وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 تم الحصول NS042228 لصحة الأم والطفل ومبائر FV1000 أوليمبوس مع الأجهزة المشتركة المعاهد الوطنية للصحة منح S10RR023717 إلى قسم علم الحيوان UW (PI بيل Bement). ساهم إيريكا أندرسون ، Asuri نامراتا ، وماثيو كلاي بالتساوي على هذه الورقة.

1. التجمع من الشرائح الحقن وشرائح التصوير حقن شرائح : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Sylgard الاستومر السيليكون وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام Sylgard إلى ثلاثة السندات القياسية ميكروسكوب الشرائح معا عن طريق التراص شريحة واحدة على رأس تقاطع الشرائح اثنين آخرين ، والتي رتبت جنبا إلى جنب على حواف طويلة. الشريحة الأعلى يخلق الزاوية اليمنى قائم الزاوية أو &quot;الجدار&quot; بين أعلى وأسفل الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا تعيين Sylgard بين عشية وضحاها. هذه الشرائح هي التي يعاد استخدامها. </li></ol> التصوير الشريحة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم مستطيلات الفولاذ المقاوم للصدأ لقطع نفس الحجم من شريحة زجاجية مجهر القياسية (75mm X 25mm X 1MM) بحيث يناسب غرفة حامل الشرائح على الساحة المجهر. يتم قطع ثقب الطول 1.5 في وسط المستطيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللاحقه حتى 22 مم 2 ساترة إلى المستطيل المعدن مع Sylgard. استخدام ما يكفي لاغلاق Sylgard بدقة ساترة. لصورة على مجهر مقلوب ، وسوف يتم تنظيمها على هذا الأجنة ساترة والتقط من القاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا تعيين Sylgard بين عشية وضحاها. هذه الشرائح هي التي يعاد استخدامها وتنظيفها مع الايثانول 70 ٪ بين الاستخدامات. </li></ol> 2. إعداد البنى الحمض النووي للتعبير عن التحوير بطريقة محددة الأنسجة ، هو استنساخ الجينات وراء المصالح مروج خلية محددة. نستخدم العنصر مقرون التنظيم من الجينات neurogenin1 الزرد (- 3.1ngn1) 2 أو الجين sox10 (- 4.9sox10) 3 إلى محرك التعبير في الخلايا العصبية الحسية أو الخلايا العصبية العرف ، على التوالي. لتصور غشاء الخلية وديناميكية ، فإننا نعرب عن هيولي أو fluorophores الأغشية المترجمة. للتوزيع F - أكتين صورة ، فإننا نعرب عن الحمض النووي الترميز المجال للتناظر calponin utrophin تنصهر لmCherry (UtrCH - mCherry). المسبار جهاز الاستشعار البيولوجي UtrCH - mCherry تسمح برؤية أكتين - F دون التدخل في ديناميات أكتين 1. نحن تولد هذه بنيات باستخدام الحمض النووي عبارة Invitrogen إعادة التركيب القائم على استراتيجية الاستنساخ (4) وناقلات المنصوص عليها في Tol2kit الزرد 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد ناقلات التعبير (ق) باستخدام متعددة المواقع ، بوابة التكنولوجيا وناقلات من الزرد Tol2kit 5. البلازميدات تحتوي على العمود الفقري Tol2 من pT2KXIGDin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية البلازميد الحمض النووي مع البلازميد QIAfilter طقم الإعدادية ميدي (QIAGEN شركة) ، وأزل في الماء المعقم. الحمض النووي لا يحتاج إلى أن يكون خطي للحقن. </li></ol> 3. يبني حقن الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخفف من تركيز الحمض النووي للنهائي من الحمض النووي ميكروغرام / مل 10-50 في أحمر الفينول 0.2 ٪ (على التصور خلال حقن) في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعبئة ومعايرة الإبرة : عودة ملء إبرة سحب شعري مع ما يقرب من 1 ميكروليتر DNA الحل وأدخله حامل إبرة جهاز الحقن (نستخدم Picospritzer). باستخدام الملقط غرامة ، وكسر بلاغ الإبرة بحيث افتتاح القمة هو ما يقرب من 10 ملم في القطر. قياس قطرها الحبرية في الزيوت المعدنية مع ميكرومتر العين. ضبط ضغط مدة الإعداد للحصول على قطرات من حجم NL ما يقرب من 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 جمع خلايا الأجنة في مرحلة المتوسطة الجنين E3 (كلوريد الصوديوم 5mm ، و 0.17mM بوكل ، 0.33mM CaCl 2 ، 4 * 0.33mM MgSO 7H 2 O ، ودرجة الحموضة 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حوالي 30-60 الأجنة إلى الشريحة الحقن ووضع الأجنة في الزاوية الزاوية اليمنى تشكلت بين أعلى وأسفل الشرائح. إزالة معظم E3 بحيث يتم عقد أجنة إلى الشريحة من التوتر السطحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام دبوس عازمة تشريح لتدوير الأجنة حتى الخلية هو ضد الجدار من الشريحة الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام micromanipulator لتوجيه الإبرة من خلال المشيماء الجنين ، من خلال والمح الى خلية واحدة من الجنين. حقن محلول الحمض النووي NL 0،5-1 في الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة في أطباق بتري في E3 واحتضان على 28،5 درجة مئوية. إذا لزم الأمر ، يمكن تباطأت التنمية من خلال احتضان الأجنة في درجة حرارة أقل. </li></ol> 4. تصاعد الأجنة للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة chorions من الأجنة مع ملقط غرامة قبل نحو ساعة من أجنة يبلغ سن المطلوب للتصوير (حوالي 14-17 ساعة بعد الإخصاب لأغراضنا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد أجنة باستخدام خلايا المسمى باستخدام مجهر تشريح مجهزة مضان. نحن نستخدم هدفا 4X (التكبير 40X) على نطاق AZ100 نيكون بسبب مزيج من العمل لمسافات طويلة والتكبير عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الجنين في أنبوب microfuge مع ما يقرب من 50 E3 ميكرولتر تحتوي على 0.2 ٪ Tricaine مخدر (تركيز 10X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر 1 ٪ نقطة انصهار منخفضة agarose في E3 مع HEPES 10 ملم (الاحتفاظ بها في درجة مئوية 42) ، وتمييع Tricaine إلى تركيز النهائي من 0.02 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل على الفور في إسقاط الجنين في agaroseساترة من الشريحة التصوير باستخدام عدسة واسعة تحمل ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل agarose يصلب ، والموقف الجنين وبالتالي فإن المنطقة مع الخلايا المسماة تواجه باستمرار ضد ساترة القاع (أسفل ظهري للخلايا العصبية والعرف ظهراني بانخفاض عن الخلايا العصبية الحسية الشوكي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجمع غرفة التصوير : معطف جانب واحد من عصابة من البلاستيك (2 سم القطر الخارجي ، 3 مم) مع الشحوم فراغ السيليكون ويضعوا على المعدن شريحة التصوير. معطف على الجانب الآخر من الحلبة مع الشحوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرفة مع E3 تحتوي على 10 ملم وHEPES Tricaine 0.02 ٪. ختم أعلى القاعة الالصاق حتى 22 مم 2 ساترة إلى السطح العلوي مدهون من الحلبة. </li></ol> 5. 4D التصوير من السلوكيات خلية في أوليمبوس FV1000 مبائر مع IX81 المجهر وتفاصيل الحصول على الصور تعتمد على خصوصيات النظام المجهر الخاص بك. نحن هنا وصف عملية اقتناء الوقت الفاصل عن المجهر FV1000 مبائر أوليمبوس. انظر بروتوكول إن الرب السابقة لمرور الزمن اقتناء مع نظام LSM زايس مبائر 510 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان التصوير في غرفة حامل الشرائح على الساحة المجهر والتركيز على الجنين باستخدام 10X 20X أو موضوعية تحت الضوء المرسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحول إلى هدف 60X (NA من 1.2 أو أعلى) ، والتركيز على الخلية المسمى مع epifluorescence. نستخدم الغمر إما النفط (UPLSAPO 60xO NA 1.35) أو الماء الغمر (UPLSAPO 60xW NA 1.20) العدسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البرنامج FV (الإصدار 1.7c) ، انقر فوق تكرار لبدء XY المسح بواسطة أشعة الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط إعدادات اقتناء وضوابط الحصول على الصور (ليزر الإخراج ، سرعة المسح الضوئي ، HV ، واكتساب ، ويقابل المستويات) لتحسين إشارة مع الحفاظ على قوة الليزر كحد أدنى (25 ٪ أو أقل) لمنع تلف الأنسجة وتقليل photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على سلسلة Z - تعيين الحدود العليا والدنيا للض المكدس ، جنبا إلى جنب مع حجم الخطوة. تأكد من أن تعمل على رمز العمق بحيث رمز الاجتياح XY XY وقد أبرزت وZ. بدء اقتناء بالنقر على أيقونة الاجتياح XYZ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على سلسلة مرور الزمن ، تعيين الفاصل الزمني وعدد من النقاط الزمنية تحت عنوان TimeScan في اكتساب إعدادات الإطار. انقر فوق رمز الزمن في صورة نافذة التحكم اقتناء بحيث رمز الاجتياح XY وقد XY (Z) ، وأبرز تي. بدء اقتناء بالنقر على الاجتياح T XY (Z) رمز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك ، يمكن استخدام TimeController لاقامة مرور الزمن. هذه البرمجة مفيدة عند إنشاء مجموعات كبيرة من البيانات ، كما أنه لا يتجاوز تخصيص الذاكرة. تحت الأجهزة ، وفتح نافذة TimeController. إنشاء مهمة التصوير الجديدة. سوف نافذة المعلمة صورة مفتوحة. انقر على زر الحالة FV لتحديث إعدادات الاستحواذ. جعل متأكد من حفظ وحذف ويتم فحص تحت عنوان إنهاء. تعيين اسم ملف الإخراج وانقر فوق موافق لحفظ الإعدادات وأغلق النافذة. استخدام الدالة حلقة لتعيين الفاصل الزمني المطلوب ، وعدد من النقاط الزمنية. انقر فوق ابدأ وجاهزة للبدء في الاستحواذ. يمكن استخدام وقفة وظائف Z - التحول إلى إعادة تركيز حين التصوير. </li></ol> 6. ممثل النتائج الأرقام والأفلام تصور أمثلة من الخلايا العصبية الحسية والخلايا العصبية المسماة قمة مع غشاء استهداف fluorophores أو جهاز الاستشعار البيولوجي أكتين التحقيق. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 الصور متحد البؤر (Z - إسقاطات) من (ngn1 : GFP - caax) تيراغرام. حقن الجنين وراثيا مع 25 بيكوغرام ngn1 : mCherry caax - DNA. التسميات mCherry - CAAX عصبون الحمراء (A) في الخلفية مع جميع الخلايا العصبية الحسية Rohon - اللحية المسمى الخضراء (B). C) صورة مدموجة من القنوات الخضراء والحمراء على حد سواء. مقياس بار = 50 ميكرومتر. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 متحد البؤر ض التوقعات من الخلايا العصبية في الأجنة حقنوا ص 20 ~ ngn1 :. mCherry DNA - UtrCH A) Rohon - اللحية الخلايا العصبية الحسية في جنين HPF 16.5. F - أكتين إشارة قوية في مخاريط النمو (السهام) ونتوءات على طول المحاور التي شكلت حديثا. B) الخلية العصبية في جنين 20 HPF الاداء القوي F - أكتين الإشارة في مخاريط نمو محور عصبي محيطي متفرعة (السهام) ، وأضعف إشارة في وسط أكثر نضجا المحاوير (الأسهم). مقياس بار = 50 ميكرومتر.

<ol>
	<li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo.">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li><li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination:+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones.">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li></ol>

وسوف تركز الأمثل لحقن الحمض النووي تختلف تبعا لحجم وقوة بناء المروج وينبغي أن تحدد تجريبيا. ويمكن حقن الحمض النووي يؤدي إلى الكثير من الأجنة غير صحية واسعة النطاق مع موت الخلايا ، في حين أن القليل جدا سوف يؤدي إلى نسبة ضئيلة جدا من الأجنة حقن معربا عن التحوير. مستوى ال...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5040-250G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen Inc.</td>
<td>12243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15517-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Instrumentation, General Valve Division</td>
<td>051-0302-900</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos

والزرد هو النموذج المثالي للسلوك الخلية التصوير خلال التنمية في الجسم الحي. والأجنة المخصبة الزرد خارجيا ، وبالتالي يسهل الوصول إليها في جميع مراحل التنمية. علاوة على ذلك ، درجة وضوحها البصرية يسمح ارتفاع القرار التصوير من الخلايا والديناميات الجزيئية في البيئة الطبيعية للجنين سليمة. نحن باستخدام نهج التصوير العيش لتحليل سلوك الخلية العصبية خلال قمة الهجرة الخليوي ، وثمرة لتوجيهات ومحاور الخلايا العصبية. يعيش التصوير مفيد بشكل خاص لفهم الآليات التي تنظم عمليات حركية الخلية. لتصور تفاصيل خلية حركية ، مثل النشاط تبارزي والديناميات الجزيئية ، فإنه من المفيد تسمية الخلايا الفردية. في الزرد ، البلازميد حقن الحمض النووي تعطي التعبير الفسيفساء عابرة نمط ويقدم فوائد متميزة عن غيرها من أساليب وسم الخلية. على سبيل المثال ، خطوط المعدلة وراثيا في كثير من الأحيان تسمية السكان الخلية بأكملها ، وبالتالي قد تحجب رؤية من نتوءات غرامة (أو تغييرات في توزيع الجزيئية) في خلية واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، حقن الحمض النووي في مرحلة واحدة الخلية هو أقل الغازية وأكثر دقة من حقن صبغة في مراحل لاحقة. نحن هنا تصف طريقة لوضع العلامات الفردية الخلايا العصبية أو خلايا النامية قمة العصبية والتصوير سلوكهم في الجسم الحي. نحن حقن الحمض النووي بلازميد في خلايا أجنة 1 المرحلة ، والذي ينتج التعبير التحوير الفسيفساء. ناقلات تحتوي على خلايا معينة المروجين هذا التعبير محرك الجين من الاهتمام في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية أو الخلايا العصبية العرف. نحن نقدم أمثلة من الخلايا المسمى مع GFP غشاء المستهدفة أو مع التحقيق الذي تجريه جهاز الاستشعار البيولوجي التي تسمح برؤية أكتين F - 1 في الخلايا الحية. ساهم إيريكا أندرسون ، Asuri نامراتا ، وماثيو كلاي على قدم المساواة في هذا العمل.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

يصف هذا البروتوكول التصوير من الخلايا العصبية الفردية أو الخلايا العصبية في قمة العيش الأجنة الزرد. ويستخدم هذا الأسلوب لدراسة سلوكيات الخلوية والتوطين أكتين باستخدام مضان مبائر الوقت الفاصل بين المجهري.

يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

live-imaging-cell-motility-actin-cytoskeleton-individual-neurons

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  University of Wisconsin-Madison. يصف هذا البروتوكول التصوير من الخلايا العصبية الفردية أو الخلايا العصبية في قمة العيش الأجنة الزرد. ويستخدم هذا الأسلوب لدراسة سلوكيات الخلوية والتوطين أكتين باستخدام مضان مبائر الوقت الفاصل بين المجهري.

Video: Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

الماوس البشرة الجذعية العصبية خلية كريست (EPI - NCSC) الثقافات

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

دراسة الهيكل الخلوي أكتين في الخلايا البطانية لايف تعرب عن GFP - أكتين

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...