100％（この時点で、サンプル25℃で一晩保存することができます° C）。 </li></ol></li><li> クリアと浸透 <ol class="lroman"><li> 25 1時間に100％Citrisolv 65℃で一時間に続いてC、℃に転送する</li><li>サンプルの断面が露出するようにペトリ皿にカミソリの刃で半分にサンプルをカット。 </li><li> Citrisolv / 65で1時間、マイクロカットパラフィン℃の1:1混合物への転送</li><li> 65℃1時間の100％マイクロカットパラフィン℃に転送する</li><li> 65℃一晩100パーセントマイクロカットパラフィンに転送℃に</li><li> 65で1〜2時間の100％マイクロカットパラフィン℃に移し</li></ol></li><li> 埋め込 ​​み <ol class="lroman"><li>ピールアウェイ100％のパラフィンと金型の位置の標本。 </li><li>金型の床のワックスを少量を置き、断面が下に向くようにサンプルの半分ずつを挿入します。 </li><li>上部フィルターの部分を適用する<ol><li>水没トップピースをするために追加のワックスを追加し、〜10分間硬化することができます。 </li></ol></li><li> ° Cの冷蔵庫では硬化に試料を一晩できるように4にインサートを移す。 </li><li>試料は、セクションがあります一般的に市販のミクロトームを使用してスライスあたり5〜10μmの厚さでEDには、次の日、。一般的にピールアウェイモールドをミクロトームステージに対して垂直にマウントされている、とマニュアルコントロールは刃と試料の断面の厚さ、スライサーと配置を設定するために使用されます。 </li></ol></li><li> RNA抽出 遺伝子の発現はまた、（例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を経由して）定量的に評価することができる。 3DハイドロゲルからのRNA抽出、以下に与えられているそのうちの例えば、のためのプロトコルは、はるかに単純な2次元の場合とはかなり異なります。 <ol class="lroman"><li>各3Dハイドロゲルのために認定されたRNaseフリーのエッペンドルフチュー​​ブにラベルを付け、各チューブに500μLトリゾール®試薬を加える。 </li><li>透明な溶液が得られるまで手動でハイドロゲルを粉砕する乳棒（組織グラインダー）を使用してください。別のグラインダーがそれぞれの条件のために使用されていることを確認します。 </li><li>渦各エッペンドルフは、20秒間のサンプルをホモジナイズする。 </li><li>核タンパク質複合体の完全な解離を可能にするために5分間、室温でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 20分間氷上で冷却サンプル</li><li> 200μL（1mLあたりトリゾール）各サンプルと渦にクロロホルムを追加。 </li><li> five分間室温でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 4℃で12,000 xgで試料を遠心℃で15分間。 </li><li>新しいエッペンドルフチュー​​ブ（界面領域と低い赤、フェノール - クロロホルム相を回避）するために水相（明確な最上層）を移す。 RNAは、明確な水相に残っています。 </li><li> RNAの分離と貯蔵のための一般的なテクニックが使用できるようになりました。 </li><li>以下のRNA抽出、逆転写酵素とリアルタイムPCR用の市販のキットは、しばしばいくつかの修正（Elisseff ら 、Strehin ら ）で使用されています。 </li></ol></li></ol></li></ol>代表的な結果： 光パターン形成ハイドロゲルと、ゲル内の細胞のカプセル化の可視化の代表的な結果については図2-4の（上記のプロトコルで参照される）を参照してください。 <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig1_2.jpg" alt="図1" /> 図1。3Dカプセル化手順の概要。ダイアグラムのステップは、段階的なプロトコルのセクションのタイトルに対応しています。 <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig2.jpg" alt="図2" /> シーケンシャルマイケル型加算してラジカル重合を用いて図2。光パターン形成ハイドロゲル。写真反応染料の取り込みにより部分的に架橋ヒドロゲルの光パターニングの（A）の回路図。 （B）サークルやヒアルロン酸ハイドロゲルをパターン化（C）ストライプの透明フィルムのマスク。メタクリルローダミン（MeRhoは）唯一の光にさらされたゲルの領域に組み込まれている。スケールバー= 100μmの。 <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。3Dハイドロゲル中の細胞の可視化。幹細胞は、（）光学顕微鏡または（b）のライブ（緑、カルセインAM）と死んだ（赤、エチジウムホモ二量体A - 1）染色光によって架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルで100万個/ mLにカプセル化して24時間後を介して可視化フリーラジカル機構を開始した。スケールバー= 100μmの。 <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。3Dハイドロゲル中の細胞の可視化。 hMSCsは（ミカエル型メカニズムを介して架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの1万細胞/ mLのカプセル化は、次の（a）生細胞（カルセインAM）または（b）細胞のアクチン（ローダミンファロイジン）と核（DAPI）五日間染色）ペンダントの接着ペプチドと二官能性タンパク質分解分解ペプチドの架橋剤を使用。スケールバー= 100μmの。

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).</li><li>Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Responsive+Synthetic+Hydrogels.">Cell-Responsive Synthetic Hydrogels.</a> Adv Mater. 15, 888-892 (2003).</li><li>Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Photoencapsulation+in+Hydrogels.">Cellular Photoencapsulation in Hydrogels.</a> Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).</li><li>Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+auricular+chondrocyte+expansion+on+neocartilage+formation+in+photocrosslinked+hyaluronic+acid+networks.">Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks.</a> Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).</li><li>Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+microenvironments+for+controlled+stem+cell+differentiation.">Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).</li><li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Mode+Thiol-Acrylate+Photopolymerization+for+the+Synthesis+of+PEG-Peptide+Hydrogels.">Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels.</a> Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-responsive+hydrogel+for+encapsulation+of+vascular+cells.">Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells.</a> Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).</li><li>Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ECM+Production+by+Cells+Encapsulated+in+Hydrogels.">Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels.</a> Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).</li><li>Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+crosslinking+to+control+cellular+spreading+in+3-dimensional+hydrogels.">Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels.</a> Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).</li></ol>

記載されているプロトコルはcytocompatible方法で、ハイドロゲルスキャフォールド内の細胞をカプセル化するシンプルかつ強力な方法を表しています。分化と幹細胞は2次元対3次元微小環境で著しく異なる挙動を示すことができるので、そのような技術は特に重要です。であっても材料の注入（例えば、 その場ラジカル重合）、細胞のカプセル化と実行可能性と差別化のための分析を含む治療法のために材料の開発プロセスに役立ちます。説明したシーケンシャル処理は空間的にハイドロゲルの環境を操作するために使用し、その結果、細胞挙動（Khetan らを参照してください。）することができます。 全体的に、記載されているプロトコルの最も重要な要素は、使用されるすべてのソリューションの均質性である。特に、特別な注意が架橋剤溶液の添加後の細胞が均等にプレポリマー溶液に分散されている、と解決策がよくピペットの再懸濁によって混合されるように注意してください。これを確実に失敗すると、セルまたはゲルの構造における局所変形の凝集や腫れにつながることができます。 プロトコルはここで主に細胞をカプセル化するための手順に焦点を提示しながら、それがカプセル化は、通常、2Dシードに書かれている分析のプロトコルにはいくつかの調整が必要かもしれないことにも留意することが重要である。いくつかの例は、ヒドロゲルの細胞を可視化し評価するための例示された。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.2 M Triethanolamine Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0449</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-117</td>
<td>1x, sterile liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead staining kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-FITC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine Phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>R415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D9542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Citrisolv</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-143975</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-cut paraffin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>24202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizol reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.22 &mu;m pore size nylon syringe filters</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>09-719C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 mL disposable syringes</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>Cut syringes at consistent height for UV exposure</td>
</tr>
<tr>
<td>Wide orifice pipette tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>254 nm germicidal UV light source</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Built into most biological safety cabinets</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cellular encapsulation in 3d hydrogels for tissue engineering 

ヒドロゲル内の細胞の3次元カプセル化は、細胞を培養するためと組織工学のための構造の開発に向けてますます重要と一般的な手法を表します。この環境は良く、標準の組織培養に比べて、細胞がin vivoで観察するのか組織のようなプロパティや3D環境のために模倣している。合成高分子ハイドロゲルは、安定しているようにしたり、新しい組織がカプセル化された細胞によって堆積されるとして、加水分解やタンパク質分解を介して分解するように設計することができる水膨潤ネットワークです。ポリマーの多種多様なポリ（エチレングリコール）とヒアルロン酸のようなこれらのアプリケーション用に検討されている。最も一般的に、ポリマーは、メタクリレートまたは様々なメカニズムを介して架橋を行うことができるアクリレート等の反応性基で官能化されています。カプセル化された幹細胞（。バーディックら ）の分化を含む実行可能性と直接細胞の表現型を、改善するために-生化学的手がかりの物理的またはペンダント共有結合の取り込みによるなど、 -過去十年間で、多くの進歩は、これらの微小環境工学で行われている。 細胞の3次元カプセル化するための次のメソッドは、cytocompatibilityを最大化し、ハイドロゲルの処理ステップの数を最小限に抑えるために私たちや他の研究室に最適化されています。次のプロトコル（手順の図は、図1を参照）で、それは架橋を受けることができる官能化ポリマーが手にすでに存在することを前提としています。ティッシュエンジニアリングの分野に適用される高分子化学の優れたレビューは他の場所で見つけることができる（バーディックら。）及びこれらのメソッドは、ポリマーの種類の範囲と互換性があります。さらに、ここに焦点を当てたマイケル型加算（Lutolf らを参照してください。）及び光開始フリーラジカル（エリセーエフらを参照してください。）メカニズムが報告された架橋技術のごく一部を構成する。反応性基の部分が最初に加えて架橋によって消費されるとラジカル機構に先行しているの混合モードの架橋は、カプセル化された細胞（Khetan ら 、サリナスら ）の表現型を誘導するための別の一般的に使用されると強力なパラダイムです。

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Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

我々は、合成ハイドロゲル内の細胞の3次元（3D）カプセル化するためのプロトコルを提示する。カプセル化手順は、次の2つの一般的に使用される架橋の方法（マイケル型の加算と光 - 開始フリーラジカル機構）だけでなく、カプセル化された細胞の挙動を評価するためのテクニックの数のために概説されています。

組織工学のための3Dハイドロゲルの細胞のカプセル化

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

36.7K ビュー.  University of Pennsylvania. 我々は、合成ハイドロゲル内の細胞の3次元（3D）カプセル化するためのプロトコルを提示する。カプセル化手順は、次の2つの一般的に使用される架橋の方法（マイケル型の加算と光 - 開始フリーラジカル機構）だけでなく、カプセル化された細胞の挙動を評価するためのテクニックの数のために概説されています。

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Experimental Approaches to Tissue Engineering

組織工学への実験的アプローチ

生物学

Title Cell Encapsulation by Droplets

滴タイトルセルのカプセル化

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

組織工学と細胞培養のための繊維状重合体の足場をエレクトロ

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these models utilize reconstituted basement membrane derived from animals which contain a variable amount of growth factors and cytokines that can influence the growth of these cell culture models. Here, we describe in detail the preparation and use of PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel that is devoid of animal-derived material and pathogens to encapsulate and propagate the ovarian cancer cell line, OVCAR-5. We begin by describing how to prepare the PuraMatrix prior to use. Next, we demonstrate how to properly mix the PuraMatrix and cell suspension to encapsulate the cells in the hydrogel. Upon the addition of cell culture media or injection into a physiological environment, the peptide component of PuraMatrix rapidly self assembles into a 3D hydrogel that exhibits a nanometer scale fibrous structure with an average pore size of 5-200 nm1. In addition, we demonstrate how to propagate cultures grown in encapsulated PuraMatrix. When encapsulated in PuraMatrix, OVCAR-5 cells assemble into three dimensional acinar structures that more closely resemble the morphology of micrometastatic nodules observed in the clinic than monolayer in vitro models. Using confocal microscopy we illustrate the appearance of representative OVCAR-5 cells encapsulated in PuraMatrix on day 1, 3, 5, and 7 post plating. The use of PuraMatrix to culture cancer cells should improve our understanding of the disease and allow us to assess treatment response in more clinically predictive model systems.

This video demonstrates how to encapsulate and culture cancer cells in PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel.

癌細胞のPuraMatrixのカプセル化

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

アクリルアミド系ハイドロゲルを用いた細胞機能のマトリックスの剛性の影響を研究

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

イモリのレンズ再生を研究するために培養虹彩色素上皮細胞のためのシステム

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

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Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

滑液における培養ヒト関節軟骨細胞用の3Dシステム

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

軟骨アガロースゲルの機械的刺激

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

DNA架橋ポリアクリルアミドハイドロゲルの調製

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...