이 작품은 MCH 올림푸스 FV1000 공촛점에 NS042228이 UW 동물학과 (PI 빌 베먼트)에 NIH 공유 장비 부여 S10RR023717로 인수되었다 NIH R01에 의해 지원되었다. 에리카 앤더슨, Namrata Asuri, 그리고 매튜 클레이는이 종이에 똑같이 기여.

1. 분사 슬라이드 및 이미지 슬라이드 어셈블리 사출 슬라이드 : <ol><li> 제조 업체의 지침에 따라 Sylgard의 실리콘 엘라스토머를 준비합니다. </li><li> 본드 3 개의 표준 유리 현미경을 Sylgard를 사용 긴 가장자리에 나란히 배열되어 다른 두 슬라이드의 교차로 위에 슬라이드를 스태킹하여 함께 슬라이드. 상단 슬라이드 직각 모서리 또는 상단과 하단 슬라이드 사이의 &quot;벽&quot;을 만듭니다. </li><li> Sylgard가 하룻밤 책정할 수 있습니다. 이 슬라이드는 재사용됩니다. </li></ol> 이미징 슬라이드 : <ol><li> 챔버는 현미경 스테이지에있는 슬라이드 홀더에 맞는 그래서 우리는 표준 유리 현미경 슬라이드 (75mm X 25mm X 1mm)의 같은 크기로 절단 스테인리스 사각형을 사용합니다. 1.5 cm의 구멍이 사각형의 중앙에자를 수 있습니다. </li><li> Sylgard와 금속 사각형에 부착 22mm 2 coverslip. 철저하게 coverslip을 봉인하기 위해 충분히 Sylgard 사용합니다. 거꾸로 현미경에 이미지, 배아이 coverslip에 장착되며 바닥에서 몇 군데. </li><li> Sylgard가 하룻밤 책정할 수 있습니다. 이 슬라이드는 재사용과 사용 사이에 70 % 에탄올로 세척하고 있습니다. </li></ol> 2. DNA 구조의 준비 조직에 특정한 방식으로 transgene을 표현하기 위해, 관심있는 유전자는 세포 특정 발기인 뒤에 복제됩니다. 우리는 zebrafish neurogenin1 유전자 (- 3.1ngn1)의 CIS - 규제 요소를 2 또는 감각 뉴런 또는 신경 크레스트 세포의 표현을 드라이브에 sox10 유전자 (- 4.9sox10) 3, 각각을 사용합니다. 셀 및 멤브레인 역학을 시각화하기 위해, 우리는 세포질을 명시적 또는 멤브레인 -화된 fluorophores. 이미지 F - 굴지 배포하기 위해, 우리는 mCherry (UtrCH - mCherry)에 융합 utrophin의 calponin의 상동 도메인을 인코딩 DNA를 표현한다. UtrCH - mCherry 바이오 센서 프로브는 굴지 역학 1 방해하지 않고 F - 굴지의 시각화 수 있습니다. 우리는 재조합 기반 복제 전략 4 zebrafish Tol2kit 5 제공된 벡터 Invitrogen 게이트웨이를 사용하여 이러한 DNA 구조를 생성합니다. <ol><li> zebrafish Tol2kit 5 Multisite - 게이트웨이 기술 및 벡터를 사용하여 발현 벡터 (들)을 생성합니다. Plasmids는 pT2KXIGDin에서 Tol2 백본을 포함합니다. </li><li> QIAfilter 플라스미드 미디 준비 키트 (QIAGEN 주)와 멸균 물 속에 elute와 플라스미드 DNA를 정화. DNA는 주사에 대한 선형 필요하지 않습니다. </li></ol> 3. DNA 구조의 사출 <ol><li> 물에 0.2 % 페놀 레드 (사출 중 시각화를위한)에 10-50 μg / ML DNA의 최종 농도로 DNA를 희석. </li><li> 바늘을 입력하고 보정 : 약 1 μl DNA 솔루션으로 뽑아 모세 바늘을 뒤로 - 기입하여 사출 장치의 바늘 홀더 (우리가 Picospritzer를 사용)에 그것을 삽입합니다. 좋은 포셉 사용 팁 오프닝은 직경 약 10mm입니다 같은 바늘에서 팁을 휴식. 안구 마이크로 미터와 광유의 비말의 직경을 측정합니다. 약 1 NL 볼륨의 비말을 얻으려면 압력 기간 설정을 조정합니다. </li><li> E3 배아 매체 (5mM NaCl, KCl 0.17mM, 0.33mM CaCl 2, 0.33mM MgSO 4 * 7H 2 O, 산도 7.0) 1 - 세포 단계의 배아를 수집합니다. </li><li> 사출 슬라이드와 슬라이드 상단과 하단 사이에 형성 직각 모서리에 위치 배아를 약 30-60 배아를 전송합니다. 배아가 표면 장력에 의해 슬라이드 개최되도록 E3의 대부분을 제거합니다. </li><li> 세포는 사출 슬라이드의 벽에되도록 배아를 회전 구부러진 해부 핀을 사용합니다. </li><li> 난황 통해 배아의 단일 세포로, 배아 chorion를 통해 바늘을 안내 micromanipulator을 사용합니다. 셀에 0.5-1 NL의 DNA 솔루션을 주사. </li><li> 28.5에서 E3와 부화에 페트리 접시에 배아를 전송 ° C. 필요한 경우, 개발은 낮은 온도에서 배아를 잠복기가 느려질 수 있습니다. </li></ol> 4. 이미징 장착 배아 <ol><li> 배아는 이미징 (우리의 목적을 위해 약 14~17시간 사후 수정)에 원하는 연령에 도달하기 전에 한 시간 정도 미세 집게로 태아의 chorions를 제거합니다. </li><li> 형광을 갖춘 해부 현미경을 사용하여 표시된 전지와 배아를 선택합니다. 우리는 때문에 긴 작동 거리와 높은 배율 자사의 조합 니콘 AZ100 범위에서 4X 목표 (40X 배율)를 사용합니다. </li><li> 약 50 μl E3가 0.2 % Tricaine 마취를 (10X 농도)이있는있는 microfuge 튜브로 배아를 놓습니다. </li><li> 0.02 %의 최종 농도 Tricaine을 diluting 10 MM의 HEPES (42 ° C에서 보관)와 E3 500 μl 1퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스를 추가합니다. </li><li> 즉시에 아가로 오스 드롭의 배아를 전송넓은 구멍 유리 피펫을 사용하여 이미지 슬라이드의 coverslip. </li><li> 아가로 오스는 견고하기 전에 표시된 전지 영역 하단 coverslip (신경 능선 세포와 척수 감각 뉴런에 다운 dorsolateral에 대한 지느러미 아래)에 대해 아래로 향하게하므로, 배아를 위치. </li><li> 이미징 챔버 조립 : 금속 이미지 슬라이드 실리콘 진공 그리스와 접사와 플라스틱 링 (2cm 외경, 높이 3mm)의 문장 한쪽 있습니다. 그리스와 반지의 반대편 코트. </li><li> E3 10 MM HEPES 및 0.02 % Tricaine을 포함하는으로 챔버를 입력합니다. 반지의 상단 표면에 기름칠 22mm 2 coverslip을 affixing하여 챔버 상단을 밀봉합니다. </li></ol> 5. IX81 현미경 올림푸스 FV1000 공촛점에서 세포 행동의 4D 영상 이미지 수집의 세부 사항은 현미경 시스템의 세부 사항에 따라 달라집니다. 여기서 우리는 올림푸스 FV1000 공촛점 현미경을위한 시간 저속 수집 프로세스를 설명합니다. 자이스 혈구 LSM 510 공촛점 시스템을 6 시간 저속 취득 이전 조브 프로토콜을 참조하십시오. <ol><li> 현미경 단계에있는 슬라이드 홀더에 이미징 챔버를 삽입하여 전송되는 빛을 아래 10X 20X 또는 목표를 사용하여 배 (胚)에 중점을두고 있습니다. </li><li> 60X 목표 (1.2 이상의 NA)로 전환하고 epifluorescence으로 표시 세포에 중점을두고 있습니다. 우리도 기름 침지 (UPLSAPO 60xO NA 1.35) 또는 물 침수 세례 (UPLSAPO 60xW NA 1.20) 렌즈를 사용합니다. </li><li> FV 소프트웨어 (버전 1.7c)에서 레이저 스캐닝을 시작하기 위해 XY 반복을 클릭합니다. </li><li> 조직의 손상을 방지하고 photobleaching 줄이기 위해 최소 (25 % 이하)에서 레이저 파워를 유지하면서 신호를 최적화하기 위해 수집 설정 및 이미지 수집 제어 (레이저 출력, 스캔 속도, HV, 이득 및 오프셋 레벨) 조정합니다. </li><li> Z - 시리즈를 얻기위한 단계의 크기와 함께, Z - 스택의 상단과 하단 한계를 설정합니다. 깊이 아이콘 XY 스위프 아이콘이 XY 및 Z 강조를 가지고 있으므로 종사 있는지 확인하십시오. XYZ 스위프 아이콘을 클릭하여 인수를 시작합니다. </li><li> 시간 경과 시리즈를 취득하려면 TimeScan 인수 설정 윈도우에서 제목 아래 시간 지점의 시간 간격과 번호를 설정합니다. XY 스위프 아이콘이 XY (Z)와 T 강조를 가지고 있도록 이미지 수집 제어 창에서 시간 아이콘을 클릭하십시오. XY (Z) T 스위프 아이콘을 클릭하여 인수를 시작합니다. </li><li> 또는 TimeController는 시간 경과를 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 대용량 데이터 집합을 생성할 때 메모리 할당을 초과하지 않으므로이 프로그램은 유용합니다. 장치에서 TimeController 창을 엽니다. 새로운 이미징 작업을 만듭니다. 이미지 매개 변수 창이 열립니다. 수집 설정을 업데이 트 FV 상태 버튼을 클릭합니다. 확인 확실히 저장하고 종료 표제 아래 선택되어 삭제합니다. 출력 파일 이름을 설정하고 설정을 저장하고 창을 닫습니다. 시간이 지점의 원하는 시간 간격과 전화 번호를 설정하는 루프 기능을 사용하십시오. 준비 클릭하고 수집을 시작하려면 시작합니다. 일시 정지 및 Z - 시프트 기능을하는 동안 이미지를 집중할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 그림과 영화는 막 타겟 fluorophores 또는 굴지의 바이오 센서 프로브와 함께 표시 감각 뉴런과 신경 크레스트 세포의 예제를 묘사. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 TG (ngn1 : GFP - caax)의 공촛점 이미지 (Z - 계획안). : mCherry - caax의 DNA 25 PG ngn1을 주입 유전자 변형 배아. mCherry - CAAX 라벨 라벨이 모든 Rohon - 비어드 감각 뉴런과 배경에 한 신경 세포 빨간색 (A) 그린 (B). 녹색과 빨간색 두 채널의 C) 합병 이미지. 스케일 바 = 50 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 공촛점 Z - 계획안 ~ 20 PG ngn1 주사 태아의 뉴런의 :.. mCherry - UtrCH의 DNA 16.5 HPF의 배아에서) Rohon - 비어드 감각 신경 세포. F - 굴지의 신호는 성장 콘 (화살촉)와 새로 형성된 axons 따라 라고나할까요에서 강해. B) 20 HPF의 배아에서 신경 세포가 브랜츠드 주변 축삭 (화살촉)와 좀 더 성숙 해 중앙에서 약한 신호의 성장 원뿔의 강력한 F - 굴지의 신호를 보여주는 axons (화살표). 스케일 바 = 50 μm의.

<ol>
	<li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo.">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li><li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination:+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones.">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li></ol>

주입된 DNA의 최적 농도는 구조 경험적으로 결정되어야하는 모터의 크기와 강도에 따라 달라집니다. 너무 작은 transgene 표현을 주입 배아의 아주 극소수의 결과되지만 너무 DNA의 사출은 광범위한 세포 죽음으로 건강하지 못한 배아 발생할 수 있습니다. DNA 표현 수준은 세포에서 세포로 다릅니다 형광단 신호의 강도와 연결합니다. epifluorescence 아래의 배아를 정렬하지만, 표현의 매우 높은 수준들을...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5040-250G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen Inc.</td>
<td>12243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15517-014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Instrumentation, General Valve Division</td>
<td>051-0302-900</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos

zebrafish는 생체내 개발 중에 이미징 세포 행동에 대한 이상적인 모델입니다. Zebrafish의 배아는 외부 수정된 개발의 모든 단계에 따라서 쉽게 액세스할 수 있습니다. 또한, 그들의 광학 선명도는 그대로 배아의 자연 환경에서 세포와 분자 역학의 고해상도 이미징 수 있습니다. 우리는 신경 능선 세포의 연결을 마이 그 레이션 및 axons의 파생물 및지도하는 동안 세포 행동을 분석하는 라이브 이미징 방법을 사용하고 있습니다. 라이브 영상은 세포 운동성 프로세스를 조절 메커니즘을 이해하는 데 특히 유용합니다. 등 밀어내는 활동 및 분자 역학과 같은 세포 운동성 대한 자세한 내용을 시각화하기 위해서는 각각의 세포를 레이블에 유리합니다. zebrafish에서 플라스미드 DNA의 주입은 일시적 모자이크 표현 패턴을 산출 및 기타 셀 라벨 방법을 통해 독특한 혜택을 제공합니다. 예를 들어, 유전자 변형 라인은 종종 전체 세포 인구를 분류하고 있으므로 하나의 세포에서 미세 라고나할까요 (또는 분자 분포의 변화)의 시각화을 정확히 파악하기 어렵습니다. 또한, 한 세포 단계에서 DNA의 주입은 적게 침략 이후 단계에서 염료를 주사보다 더 정확합니다. 여기는 개별 개발 뉴런 또는 신경 크레스트 세포 및 이미징 생체내 그들의 행동을 라벨에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 모자이크 transgene 발현 결과 1 - 세포 단계의 배아로 플라스미드 DNA를 주입. 벡터는 세포 특정 발기인을 포함 감각 뉴런 또는 신경 크레스트 세포의 일부에 대한 관심의 유전자의 드라이브 표현. 우리는 막 대상 GFP 또는 셀에 1을 생활에서 F - 굴지의 시각화을 허용하는 바이오 센서 프로브와 함께 레이블 세포의 예제를 제공합니다. 에리카 앤더슨, Namrata Asuri, 그리고 매튜 클레이이 작품에 동등하게 공헌했습니다.

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Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

live-imaging-cell-motility-actin-cytoskeleton-individual-neurons

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K 조회수.  University of Wisconsin-Madison. 이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

비디오: Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

마우스 표피 신경 크레스트 줄기 세포 (에피 NCSC) 문화

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

연구

생물학

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포 굴지의 Cytoskeleton 연구

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

라이브 셀의 단백질 응집체의 4D 영상

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...