研究は、トランスレーショナルリサーチのウォレス時間コールター財団早いキャリア賞によってサポートされています。血液サンプルの収集とヘルプのためのティムアンドリュース、小児血液/腫瘍学、のおかげ。また博士はサムヴェルハウゼン、フローサイトメトリーコア、フローサイトメトリーのサンプルを実行するとヘルプのためのジェームズグラハムブラウンがんセンター、おかげで。

パート1。マイクロ流体デバイスの製作マイクロ流体の溶解装置のシリコンのマスターの金型はルイビルクリーンルームの大学での機器で標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して作成された[1]。 AutoCADは（オートデスク株式会社、サンラファエル、カリフォルニア州）チャネルの負のレプリカを作成する（輝いているイメージング、コロラドスプリングズ、コロラド州）透明度のマスクを生成するために使用されていました。マイクロ流体の溶解装置は、エラストマー、ポリ（ジメチルシロキサン）（ダウコーニング、ミッドランド、MI PDMS）とソフトリソグラフィ技術を用いてシリコンマスター金型から製造された。複製されたチャネルを持つエラストマーがリリースされ、チャネルのアクセスホールは、20ゲージの針（スモールパーツ、ミラマー、フロリダ州。）でパンチされた。 PDMSのウェハは、不可逆的に酸素プラズマを介してスライドガラスに接着し、実験のためにテストされています。 パート2。溶解装置を実行するためのプロトコルマイクロ流体デバイスを作製し、テストされた後、赤血球溶解の実験では、開始する準備が整います。次のセクションでは、マイクロ流体デバイスのためのプロトコル。 2.1サンプル集<ol><li> two 2ミリリットル緑トップvaccutainersの抗凝固剤としてヘパリンを持つ患者の前腕の静脈に、肘正中皮静脈から血液サンプルの4ミリリットルを収集する。 </li><li>それが外れ成熟した内皮細胞を（偽陽性）が含まれているとして、最初の2 mlチューブを捨てる。 </li><li>上下に回すことで血液とヘパリンを混合する第2のチューブを再懸濁し、氷上に即座に保存。 </li><li> 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブへの血液の1 mlを入れる。 （コレクションの一時間以内）に血液サンプルを処理します。 </li></ol> PBS 2.2総理マイクロ流体デバイス<ol><li>ガラスに結合マイクロ流体デバイスを取得します。入口と出口で少し大きめの直径（図1）の圧入アクセスチューブ（スモールパーツ、ミラマー、フロリダ州）。 </li><li>ミクロマクロをインターフェイスに提供し、入口の各チューブに30ゲージの注射針を（小さな部品、ミラマー、フロリダ州）に取り付けます。 </li><li> 1X PBSで1 mlのシリンジを記入し、シリンジの針をフリックで気泡を取り除くために確認してください。マイクロ流体デバイスの入口1にPBS -ロードされた1 mlのシリンジを接続してください。解決策は、入口2から流れ出すまで、手で軽く1X PBSを含む注射器を押し込み、すぐに標準的なオフィスバインダークリップで口2をクランプ</li><li>流体がマイクロ流体デバイスの出口ポートに到達するまで、1X PBSを押し続けます。解決策は、コンセントから流れ出すと、別のバインダークリップでアウトレットチューブをクランプする。 </li><li> 1X PBSが口3から流出するまで、1 mlのシリンジを押し続けると、別のOfficeバインダークリップで口3ポートをクランプする。マイクロ流体デバイスは、今や完全に準備されている。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="図1" /> 図1の各ソリューションとコンセントのための入口を示す装置の概略図。 シリンジポンプとソリューション2.3準備<ol><li>ポンプのキャリブレーションを行うには、次の手順を実行します。 <ol class="lalpha"><li>大規模なハーバードのシリンジポンプ（ハーバード大学、PHD 2000分の22の部品番号702000）の場合：22.5ミリメートル、流量600μL/ minのためにDiameterコンフィグレーションを設定します。 </li><li>小さなハーバードのシリンジポンプ（ハーバード大学、ピコプラス部品番号702213）の場合：4.61ミリメートル、流速20μL/ minにDiameterコンフィグレーションを設定します。 </li></ol></li><li>滅菌脱イオン水を使用すると、ワン30mlのシリンジを埋める。これは、50 mlコニカルチューブから直接解決策を引き出すことによって達成することができます。 （注射器にラベルを付ける） </li><li>手順9で説明した手順を使用して、2Xリン酸緩衝-生理食塩水（PBS）、2％パラホルムアルデヒド（PFA）で2 30mlのシリンジを埋める。 （注射器にラベルを付ける） </li><li>手順9で説明した手順を使用して、15 mlコニカルチューブに格納されたアリコートから1X PBSで1 mlの注射器を埋める。 </li><li>入口2と入口3〜30ミリリットル2X PBSのシリンジに30 mLの脱イオン水のシリンジを接続し（チューブまたはマイクロ流体デバイスで使用するドンtのトラップの気泡を確認してください）​​。入口2と3とアウトレットチューブからクランプを外します。入口1に1X PBSを1mlのシリンジを接続してください。 、液体を注射器の針を充填シリンジを接続し、気泡を除去するために注射針をフリックで気泡を導入することは避けてください。 </li></ol> 2.4赤血球溶解<ol><li>以下に概説されるよう適切なハーバードポンプのシリンジのすべてを設定します。 <ol class="lalpha"><li>大規模なハーバードのシリンジポンプに一緒に2つの30 mLシリンジ（1つ滅菌、脱イオン水と2X PBS、2％PFAで他を含む）を設定します。 </li><li>小さなハーバードのシリンジポンプに1 mlの注射器を（1X PBSを含む）を設定します。 </li><li>廃棄物のコレクターでアウトレットチューブを置きます（Wラベル付けされている50 mlコニカルチューブASTE）。 </li></ol></li><li>大規模なハーバードのシリンジポンプ（30 mLシリンジ付き）をオンにして、それを1分間実行してみましょう。 （は泡とデバイスまたはチューブのない漏れがないことを確認してください）​​。 </li><li>小さなハーバードのシリンジポンプの電源を入れ、追加分のために実行してみましょう。 （は泡とデバイスまたはチューブのない漏れがないことを確認してください）​​。ポンプを停止します。マイクロ流体デバイスは使用可能な状態になります。 </li><li>小さなハーバードのシリンジポンプから1X PBSを含む1 mlのシリンジを取り外します。 </li><li>血液サンプルを取得した後、気泡をトラップすることなく、滅菌1X PBSの0.05 mlを1 mlの注射器を埋める。次に、エッペンドルフチュー​​ブから得られた血液0.5mlをシリンジを埋める。 （1 mlの注射器は血液と1 × PBS緩衝液の0.55 mlの最終容量が含まれます。） 注 ：血液、0.05 mlのPBSの混合を避けるために充填しながら注射器を垂直に保つ。 </li><li>入口1に血液を含有する注射器を接続し、小さなハーバードのシリンジポンプ（シリンジをポンプに垂直マウントされている）上（装置にチューブを介して血液を押し避ける）慎重にシリンジをマウントします。 </li><li>廃液チューブからアウトレットチューブを取り外し、その場所に新しい50 ml遠心チューブに入れ、氷のバケツの上に置いてください。 </li><li>最初の大ハーバードのシリンジポンプのスイッチを入れ、それが1分間実行してみましょう。 50 ml遠心チューブにコンセントからのサンプルの収集を開始します。 </li><li>小さなハーバードシリンジポンプのスイッチを入れる。 </li><li> 1mlの注射器で血液サンプルが完全にデバイスを通過するとしたら、両方のポンプを停止する。これは約20分かかります。 </li><li>ブレーキオフ、室温で350 xgで5分間採取した試料を遠心分離します。 </li><li>白色ペレットの反対側にピペットチップを配置することによって、上清を取り除きます。ホワイトペレットを乱すことなく、可能な限り、特に赤血球の破片上清をできるだけ取り除く。 </li><li>上下にピペッティングして流れの緩衝液1ml（1X PBS、1％BSA [ウシ血清アルブミン]、2％PFA）でサンプルを再懸濁します。 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにサンプルを移す。 </li><li>室温で4 × gで5分間遠採取されたサンプルを。上清を除去する前と同じ精度を使用してください。 </li><li>ボルテックスで流れの緩衝液1mlでサンプルを再懸濁します。 </li></ol>フローサイトメトリー分析用2.5準備<ol><li>フローサイトメトリーを用いたサンプルの分析のために、フローサイトメトリーチューブにサンプルの100μlを加える。 </li><li>試料100μlに指定された抗体を（正しい濃度を確保する）を追加。 </li><li>サンプルは40℃で30分間インキュベートすることができます</li><li>フローサイトメトリーの前に流れの緩衝液で2回洗浄する。洗浄工程は、フローバッファを250μlを加えるボルテックス、350 xgで5分間遠心分離し、フローサイトメトリーチューブの一つの流体の回転と上清除去を含みます。 </li><li>フローバッファ250μlのでペレットを再懸濁します。サンプルは、フローサイトメトリーによって分析の準備ができています。 </li></ol>代表的な結果全血は、赤血球と豊か循環有核細胞（のCNC）からなくし、マイクロ流体の溶解装置と後処理のプロトコルを介して実行されています。理想的な結果は、独立したCNCの人口を持つクリーンなフローサイトメトリーの散布図が得られます。図2と図3の下に表示さ溶血することなく、前方散乱光（FSC）対側方散乱（SSC）の光のような軸を持つマイクロ流体プロトコルによる溶血による全血サンプルの散布図の比較です。それは、マイクロ流体濃縮プロトコルがクリーンフローサイトメトリーの散布図を得るために必要であることが分かる。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。FSCとSSCの軸を持つ赤血球溶解せずに全血サンプルのフローサイトメトリーの散布図。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。FSCとSSCの軸を持つ集団で標識されたマイクロ流体溶血と核細胞を循環のフローサイトメトリーの散布図。リージョン1（赤）は顆粒球を表すリージョン3（青）、領域2（緑）が単球を表し、リンパ球を表しており、リージョン4（紫）が特徴とされていない。 ときに必要なプロトコルのピペットによる赤血球の破片の除去も重要である。下の図4には、赤血球の破片の余剰を示す散布図である。図2のような散布図を曇らせるではありませんが、一つにはデータ分析の赤血球破片のために追加されたイベントを考慮する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="図4" /> クラスタとして見られる赤血球の破片を描いた図4。フローサイトメトリー散布図、地域5（シアン）のイベントの。 特定の抗体の表現型マーカーの染色細胞はまた、特徴的な結果を生成します。リンパ球、単球、顆粒球：以下の図では3つの異なる白血球集団のための抗体の表現型の汚れです。図5は、軸CD3とCD4にプロットされたリンパ球集団を表しています。単球および顆粒球は、それぞれ、FSCに対するCD14とCD66bのような軸を持つ6〜7図に示されています。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。フローサイトメトリーの散布図は、CD3とCD4の軸を持つリンパ球を描いた。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="図6" /> 図6。フローサイトメトリーの散布図は、FSCとCD14の軸と単球を描いた。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="図7" /> 図7。フローサイトメトリーの散布図は、FSCとCD66b軸を持つ顆粒球を描いた。

<ol>
	<li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+(SCD.">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li><li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis.">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li></ol>

自動化されたマイクロ流体血液溶解プロトコルが報告されている。プロトコルの中で注目に値する重要な手順は次のとおりです。セクションP.2.1で、それはサンプルが外れ成熟した内皮細胞が含まれている偽陽性として機能するように収集された最初の血液バイアルを廃棄することが重要です。また、コレクションの1時間以内に血液サンプルを実行することを確認してください。プライミン?...

automated microfluidic blood lysis protocol for enrichment of circulating nucleated cells

この報告書では自動化されたマイクロ流体血液溶解装置用プロトコルが詳しく説明されています。白血球と内皮細胞を含む有核細胞（のCNC）、循環、個々の免疫状態に関する更新状況のための理想的なプラットフォームを提供します。マイクロ流体のプロトコルは、選択的な細胞の損失と、ユーザーが介在するステップによる試料調製の変動なしでCNCの濃縮が可能になります。簡単に言えば、プロトコルは、デバイス作製、サンプルの収集、デバイスのセットアップ、およびマイクロ流体チャンバーを介して血液を実行しているが含まれています。デバイス内で全血は急速に50ミクロン× 150ミクロンマイクロ流体チャネル内の約10秒間、脱イオン水と混合される。この時点ではスパンの赤血球は低張条件により可溶化されています。チャネルの底部のヘリンボーン構造が完全に混合し、一定の環境への細胞の露出を確認してください。残りの細胞は、装置の出口で等張条件に戻さ2％のパラホルムアルデヒドを用いて固定し、CNCのから赤血球残骸を分離する遠心分離し、フローサイトメトリーによる染色と分析のために流れの緩衝液に懸濁している。結果は保存されているCNC人口クリーンフローサイトメトリーの散布図を示す。このデバイスとプロトコルの重要性は、CNCの個体群の解析による疾患の病因の研究と理解に来る。したがって、自動化、有効性、およびマイクロ流体プロトコルのシンプルさが実証されています。

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Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

自動化されたマイクロ流体デバイスは、セルの損失なしで高品質のサンプルの分離を確実に溶血を経由して末梢血からの有核細胞の濃縮を循環させるために開発されました。

有核細胞を循環の濃縮のための自動化されたマイクロ流体血液溶解プロトコル

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K ビュー.  University of Louisville. 自動化されたマイクロ流体デバイスは、セルの損失なしで高品質のサンプルの分離を確実に溶血を経由して末梢血からの有核細胞の濃縮を循環させるために開発されました。

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Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

StemCell Technologies社からRosetteSepキットと人間の血液からNK細胞の濃縮

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

生物学

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

マイクロ流体可溶性シグナルを介した相互作用を調査するために上皮細胞や細菌の共培養

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

遺伝子を使用するプロトコル設定トランスレーショナルリサーチの適切な動物モデルを識別するために濃縮分析

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

CD4 の分離+ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a problem for physicians and researchers. This manuscript describes a simple and effective method to monitor immune rejection in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. Circulating DNA is a potentially non-invasive biomarker for organ damage. In this study, circulating pig-specific DNA (cpsDNA) was monitored during xenograft rejection by quantitative real-time PCR (qPCR). In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Species-specific primers were then used to quantify cpsDNA by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. The value of this method suggests that it can be used as a simple, convenient, low cost, and less invasive method to monitor the immune rejection of xenotransplantation.

In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Using species-specific primers, cpsDNA was quantified by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models.

異種移植モデルの血液中の循環性豚特異的DNAの定量化

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...