この作品は、MCHオリンパスFV1000共焦点へNS042228がUW動物部（PIビルのBement）にNIHの共有の計測助成金S10RR023717で買収されたNIH R01によってサポートされていました。 エリカアンデルセン、Namrata Asuri、そしてマシュークレイはこの論文にも同様に貢献した。

1。注射のスライドとイメージングスライドの組み立てインジェクションのスライド： <ol><li>製造元の指示に従ってSylgardのシリコーンエラストマーを準備します。 </li><li>長い端に並べて配置している他の二つのスライドの交差点、の上にあるスライドを積み重ねることによって一緒にスライドする債券三つの標準ガラスの顕微鏡にSylgardを使用してください。上のスライドは、直角の角または上部と下部のスライドの間に&quot;壁&quot;を作成します。 </li><li> Sylgardが一夜設定してみましょう。これらのスライドは、再利用可能です。 </li></ol>イメージングのスライド： <ol><li>チャンバーは顕微鏡のステージ上でスライドホルダーに合うように、我々は標準的なガラスの顕微鏡スライド（75ミリメートルX 25ミリメートルX 1ミリメートル）の同じ大きさにカットステンレス鋼の長方形を使用してください。 1.5cmの穴は長方形の中央にカットされます。 </li><li> Sylgardと金属の長方形に貼付22ミリメートル2カバースリップ。徹底的にカバースリップをシールするだけで十分なSylgard使用。倒立顕微鏡上の画像に、胚は、このカバーに取り付けられ、底部から撮像されます。 </li><li> Sylgardが一夜設定してみましょう。これらのスライドは、再利用可能と利用の間に70％エタノールで洗浄です。 </li></ol> 2。 DNA構築物の調製組織特異的に遺伝子を発現させるために、目的の遺伝子は、細胞特異的プロモーターの後ろにクローン化されます。我々はそれぞれ、感覚ニューロンまたは神経堤細胞での発現を駆動するためにゼブラフィッシュneurogenin1遺伝子（- 3.1ngn1）2またはSOX10遺伝子（- 4.9sox10）3のシス調節エレメントを使用してください。細胞と細胞膜ダイナミクスを可視化するために、我々は、細胞質または細胞膜に局在する蛍光物質を表現する。画像F -アクチンの分布に、我々は、mCherry（UtrCH - mCherry）と融合したユートロフィンのカルポニン相同ドメインをコードするDNAを発現する。 UtrCH - mCherryバイオセンサープローブは、アクチンダイナミクス1に干渉することなく、F -アクチンの可視化が可能になります。我々は、組換えベースのクローニング戦略4とゼブラフィッシュTol2kit 5に設けベクトルインビトロジェンのゲートウェイを使用して、これらのDNAコンストラクトを生成します。 <ol><li>ゼブラフィッシュTol2kit 5からマルチサイト-ゲートウェイテクノロジーとベクトルを用いて発現ベクター（s）を生成する。プラスミドはpT2KXIGDinからTol2はバックボーンが含まれています。 </li><li> QIAfilterプラスミドミディプレップキット（QIAGEN社）でプラスミドDNAを精製し、滅菌水で溶出する。 DNAは、注射のために線形化する必要はありません。 </li></ol> 3。 DNA構築物の注入<ol><li>水の0.2％フェノールレッド（注入時の可視化のための）10〜50μg/ mlのDNAの最終濃度にDNAを希釈する。 </li><li>針を記入し、キャリブレーション：約1μlのDNA溶液を引っ張らキャピラリー針を埋戻し及び噴射装置（我々はPicospritzerを使用）のニードルホルダーに挿入します。微細な鉗子を使用して、先端の開口部の直径が約10mmとなるように針から先端を破る。接眼マイクロメータを持つ鉱物油の液滴の直径を測定する。約1 nlの量の液滴を得るために設定圧力の持続時間を調整します。 </li><li> E3胚の培地（5mMの塩化ナトリウム、0.17mMのKCl、0.33mMのCaCl 2、0.33mMのMgSO 4 · 7H 2 O、pH7.0）に、1細胞期胚を収集する。 </li><li>上部と下部のスライドの間に形成された直角の角にある胚はインジェクションのスライドおよび位置する約30〜60胚を転送します。胚は、表面張力によってスライドして開かれるようにE3の大部分を取り除く。 </li><li>細胞は、注入のスライドの壁になるように、胚を回転させる曲がった解剖ピンを使用してください。 </li><li>卵黄を通じて、胚の単一のセルに、胚の絨毛膜を通して針を導くためにマイクロマニピュレーターを使用してください。セルに0.5から1 nlのDNA溶液を注入。 </li><li> 28.5でE3とインキュベートのペトリ皿に胚を移す℃に必要に応じて、開発はより低い温度で胚をインキュベートすることによって遅くすることができます。 </li></ol> 4。イメージング用取付胚<ol><li>胚は、イメージング（我々の目的のために約14〜17時間後に受精）の希望の年齢に達する前に、時間に関する細かいピンセットを用い、胚からchorionsを削除します。 </li><li>蛍光装備解剖顕微鏡を用いて標識細胞と胚を選択してください。我々は、理由長作動距離と高倍率のその組み合わせのニコンAZ100の範囲で4倍対物レンズ（40X倍率）を使用してください。 </li><li>約50μlのE3が0.2％Tricaine麻酔薬を（10X濃度）含有する微量遠心管に胚を置きます。 </li><li> 0.02％の最終濃度にTricaineを希釈し、10mMのHEPES（42 ° Cで保管）、とのE3で500μlの1％低融点アガロースを追加。 </li><li>即時にアガロースドロップに胚を移す広口径のガラスピペットを用いてイメージングスライドのカバースリップ。 </li><li>アガロースが固まる前に標識された細胞を持つ地域がボトムのカバースリップ（神経堤細胞と脊髄感覚ニューロンのためのダウン背用背ダウン）に対して下に向くように、胚を置きます。 </li><li>金属製のイメージングスライドへのシリコーンの真空グリースや貼付でコーティングプラスチックリング（2センチメートル外径、高さ3mm）の片側：イメージングチャンバーを組み立てます。グリースとリングの反対側のコート。 </li><li> 10mMのHEPES、0.02％Tricaineを含むE3でチャンバーを埋める。リングの上部に油を塗った表面は22 MM 2カバーガラスを貼付することによりチャンバーの上部をシール。 </li></ol> 5。 IX81顕微鏡とオリンパスFV1000共焦点上での細胞挙動の4Dイメージング画像取得の詳細については、顕微鏡システムの仕様に依存します。ここでは、オリンパスFV1000共焦点顕微鏡のためのタイムラプス取得プロセスを説明します。ツァイスLSM 510共焦点システム6で時間経過の取得のための前のJoveのプロトコルを参照してください。 <ol><li>顕微鏡のステージ上でスライドホルダーにイメージング室を置き、透過光下で10倍または20倍対物レンズを使用して、胚に焦点を当てる。 </li><li> 60X目標（1.2以上のNA）に切り替え、落射蛍光で標識された細胞に焦点を当てる。我々は、どちら油浸（UPLSAPO 60xO NA 1.35）または水浸漬（UPLSAPO 60xW NA 1.20）レンズを使用してください。 </li><li> FVソフトウェア（バージョン1.7c）で、レーザーのスキャンを開始するためにXYの繰り返しをクリックしてください。 </li><li>組織の損傷を防ぎ、退色を軽減するために最小（25％以下）でレーザパワーを維持しながら信号を最適化するための取得設定と画像取得のコントロール（レーザ出力、走査速度、HV、ゲイン、およびオフセットのレベル）を調整する。 </li><li> Z -シリーズを取得するには、ステップサイズと一緒に、Z -スタックの上限と下限を設定します。奥行きアイコンがXYスイープアイコンがXYとZハイライト表示さ​​れているように従事されていることを確認します。 XYZのスイープのアイコンをクリックして、買収を開始します。 </li><li>タイムラプスシリーズを取得するには、TimeScan取得の設定]ウィンドウで、見出しの下の時点の時間間隔と回数を設定します。 XYスイープのアイコンがXY（Z）とT強調表示になるように画像集録コントロールウィンドウでの時刻のアイコンをクリックします。 XY（Z）Tのスイープのアイコンをクリックして、買収を開始します。 </li><li>また、TimeControllerはタイムラプスを設定するために使用することができます。大規模なデータセットを生成するときにそれがメモリの割り当てを超えていないとしてこのプログラミングでは、便利です。 [デバイス]の下で、TimeControllerウィンドウを開きます。新しいイメージングタスクを作成します。画像のパラメータウィンドウが開きます。買収の設定を更新するFV Status]ボタンをクリック。 makeは必ず保存して終了見出しの下にチェックされる削除。出力ファイル名を設定し、設定を保存し、ウィンドウを閉じます[OK]をクリックします。の時点の希望の時間間隔と回数を設定するには、ループ機能を使用してください。レディクリックして、取得を開始する起動します。一時停止およびZは、シフト機能をイメージングしながら再び集中するために使用することができます。 </li></ol> 6。代表的な結果フィギュアや映画は感覚神経や膜をターゲットとした蛍光体やアクチンバイオセンサープローブで標識された神経堤細胞の例を表しています。 <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 TG（ngn1：GFP - CAAX）の共焦点画像（Z -突起）。：mCherry - CAAXの DNA 25とPG ngn1を注入されたトランスジェニック胚。 mCherry - CAAXラベルラベルの付いたすべてのRohon -ビアード感覚ニューロンと背景の1つのニューロン赤（A）グリーン（B）。緑と赤の両方のチャネルのC）マージされた画像。スケールバー= 50μmの。 <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="図2" /> 図2共焦点z軸の突起〜20 pgのngn1を注入胚の神経細胞の：。。mCherry - UtrCHの DNA 16.5 HPFの胚で）Rohon -ビアード感覚ニューロン。 F -アクチンのシグナルは成長円錐（矢印）で、新しく形成された軸索に沿って突起に強いです。B）20 HPFの胚のニューロンは、分岐した末梢軸索（矢印）と、より成熟した中枢の弱い信号の成長円錐での強力なF -アクチンのシグナルを示す軸索（矢印）。スケールバー= 50μmの。

<ol>
	<li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo.">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li><li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination:+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones.">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li></ol>

注入されたDNAの最適濃度は、構築と経験的に決定されるべきであるプロモーターの大きさと強さによって異なります。あまりにも多くのDNAの注入が少なすぎる遺伝子を発現注入胚の非常に小さな割合につながる一方、大規模な細胞死と不健康な胚につながることができます。 DNAの発現レベルは細胞から細胞へ変化する蛍光物質のシグナルの強さと相関する。落射蛍光下で胚をソートしながら...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5040-250G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen Inc.</td>
<td>12243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15517-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Instrumentation, General Valve Division</td>
<td>051-0302-900</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos

ゼブラフィッシュは 、in vivo での開発時に画像セルの動作に最適なモデルです。ゼブラフィッシュの胚は外部から受精と開発のすべての段階でこのように簡単にアクセスされています。また、それらの光学的透明度はそのまま胚の自然環境における細胞と分子動力学の高分解能イメージングが可能になります。我々は、神経堤細胞の移動と神経軸索の伸長やガイダンス中の細胞の挙動を分析するライブイメージングの手法を使用しています。 ライブイメージングは​​、細胞運動のプロセスを制御するメカニズムを理解するために特に便利です。このような突出活動や分子動力学などの細胞の運動性の詳細を、可視化するために、それは個々の細胞を標識することが有利である。ゼブラフィッシュでは、プラスミドDNAの注入は一時的なモザイクの発現パターンが得られますし、他の細胞標識法に比べて明確な利点を提供しています。例えば、トランスジェニック系統は、多くの場合、全体の細胞集団をラベル付けするため、単セルの微細な突起（または分子の分布の変化）の視覚化を不明瞭にすることがあります。さらに、1細胞期でのDNAの注入は低侵襲と後の段階で染料を注射よりも正確です。 ここでは、個々の開発神経細胞や神経堤細胞とイメージング、in vivoでその動作を標識する方法を説明します。私たちは、モザイクのトランスジーン発現の結果1細胞期胚、中にプラスミドDNAを注入する。ベクトルは、その感覚神経細胞や神経堤細胞のサブセットに関心のある遺伝子のドライブの発現を細胞特異的プロモーターが含まれています。我々は、膜標的GFP、またはセル1を生体内でF -アクチンの可視化を可能にするバイオセンサープローブで標識された細胞の例を示します。 エリカアンデルセン、Namrata Asuri、そしてマシュークレイがこの作品にも同様に貢献した。

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Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

live-imaging-cell-motility-actin-cytoskeleton-individual-neurons

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K ビュー.  University of Wisconsin-Madison. このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。

ビデオ: Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

生物学

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...