この作品は、ウェルチ財団（I - 1657）とNIH（RO1EY18884）からの補助金によって支えられている。 PRHは、生物医学研究のユージンマクダーモットの学者である。

1。はじめこのビデオでは、我々は視細胞を中心としたライブイメージングと免疫組織化学のためにショウジョウバエの脳と網膜を準備する方法を説明します。最初に、我々は、脳の解剖のために準備する方法を示します。次に、我々はライブの準備のための基礎を形成する一般的な免疫組織化学に使用される2つの基本的な解剖のデモンストレーションを行います。これら二つの製剤は、成人の脳と眼の解剖です。次に、我々は、光受容体のライブイメージングのためのその使用法を重視した大人と脳の発達のライブイメージングに使用される解剖のデモンストレーションを行います。最後に、我々はどのようにイメージを生きている組織を説明し、共振共焦点顕微鏡を用いたライブイメージングのいくつかの例が表示されます。 2。解剖の準備<ol><li>良い解剖では、シャープなピンセットが必要です。両端が細かい点で交わるまで研ぎブロックまたは非常に細かいサンドペーパー（&gt; 1500）を使用して、軽く両側に前後に鉗子を渡します。我々は標準的な研ぎ石を使用してください。ここでは、シャープの技術をカバーし、しかし鋭い鉗子は、ライブ解剖のために不可欠であることに注意してくださいれません。我々はすべての解剖前にピンセットを研ぐ。 </li><li>成人の脳の解剖のために、それらを麻酔し、目的の遺伝子型を整理してCO 2のパッドの上にハエを置きます。蛹のケースを壊すように注意しながら、蛹の解剖のために、単純にバイアルに到達し、慎重にピンセットで蛹を削除します。 </li><li>水とキムワイプを湿らせ。あなたの鉗子からごみを削除するには、解剖時にこれを使用します。ステレオスコープのステージ上で解剖皿を置き、HL3溶液1で塗りつぶす。すべての解剖は、組織は、解剖の手順の間に生きていると健康なままであることを保証するためにHL3で行われます。また、我々は解剖時に鉗子を保護するためにSylgardのカバー底部を持っている解剖皿を使用してください。 </li><li>今、あなたが免疫組織化学を実行する予定がある場合は解決策を修正する準備。 500μLマイクロチューブにHL3の180μL場所。 3.7％ホルムアルデヒド溶液を得るために37％ホルムアルデヒドの20μLを追加。 </li><li>最後に、適切な手の位置は、良好な解剖のために重要です。良い手の位置で、あなたの鉗子は、着実かつ制御、微妙な動きが可能になります。最初に、親指の側に鉗子を置きます。その後、指の先端が上にかかっているようなまっすぐ下に人差し指をもたらす。今すぐあなたの中指の側面に鉗子の側面を休み、解剖皿に移動する。親指と中指で料理との物理的な接触を行う。皿に親指と中指を休んでいる間、顕微鏡ステージ上に手首を植える。この方法では、解剖時に表面にしっかりと三点を植え、それは、鉗子の非常に微妙な操作を行うことが可能になりました。このテクニックは、最初は少し抵抗を感じるかもしれないが、練習すれば、すぐに脳の解剖のマスターになります。 </li></ol> 3。成人脳<ol><li> CO 2パッドの上に、向きを大人は離れてあなたの手から頭と腹側を上に飛ぶ。ちょうど頭下胸部をつかむ。適切に行われれば、脚と口吻が長くなります。ステレオスコープの下に表示している状態で、頭を削除するには、鉗子で拡張口吻をつかむ。ボディと水没頭を捨てる。水中ヘッドに再び焦点を合わせる。全体の解剖は、ソリューションの下に実行されます。これは、常時鉗子で頭の上に保持するために非常に重要です。そうでなければ、頭が浮くと取得することは難しいでしょう。頭が解剖中にフォーカスの外に移動した場合、単に顕微鏡を調整することなく焦点面に戻すに移動します。この一見単純な作業では、最初は難しいかもしれませんが、焦点にあなたの頭を維持することは時間をかけて容易になるだろう。 </li><li>第一口先と眼の間に結合組織を引き裂くことによって解剖を始める。常に少なくとも一つの鉗子でしっかりと保持している間に目で涙。脳の下の損傷を防ぐために、鉗子のつま先は、網膜やキューティクルの直下のみであるかどうかを確認。左右交互に、頭の後ろに向かって作業し、網膜を離れて引き裂くために、ピンセットを使用してください。網膜を離れて引き裂くことはラミナがこの解剖を通して視葉にアタッチしたままになっている可能性が増加します。途中でキューティクルを引き裂く、頭部の背部のまわり続ける。他の目で涙、キューティクルを引き離し始める。あなたがキューティクルをつかんでている限り、あなたは脳を粉砕されていない知っているように！これを念頭に、脳が明らかにされるまでは離れてキューティクルと網膜を引っ張っていきます。 </li><li>脳が表示されていれば、あなたは、脳（図1A）に接続された気管を削除するために始めることができます。脳が特定されるまで気管とキューティクルにプルし続ける。この時点で、tのお皿の底に再び焦点を合わせる必要彼の残りの手順。あなたの脳がそうでなければ一晩抗​​体の洗​​浄中に浮かぶことがあるため、残りの気管を外します。光受容体端末のイメージングのための、それは板を保持することが望ましいですが、細胞体と強く自家蛍光顔料が含まれている網膜を、削除する必要があります。これを行うには、慎重に粘膜を損傷することなく、ふさふさと色素細胞の残骸で引っ張る。これは、細かいスキルであり、訓練が必要です。 </li><li>成人の脳は、我々は第6節で議論する条件を使用して数時間あるいは数日を保つ事が可能である。免疫組織化学のために、成人の脳は現在、ホルムアルデヒドで固定する準備が整いました。2は、すでに準備作業を行った固定液に成人の脳を移動するために5μLに設定P20 pipettemanを使用してください。 40から10の頭脳をもたらすすべき、20分間大人の脳を解剖し続ける。さらに40分の修正で脳を残す、しかし、この期間は最適な一次抗体染色によって異なる場合があります。ホルムアルデヒド溶液を除去し、以下、PBS -トリトンと呼ばれるPBS、0.4％TritonX - 100を含む溶液の400μLで各5分間3回脳を洗う。完全に修正液を洗浄した後、一次抗体溶液を追加することがあります。 </li></ol> 4。成人の目<ol><li>成人の脳で説明したようにこの解剖を始める。頭部を沈めると顕微鏡をリフォーカスした後、吻と眼の間に結合組織を引き裂くことから始めます。口先の上に、目からキューティクルを分離。今、頭の後ろに向かって作業し、目の裏側から表皮を分離。 one鉗子で、頭の後ろの中心をつかむ。他に、目をつかんで引っ張る。眼が（図1B）皿の底に沈降することができます。ラミナは、おそらくまだ目に添付され、この時点で完全に無傷の光受容細胞の端子のライブイメージングに使用することができます。光受容体の細胞体のライブイメージングを続行するには、セクション4.5に進んでください。次の3つのセクションでは、固定された目の免疫組織化学を説明する。 </li><li>免疫組織化学のために、5μLに設定P20 pipettemanを使用してソリューションを固定するために目を移動する。 10分の合計のために大人の目を解剖し続ける。さらに30分の修正で目にしておきます。修正液と、成体の脳の解剖で説明されている行為の洗浄を削除します。 </li><li>あなたが最終的に画像に目のommatidial構造を希望される場合ラミナが削除されている必要があります。あなたの解剖皿に固定された目を戻すと、まだ接続されているすべての気管や脂肪細胞を取り除く。次に、一方の鉗子と眼の外側を押しながら、他で板を取り外します。それはcellbodies下（図1B）を公開し、一体で外れるはず。唯一の薄板をつかむように注意してください！そうしないと、網膜から視細胞を切り離し危険性があります。 </li><li> P20のpipettemanを使用して、500uLチューブに400uL PBS -トリトンに目を移動する。静かに光受容体からの自家蛍光赤色色素を除去するために一晩4℃で、それらを揺すり。次の日、あなたは、洗浄溶液を破棄し、一次抗体溶液を追加することがあります。 </li><li>大人の目のライブイメージングのために我々は唯一のpharate大人のハエを使用して、間もなく羽化する前に後期のサナギ、すなわち。この段階では、解剖時の葉身の端末から別の光受容体の細胞体。 </li><li> Pharate大人蛹は蛹のケースを通して見える明確に定義された翼、目、そしてキューティクルを持っている。蛹を選択して、頭部を露出させる蛹の例前方部分を削除してください。慎重に、さらに発展フライを囲む薄い内膜を取り除く。あなたの鉗子とプルの頭のベースをつかむ。頭が水中に保ちながら蛹の残りを捨てる。 </li><li>免疫組織化学のための目の解剖で示すように進んでください。 pharate大人の段階では、しかし、光受容体の細胞体では、画像の網膜に囲まれた細胞体をできるように、薄板からより容易に分離させます。また、ラミナでは、画像の遠位薄板をできるように、視葉に接続されたままになります。あなたがイメージする光受容体端末のカートリッジを見ることができる近位ラミナを、ご希望の場合は、葉身はもっと強く眼に添付されている大人のその場で目の切開を行います。 </li></ol> 5。アイディスク脳の複合体を開発<ol><li>比較的大きな開発細胞のこの単層を容易に共焦点顕微鏡を用いて観測されているため、20パーセント蛹の開発（P +20％）で、発展途上の目のディスクは、私たちの研究室でのライブイメージングのためのお気に入りとなっている3。 </li><li> 20パーセント蛹を選択するには、マルピーギ管、蛹のケースの下に表示される緑色のスポットを探し、そして&quot;ダークボディ&quot;4を持ってそのサナギを避ける。あなたの解剖皿にHL3でP 20パーセント蛹、浸し、それを選択した後、慎重に慎重に、蛹の袋の前方部分を削除する薄い内膜を貫通しないように。あなたの鉗子と内膜をつかんで引き離す。 </li><li>慎重に（図1C）非常に顕著な発展途上の脳や目のディスクを見つけるためにリリースの内容全体を検索。アイディスク脳、複雑を簡単に変態のこの段階で分離されている。解剖皿の底に脳を隔離する。視葉から中央の脳を慎重に分離する。視葉/目のディスクは、ライブイメージングで使用されます。 </li></ol> 6。イメージングを生きる：顕微鏡で<ol><li>あなたが1つか2つしかソリューションの短期間のための画像を希望する場合は、スライドガラス上の画像あなたの組織が壊れる可能性があります。この場合、最初の塗料メーカーの指示を使用してSylgardと表面でスライドを準備。スライドの真ん中に20μLHL3を置きます。スライドにHL3のさらに20μLで切除した組織を輸送。組織は、空気にさらされることはありません必要があります。さらに、ピペットの取り扱いやソリューションの表面張力からの応力やひずみは避けなければならない。 </li><li>ライブイメージングのために、組織がしっかりと最小限の処理との接触で固定する必要があります。我々は安全に微小電極を介して適用水重合外科グルーGluShield、日常的に電気生理学5の胚の調製に用いられる手法を用いて脳の位置を決めます。電気生理学的記録のために引っ張られるようなガラス電極を取得します。先端を折りますとGluShieldが口の中で生成された負の空気圧を使用することに端を埋める。だけの十分な接着剤が入る可能性があることを電極の折ります。今HL3のドロップでSylgardに接着剤の少量を適用するために正圧を使用してください。今、すぐにライブイメージングのための望ましい方向を維持し、接着剤に組織を設定します。水浸レンズは、現在のイメージングに使用することができます。あなたが膜透過性の染料を追加する場合は、イメージングながらお風呂にそれを追加することができます。 </li><li>我々は、長時間にわたって撮影は6に減少する光退色と高速撮像を可能にする共振スキャニング共焦点顕微鏡を使用したり、完全に、または複数回ソリューションを交換するために、我々は、蠕動ポンプに接続する灌流チャンバー（ハーバードIC30共焦点イメージングチャンバー）を使用してくださいそれは徐々に生きている組織（図2A）上に培養液をperfuses。一定の液体の交換と最小限のGluShield接点の動きは時間7の長い期間にわたって観察されている組織のフラット化を減らす。発育期間のイメージングのための、目の円盤脳の複雑なが完全なままにして接着剤との最小限の接触を持つべきである必要があることに注意してください。 </li><li>それは薄くて平らなレンダリングするために剃毛されSylgardのドロップでコーティングされたカバースリップを使用してください。カバーガラスと接着剤Sylgardに生きている組織の中心に20μLHL3を分注する。泡が空気（図2B）に生きている組織を公開することなく、チャンバーを通過できるようになるガスケットを生成します。ガスケットは、組織が共焦点顕微鏡のレンズに近い組織を持って来るために十分な薄を押しつぶされることを回避するのに十分な厚さでなければなりません;我々は我々のセットアップで250μm使用。完全に常時水没組織をしないように注意して、灌流チャンバーを組み立てます。蠕動ポンプを使用して近く100μL分あたりの速度で最初に灌流を開始する。この速度は、チャンバーの高さを定義するガスケットの厚さに応じてかなり高速です。時間のスケールのイメージングでは、20 - ヒドロキシおよび抗生物質が、抗真菌ではないを追加し、毎分10μlを約はるかに低い速度で灌流を行う必要がある場合があります。灌流チャンバーを供給する培地中に最終的に、我々はバブルの酸素。 </li></ol> 7。代表的な結果： 私たちのビデオプロトコルの最後に5節で紹介した準備を用いて開発する視細胞のライブイメージングのための例を示します。この調製は、細胞特異的に蛍光レポーターを表現するためにショウジョウバエ遺伝子組み換えを利用しています。膜タグ付きmyrRFPとエンドソームのマーカー2xFYVE - GFP 9に示した例では、2つの蛍光レポーターは、光受容体特異的なGMR - Gal4のドライバ8の制御下で発現されています。 70x70x17.5μmと137x137x700nm（512x512x26）のボクセルサイズのバウンディングボックスを持つ2チャンネルの3Dデータセットごとに1分を得た。映画は、細胞内エンドソーム輸送や小胞融合のイベントのダイナミクスを明らかにこの4Dのデータセットの時間をかけて選択した面を示しています。目や粘膜の固定組織の準備のための代表画像を図に示します。 3。

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Drosophila+sec15+reveal+a+function+in+neuronal+targeting+for+a+subset+of+exocyst+components.">Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components.</a> Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).</li></ol>

イメージングのために使用する蛍光プローブここでは、3つのクラスからの蛍光プローブの選択のためのショウジョウバエの視覚システムの準備の長所と短所を説明します。外因性に生きている組織の準備に追加される（1）プローブ、遺伝的にライブとの両方でエンコードされている（2）蛍光タンパク質固定イメージング、免疫組織化学のための固定された組織に追加される（3）蛍光色素。 1。外因性のプローブ： LysotrackerグリーンDND - 26またはDND - 99レッド （インビトロジェン社）これらは、蛍光膜透過性の最も顕著に細胞、リソソームに強く酸性化のコンパートメントに蓄積する化合物、後期エンドソーム、およびオートファゴソーム市販されている。ナノモル濃度でLysotrackerは（我々は典型的には50 nmを使用して）1分以内に完全にL3とP +20％目のディスクを貫通している。 Lysotrackerは、継続的に蓄積し、5分未満でアルカリ化効果が、我々のイメージを発揮するので。目のディスクとは対照的に、Lysotrackerは組織を中断することなく、脳に浸透していません。しかし、外膜の涙慎重には、視葉内の少数の細胞の直径の浸透が可能になります。 Lysotrackerとは対照的にLysosensor DND - 189（インビトロジェン社）、Lysosensorは酸性コンパートメントに蓄積していませんが、展示物は酸性pHでの蛍光の増加。 LysosensorはLysotrackerと非常に似ている浸透特性があります。我々は、1μMの濃度でLysosensorを使用してください。 2。遺伝的に符号化されたプローブ： 多くのライブイメージング実験のために、我々はバイナリGal4/UAS発現システム12の制御下にGFP、TagRFP 10またはpH感受性pHluorin 11など、様々な蛍光分子でタグ付けされた遺伝子を発現する。光受容体の開発に表現するGAL4 -ラインはGMR - Gal4の（すべての光受容体）8とmDelta0.5 - Gal4の（R4とR7を開発する）13が含まれています。いくつかの亜型特異的なGAL4 -ドライバの行は、その使用、異なるロドプシンのプロモーター14が存在する。ライブイメージングで特に有用な蛍光プローブがphotoconvertible蛋白質である。我々は成功Dendra2、単量体、緑色から赤色photoconvertable蛋白質15を使用している。 Dendra2が488nmのアルゴンレーザーのラインを使用してphotoconvertibleなるように設計されていることに注意してください。しかし、我々は、従来のまたは共振どちら走査型共焦点モードで私たちのセットアップを使用して可視青色光を使用して変換を達成することはできません。対照的に、405nmのUVレーザとの変換が効率的です。 3。免疫組織化学： 固定成人の目には、私たちはしばしばrhabdomeric構造（図1A）を可視化するローダミンファロイジン（インビトロジェン社）または抗Chaoptin（光受容体特異的な抗体16）のいずれかを選択します。ラミナカートリッジの構造を分析するための良い方法は、抗chaoptin 16、グリアマーカー抗黒檀17、および抗SEC6 18（図1B）に結合することです。図に示す。 3、抗体のこの組み合わせは、大きなシナプス（chaoptin）とシナプス後部（SEC6）のプロセスだけでなく、薄板19の上皮グリア（黒檀）を区別する。 灌流チャンバーの組み立てライブイメージングのために、我々は、組織の準備を妨げることなく、ソリューションの遅い交換を可能にする灌流チャンバーを採用。灌流チャンバアセンブリのデモは、ビデオに含まれており、模式的に図2に示します。灌流チャンバーの組立は、図5に示す。 2A。第一標本上のガスケットを敷設することから始めます、と示すように、アセンブリに進んでください。ガスケットの目的は、チャンバーの底と蓋、組織がシールされており、これによってソリューションが流れるの内部空間との間のスペースを作成することです。ガスケットの内側のスペースは、入口（解決策がここに入る）、組織の準備、およびソリューションは、チャンバを離れるに経由するコンセントを含める必要があります。ガスケットの2つの機能が重要です：まず、ガスケットはまだ高解像度レンズと撮像を可能にするのに十分に薄い脳のための十分な厚さでなければなりません。理想的なガスケットの厚さは、セットアップ固有のパラメータに依存します。第二に、ガスケットの切り込みが、バブルが試料（図2B）に問い合わせることなく通過できるようにするコンパートメントを提供します。 顕微鏡でのイメージング我々は、直接スライド上の培養液中に灌流チャンバーまたは63xの水浸レンズ用63x（絞り1.3）グリセリン浸レンズを使用してください。グリセリンレンズは、油のレンズよりも多くの作動距離を提供します。我々は、従来のスキャナ（8000 Hzの対1400 Hzの、それぞれ）よりもはるかに速い速度でスキャン共鳴走査共焦点顕微鏡を使用してください。共鳴スキャンは高速で時間をかけて3次元記録を可能に二のフレームレート。さらに、より高速なスキャン速度が大幅に生きている組織の繰り返しスキャンするための主要な関心事であるレーザー光毒性6を減少させる。レーザー強度とPMT電圧（ゲイン）のバランスはノイズを最小限にし、退色しながら信号を最大にするために達成されなければならない。重要な今後の検討は、特定の地域でのレーザーの影響の量は解像度とズームによって決定されることである。例えば、選択の領域は512 × 512、ズーム1倍時のような256 × 256、ズーム2倍で同じ解像度でスキャンされ、まだ最大限に可能な限りのライブイメージング速度は、256 × 256でズーム2倍4倍高速です。 8000 Hzと2倍の行の平均のスキャン速度で10秒ごとにZ -スタックの速度でZ -スタックあたり5コマ：迅速に細胞内区画の移動の操作を記録するために、我々が正常に以下の設定で記録されている。時間のスケールで長いイメージングセッションでは、我々は多くの場合数分ごとに1つにフレームレートを削減し、準備がシフトする可能性が高いとして、より大きな領域を選択してください。 ショウジョウバエ視覚系の解剖学図3は、 ショウジョウバエの成体の眼（図3A）、成人の脳（図3B）、および20〜25％蛹のアイディスク/脳の複雑な（図3C）の解剖学的構造を示しています。図3Aは、とや粘膜と接続されている脂肪細胞なしの両方大人の目を示しています。大人の目の解剖時には、光受容体の細胞体（左）によって形成されたボールに囲まれたアイの中央にある板は、、（右）の下に細胞体を中断せずに削除する必要があります。成人の脳の解剖のために、人は光受容体の細胞体、板、視葉、中央の脳、および気管（図3B）を区別することができるはずです。視葉に添付されたラミナを残しながら、光受容体と気管は、この解剖のために削除する必要があります。 20から25パーセント蛹のアイディスク/脳、複雑なの同定に役立つように、ライブイメージは、図3Cに示されている。 <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="図1" /> 図1（A）成体の脳。 （B）大人の目。 （C）20％-25％蛹eye-disc/brain複合体。 <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="図2" /> 図2（A）潅流チャンバーの組立と試験片の相対的な（B）ガスケットの位置決め。 <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="図3" /> 図3（）抗chaoptin使用して大人感桿分体染色。抗chaoptin（緑、光受容体）、抗黒檀（赤、グリア）、およびSEC6（青、介在ニューロン）を使用して、（B）アダルトラミナ染色。

特別な機器： <ol><li>解剖の範囲：デジタルカメラでライカMz12.5 </li><li>従来と共振スキャンのためのライカTCS SP5共焦点タンデムスキャナ顕微鏡は、住んでいる 青色（488nmの）、緑（561nm）、橙（594nm）と遠赤色（633nm）レーザーだけでなく、特殊な63x、1.4グリセリンと63x、1.3水浸レンズを含むイメージング顕微鏡、。 </li><li>ハーバードインスツルメンツ共焦点イメージングチャンバーRC - 30と蠕動ポンプのモデル720 </li><li>サターピペットプラーP - 97 </li><li>ソフトウェア：アミラ5.2、ヴィサージのイメージング</li></ol>

preparation of developing and adult drosophila brains and retinae for live imaging

市販<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;脳と視覚系が広くニューロンの発達、機能と変性を研究するモデルシステムを利用している。ここでは、3つの脳の準備と開発蛹の開発アイディスク、脳の複雑なから大人のハエから個々の眼と脳の解剖の範囲をカバーする視覚システムを示す。すべてのプロトコルは準備のライブ文化のために最適化されています。しかし、我々はまた、該当する固定組織の免疫組織化学のための条件を提示する。最後に、我々は、灌流チャンバ内に、従来と共振4D共焦点ライブイメージングを使用して、これらの製剤のためのライブイメージングの条件を示しています。一緒に、これらのプロトコルは、分の規模で機能的な細胞内アッセイから何時間もの規模で発達や変性過程に至るまで、さまざまな時間スケールでのライブイメージングの基礎を提供する。

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Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

このプロトコルは、次の3つについて説明します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;準備：目のディスク脳の複合体の解離を開発し1）成人の脳の解剖、2）成人の網膜の解剖、3）。すべての準備が固定組織の免疫組織化学のために使用することができますが重点は、特殊な調製技術とライブイメージングのための条件に置かれている。

開発と大人の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>脳と網膜

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

preparation-developing-adult-drosophila-brains-retinae-for-live

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

35.2K ビュー.  University of Texas Southwestern Medical Center. このプロトコルは、次の3つについて説明しますショウジョウバエ準備：目のディスク脳の複合体の解離を開発し1）成人の脳の解剖、2）成人の網膜の解剖、3）。すべての準備が固定組織の免疫組織化学のために使用することができますが重点は、特殊な調製技術とライブイメージングのための条件に置かれている。

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Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

生物学

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

の調製ショウジョウバエ</emハンギングドロッププロトコルを使用してライブイメージングのための>胚

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

大人の準備ショウジョウバエ</emシンセクショニングおよび顕微鏡分析のための>アイズ

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

個々の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>エッグチェンバース

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

モザイク大人のライブイメージングのためのトマト/ GFP-FLP / FRT方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;視細胞

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

開発と大人の準備ショウジョウバエ脳と網膜