עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 NS042228 ל MCH FV1000 אולימפוס confocal נרכשה עם מכשור NIH משותף מענק S10RR023717 את המחלקה לזואולוגיה באוניברסיטת וושינגטון (Bement לצרכן ביל). אריקה אנדרסן, Namrata Asuri, ומתיו קליי תרם לא פחות נייר זה.

1. האסיפה של שקופיות הזרקת ומחליק הדמיה הזרקת שקופיות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלסטומר Sylgard סיליקון בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ כדי Sylgard three זכוכית האג&quot;ח תקן שקופיות ביחד ידי הערמה שקופית אחת על גבי בצומת של שתי שקופיות אחרות, אשר מסודרים Side-by-הצד בקצוות ארוכים. השקופית העליונה יוצר פינה ישר זווית או &quot;קיר&quot; בין החלק העליון ומחליק למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו Sylgard להגדיר לילה. שקופיות אלו לשימוש חוזר. </li></ol> הדמיה שקופיות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים מלבנים נירוסטה לחתוך לגודל זהה של שקופיות מיקרוסקופ רגיל זכוכית (75mm X 25mm X 1 מ&quot;מ), כך החדר מתאים לבעל להחליק על הבמה מיקרוסקופ. חור 1.5 ס&quot;מ הוא חתך במרכז המלבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד 22 2 מ&quot;מ coverslip אל מלבן מתכת עם Sylgard. השתמש מספיק Sylgard ביסודיות החותם coverslip. כדי התמונה על מיקרוסקופ הפוכה, עוברים יהיה רכוב על coverslip זה צילמו מלמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו Sylgard להגדיר לילה. שקופיות אלו לשימוש חוזר וניקה עם אתנול 70% בין השימושים. </li></ol> 2. הכנת בונה DNA כדי להביע transgene באופן רקמות ספציפיות, הגן של עניין הוא משובטים מאחורי האמרגן תא ספציפי. אנו משתמשים אלמנט cis-הרגולציה של הגן דג הזברה neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 או את הגן sox10 (-4.9sox10) 3 לנהוג ביטוי עצב סנסורי או תאים הרכס העצבי, בהתאמה. כדי להמחיש את הדינמיקה קרום התא, אנו מביעים cytoplasmic או קרום מקומי fluorophores. כדי חלוקת התמונה F-אקטין, אנו מביעים את ה-DNA המקודד את תחום הומולוגיה calponin של utrophin התמזגו mCherry (UtrCH-mCherry). החללית UtrCH-mCherry biosensor מאפשר הדמיה של אקטין-F מבלי להפריע אקטין דינמיקה 1. אנו מייצרים אלה DNA בונה באמצעות Gateway Invitrogen רקומבינציה מבוססי אסטרטגיה שיבוט 4 ו וקטורים הניתנים Tol2kit דג הזברה 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת וקטור הביטוי (ים) באמצעות multisite-Gateway טכנולוגיה וקטורים מן Tol2kit דג הזברה 5. פלסמידים מכילים את עמוד השדרה Tol2 מ pT2KXIGDin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA פלסמיד פלסמיד עם QIAfilter Midi ערכת הכנה (QIAGEN Inc) ו elute במים סטריליים. ה-DNA לא צריך להיות לינארית להזרקה. </li></ol> 3. הזרקת בונה DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ריכוז הדנ&quot;א סופי של ה-DNA מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​10-50 באדום פנול 0.2% (עבור להדמיה במהלך ההזרקה) במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי לכייל מחט: חזרה מילוי מחט נימי משך כ 1 עם פתרון ה-DNA μl והכנס אותו לתוך מחזיק מחט של מנגנון הזרקה (אנו משתמשים Picospritzer). בעזרת מלקחיים בסדר, לשבור את קצה המחט כך הפתיחה טיפ הוא כ 10 מ&quot;מ קוטר. מדוד את הקוטר של אגל של שמן מינרלי עם מיקרומטר עינית. התאם את משך הגדרה לחץ כדי לקבל טיפה של נפח nl כ 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 1 תאים בשלב עוברי במדיום העובר E3 (NaCl 5mm, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl 2, 0.33mM MgSO 4 * 7H 2 O, ה-pH 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כ 30-60 עוברים לשקופית הזרקת עמדת עוברים בפינת זווית ישרה שנוצר בין החלק העליון שקופיות התחתונה. הסר ביותר של E3, כך עוברים מוחזקים לשקופית על ידי מתח הפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סיכה לנתח התכופפה כדי לסובב עוברים כל כך התא על הקיר של השקופית ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micromanipulator להנחות את המחט דרך סיסית את העובר, דרך החלמון לתוך תא בודד של העובר. להזריק 0.5-1 פתרון nl דנ&quot;א לתוך התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים לתוך צלחות פטרי ב-E3 ו לדגור על 28.5 ° C. אם יש צורך, פיתוח יכול להיות האטה על ידי דוגרים העוברים בטמפרטורה נמוכה יותר. </li></ol> 4. עוברים הרכבה הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את chorions מן העוברים עם מלקחיים בסדר כשעה לפני העוברים מגיעים לגיל הרצוי עבור הדמיה (כ 14-17 שעות לאחר ההפריה לענייננו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עוברים עם תאים שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ המצויד לנתח פלואורסצנטי. אנו משתמשים אובייקטיבי 4X (בהגדלה 40X) על היקף Nikon AZ100 בשל השילוב של מרחק עבודה ארוך בהגדלה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עובר לתוך צינור microfuge עם כ 50 E3 μl המכיל 0.2% Tricaine הרדמה (ריכוז 10X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl 1% נקודת התכה נמוכה agarose ב-E3 עם 10 HEPES מ&quot;מ (שמרו על 42 מעלות צלזיוס), דילול Tricaine לריכוז סופי של 0.02%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את העובר לירידה agarose לcoverslip של השקופית הדמיה בעזרת פיפטה זכוכית רחב משעמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני agarose מתקשה, מקם את העובר כל כך את האזור עם תאים שכותרתו היא פונה כלפי מטה נגד coverslip התחתון (ירידה של הגב בתאי הרכס העצבי ואת דורסולטרלי למטה עצב סנסורי השדרה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב חדר הדמיה: שכבה אחת בצד של טבעת פלסטיק (2 ס&quot;מ קוטר חיצוני, 3 מ&quot;מ) עם גריז סיליקון ואקום לצרף לשקופית הדמיה מתכת. סמל בצד השני של הטבעת עם גריז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החדר עם E3 המכיל 10 HEPES מ&quot;מ Tricaine 0.02%. חותם העליון קאמרית ידי הדבקת 2 coverslip 22 מ&quot;מ על פני השטח משומנת העליון של הטבעת. </li></ol> 5. 4D הדמיה של התנהגויות תא באולימפוס FV1000 confocal עם מיקרוסקופ IX81 פרטי הרכישה של התמונה תהיה תלויה הפרטים של מערכת מיקרוסקופ שלך. כאן אנו מתארים את התהליך זמן לשגות עבור רכישת מיקרוסקופ אולימפוס FV1000 confocal. ראה פרוטוקול יופיטר הקודם עבור רכישת זמן לשגות עם מערכת LSM Zeiss confocal 510 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא הדמיה לתוך המחזק את השקופית על הבמה מיקרוסקופ ולהתמקד העובר באמצעות 10X או 20X אובייקטיבי תחת האור המועבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מטרה 60x (NA של 1.2 ומעלה) ולהתמקד תא שכותרתו עם epifluorescence. אנו משתמשים גם טבילה שמן (UPLSAPO 60xO NA 1.35) או טבילה במים (UPLSAPO 60xW NA 1.20) העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב התוכנה FV (Ver 1.7c), לחץ על חזור XY להתחיל סריקה לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות הרכישה רכישת התמונה שולטת (פלט לייזר, מהירות סריקה, HV, עלייה, רמות אופסט) כדי לייעל את האות, תוך שמירה על כוח לייזר לפחות (25% או נמוך יותר) כדי למנוע נזק לרקמות ולהפחית photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכוש Z-series, להגדיר את הגבולות העליונים והתחתונים של מחסנית-z, יחד עם גודל צעד. ודא כי סמל עומק עוסקת כך סמל טאטא XY יש XY ו-Z מודגשות. התחל רכישת ידי לחיצה על סמל טאטא XYZ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכוש סדרה זמן לשגות, להגדיר את מרווח הזמן מספר נקודות זמן תחת הכותרת TimeScan בחלון רכישת הגדרות. לחץ על אייקון שעה חלון רכישת תמונה בקרת כך סמל טאטא XY יש XY (Z) ו-T מודגשות. התחל הרכישה על ידי לחיצה על (Z) XY סמל טאטא טי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, TimeController ניתן להשתמש כדי להגדיר זמן לשגות. תכנות זו שימושית בעת יצירת ערכות נתונים גדולות, כפי שהוא, אינו עולה על הקצאת זיכרון. תחת התקן, לפתוח חלון TimeController. יצירת משימה דימות חדשה. חלון פרמטר התמונה יפתח. לחץ על לחצן מצב FV לעדכן הגדרות הרכישה. ודא שמור מחק נבדקים תחת הכותרת לסיים. הגדר שם של קובץ פלט ולחץ על אישור כדי לשמור את ההגדרות ולסגור את החלון. השתמש בפונקציה לולאה כדי להגדיר את מרווח הזמן הרצוי מספר נקודות זמן. לחץ על התחל מוכן להתחיל הרכישה. Pause ו-Z-Shift פונקציות ניתן להשתמש להתרכז בזמן הדמיה. </li></ol> 6. נציג תוצאות הדמויות וסרטים מתארים דוגמאות של עצב סנסורי ותאי הרכס העצבי שכותרתו עם קרום במיקוד fluorophores או בדיקה biosensor אקטין. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 תמונות Confocal (z-תחזיות) של (ngn1: GFP-caax) Tg. העובר מהונדס הזריקו 25 pg ngn1: mCherry caax-DNA. MCherry-CAAX תוויות נוירון אחד אדום (א &#39;) ברקע עם כל Rohon-בירד עצב סנסורי שכותרתו ירוק (B). C) תמונה ממוזגים של שני הערוצים ירוק ואדום. בר סולם = 50 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2 Confocal Z-התחזיות של נוירונים עוברים הזריקו ~ 20 pg ngn1:.. MCherry UtrCH-DNA) Rohon-בירד נוירון חושי בעובר 16.5 hpf. F-אקטין האות חזק קונוסים צמיחה (ראשי חץ) והן בליטות לאורך אקסונים החדש שנוצר. B) Neuron בעובר 20 hpf מראה איתות חזק F-אקטין בחרוטים הצמיחה של האקסון היקפי קנים (ראשי חץ) ואת האות חלש במרכז בוגר יותר אקסונים (חיצים). בר סולם = 50 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo.">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li><li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination:+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones.">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li></ol>

הריכוז האופטימלי של ה-DNA מוזרק ישתנה בהתאם לגודל וכוח של האמרגן לבנות יש לקבוע באופן אמפירי. הזרקה של ה-DNA יותר מדי יכול להוביל עוברים בריאים עם מוות של תאים נרחב, בעוד מעט מדי תגרום חלק קטן מאוד של עוברים מוזרק המבטא את transgene. רמת ביטוי ה-DNA בקורלציה עם חוזק האות fluorophore, א...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5040-250G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen Inc.</td>
<td>12243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15517-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Instrumentation, General Valve Division</td>
<td>051-0302-900</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos

דג הזברה הוא מודל אידיאלי עבור תא התנהגויות הדמיה במהלך פיתוח in vivo. עוברי דג הזברה הם מופרית חיצונית ולכן נגיש בכל שלבי הפיתוח. יתר על כן, בהירות אופטית שלהם מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים של דינאמיקה מולקולארית בסביבה הטבעית של העובר ללא פגע. אנחנו משתמשים בגישה הדמיה לחיות כדי לנתח את התנהגות התא במהלך נדידת תאים עצביים לפסגה ואת תולדה והכוונה של אקסונים העצבית. הדמיה חיה שימושית במיוחד להבנת המנגנונים המווסתים תהליכים תנועתיות התא. כדי להמחיש את הפרטים של תנועתיות התא, כגון פעילות ובולטות ודינמיקה מולקולרית, זה יתרון תווית תאים בודדים. בשנת דג הזברה, הזרקת פלסמיד דנ&quot;א התשואות דפוס חולף ביטוי פסיפס מציע יתרונות ברורים על פני שיטות אחרות תיוג התא. לדוגמה, קווי מהונדס לעתים קרובות התווית אוכלוסיות תאים שלמים ובכך עלול לטשטש להדמיה של בליטות קנס (או שינויים בחלוקת מולקולרית) בתא בודד. בנוסף, הזרקה של ה-DNA בשלב אחד התא הוא פחות פולשני ומדויק יותר זריקות צבע בשלבים מאוחרים יותר. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג לפתח נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי הדמיה התנהגותם in vivo. אנו מזריקים פלסמיד דנ&quot;א לתוך 1-תא הבמה עוברי, שתוצאתה ביטוי transgene פסיפס. וקטורים מכילים תאים ספציפיים היזמים כי כונן הביטוי של הגן של עניין משנה של עצב סנסורי או תאים הרכס העצבי. אנו מספקים דוגמאות של תאים שכותרתו עם GFP קרום ממוקד או עם בדיקה biosensor המאפשרת ויזואליזציה של אקטין-F בתאים חיים 1. אריקה אנדרסן, Namrata Asuri, ומתיו קליי תרם לא פחות לעבודה זו.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

live-imaging-cell-motility-actin-cytoskeleton-individual-neurons

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  University of Wisconsin-Madison. פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

Video: Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (EPI-NCSC) תרבויות

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...