Bu çalışma Welch Vakfı (I-1657) ve NIH (RO1EY18884) hibe ile desteklendi. PRH Biyomedikal Araştırma Eugene McDermott Scholar.

1. Giriş Bu video, fotoreseptör hücrelerinin odaklanmak canlı görüntüleme ve immünohistokimya Drosophila beyinleri ve retinae nasıl hazırlanacağını gösterecektir. İlk olarak, beyin diseksiyonlarının nasıl hazırlanacağını gösterecek. Sonra, canlı hazırlıkları için temelini oluşturan immünohistokimya için yaygın olarak kullanılan iki temel diseksiyonları gösterecektir. Bu iki hazırlıkları yetişkin beyin ve göz diseksiyonları. Sonra, fotoreseptör canlı görüntüleme için kullanımı üzerinde durularak yetişkin ve gelişmekte olan beyin canlı görüntüleme için kullanılan diseksiyonları gösterecektir . Son olarak, nasıl görüntü canlı doku tanımlamak ve rezonans konfokal mikroskopi kullanılarak canlı görüntüleme bazı örnekler göstermek. 2. Diseksiyon hazırlık <ol><li> Iyi diseksiyonları için, keskin forseps gerekir. Uçları ince bir noktada buluşuyor kadar keskinleştirme bir blok ya da çok ince bir zımpara kağıdı (1500) kullanarak, her iki yanda hafifçe ileri geri forseps geçmek. Biz standart bir bileme taşı kullanın. Biz burada bileme tekniği kapağı, ama keskin forseps canlı diseksiyonları için gerekli olduğunu unutmayın. Her diseksiyonu önce forseps keskinleştirmek. </li><li> Yetişkin bir insanın beyninin diseksiyonları için sinekler, onları uyutmak ve istenilen genotip sıralamak için CO 2 yastık koyun. Pupa diseksiyonları için, sadece şişenin içine ulaşmak ve dikkatle pupa halinde kırılması önlemek için dikkatli olmak, forseps ile bir pupa kaldırmak. </li><li> Kimwipe su ile ıslatın. Forseps gelen enkaz kaldırmak için diseksiyon sırasında bu kullanacaktır. Bir Stereoskop aşamasında bir diseksiyon çanak yerleştirin ve HL3 çözüm 1 ile doldurun. Tüm diseksiyonları doku diseksiyonu prosedürü sırasında canlı ve sağlıklı kalmasını sağlamak için HL3 yapılacaktır. Ayrıca, Sylgard diseksiyonu sırasında forseps korumak için bir alt kapsayan bir diseksiyon çanak kullanın. </li><li> Şimdi, immünohistokimya gerçekleştirmek planlıyorsanız çözüm sabitleme hazırlar. 500μL mikrosantrifüj tüpe HL3 Yeri 180μL. % 3.7 formaldehit çözüm elde etmek için% 37 formaldehit 20μL ekleyin. </li><li> Son olarak, uygun bir el pozisyonu iyi diseksiyonları için önemlidir. Iyi bir el pozisyonu sayesinde, forseps, istikrarlı ve kontrollü, ince hareketleri yeteneğine sahip olacak. İlk olarak, başparmak tarafında forseps yerleştirin. Sonra dik bir şekilde aşağıya parmak ucu üst dayanmaktadır parmağı getirmek. Şimdi orta parmak tarafında forseps tarafında dinlenme ve diseksiyon çanak taşımak. Başparmak ve orta parmak ile fiziksel temas çanak olun. Çanak başparmak ve orta parmak İstirahat ederken, mikroskop sahnede bilek bitki. Bu şekilde, üç puan diseksiyonu sırasında sıkıca yüzeyler üzerinde dikilmiş ve forseps çok ince manipülasyonlar yapmak artık mümkün. Bu teknik, ilk bakışta biraz garip hissedebilirsiniz, ama uygulama ile, kısa bir süre sonra beyin diseksiyonları bir ana olacak. </li></ol> 3. Yetişkin beyin <ol><li> CO 2 ped, şark bir yetişkin için elinizi uzak kafa ile ventral tarafta sinek . Toraks başının hemen altında tut. Eğer doğru yapılırsa, bacak ve burnumun uzatacaktır. Stereoskop altında izlerken, baş kaldırmak için forseps ile genişletilmiş burnumun kapmak. Vücut ve baş batığın atın. Batık baş üstüne tekrar odaklayın. Tüm diseksiyon çözüm altında yapılacaktır. Bu her zaman forseps ile baş tutunmak için çok önemlidir. Aksi takdirde, baş float ve almak zor olacaktır. Baş diseksiyonu sırasında odak dışında hareket ederse, sadece mikroskop ayarlayarak odak düzlemi içine geri hareket ettirin. Bu görünürde basit bir görev ilk başta zor olabilir ama başınızı odakta tutan, zaman içinde daha kolay olacaktır. </li><li> Diseksiyonu ilk burnumun ve göz arasındaki bağ dokusu yırtarak başlayın. Her zaman en az bir forseps ile sıkıca tutarken gözünden gözyaşı. Beynin altında zarar görmesini önlemek için, retinanın veya manikür forseps ayak altında sadece olduğunu belli olun. Sağ ve sol Alternatif, başın arkasına doğru çalışan, retina gözyaşı forseps kullanabilir. Retinanın uzak Yırtılma lamina Bu diseksiyon boyunca optik lob bağlı kalmasını şansını artıracaktır. Yol boyunca manikür yırtılma, başın arkasına devam edin. Diğer göz ile yırtılma ve uzakta manikür çekerek başlayabilirsiniz. Sürece manikür kapma gibi, biliyorsunuz beyin ezici değildir! Bunu akılda tutarak, beynin ortaya kadar uzakta manikür ve retina çekmeye devam ediyor. </li><li> Beyin görünür sonra, trakea beyin (Şekil 1A) bağlı kaldırmak için başlayabilir. Trakea ve manikür beyin izole kadar çekmeye devam edin. Bu noktada, t çanak alt yönlendirmesi gerektiğinio adımları kalan. Beyin aksi bir gecede antikor yıkama sırasında yüzer çünkü kalan trakea çıkarın. Fotoreseptör terminalleri görüntüleme için, lamina korumak için arzu edilen, ancak hücre gövdeleri ve güçlü autofluorescent pigment içeren retina, kaldırmanız gerekir. Bunu yapmak için, gür ve pigmentli hücre kalıntıları lamina zarar vermeden dikkatlice çekin. Bu ince beceri ve pratik gerektirir. </li><li> Yetişkin beyin 6. bölümde tartışacağız koşulları kullanarak saatlerce hatta günlerce canlı tutulabilir. Immünohistokimya için, yetişkin beyin formaldehit artık sabit olmaya hazır. 2 5μL için ayarlanmış bir P20 pipetteman sabitleme çözümü için zaten hazırlanan yetişkin beyin taşımak için kullanın. 4-10 beyinleri verimi hangi yetişkin beyinlerini parçalayıp, 20 dakika boyunca devam edin. Ek bir 40 dakika için düzeltme beyinleri bırakın, ancak bu süre en uygun birincil antikor boyama değişebilir. Formaldehit çıkarın ve beyinleri, bundan sonra PBS PBS-Triton olarak adlandırılır ve% 0.4 TritonX-100 içeren bir çözüm 400μL her biri için 5 dakika 3 kere yıkayın. Tamamen düzeltme çözüm yıkadıktan sonra, primer antikor çözüm ekleyebilirsiniz. </li></ol> 4. Yetişkin göz <ol><li> Yetişkin beyin için açıklandığı gibi bu diseksiyon başlayın. Baş daldırarak ve mikroskop refocusing sonra, burnumun ve göz arasındaki bağ dokusu yırtarak başlar. Burnumun şeyden önce, göz manikür ayırın. Şimdi, başın arkasına doğru çalışan, alt göz manikür ayırın. Bir forseps ile, başın arka ortasında yakala. Diğer göz kapmak ve çekin. Göz (Şekil 1B) çanak alt yerleşmek için izin verin. Lamina muhtemelen hala göze bağlı olacak ve şu anda tamamen bozulmadan fotoreseptör hücrelerinin terminalleri canlı görüntüleme için kullanılabilir. Fotoreseptör hücre gövdeleri canlı görüntüleme ile devam etmek için, bölüm 4.5 &#39;e gidin. Sonraki üç bölüm, sabit göz immünohistokimya açıklar. </li><li> Immünohistokimya için 5μL için ayarlanmış bir P20 pipetteman kullanarak çözüm gidermekle göz hareket ettirin. Toplam 10 dakikalık bir yetişkin gözleri diseksiyon devam edin. Ek bir 30 dakika için düzeltme gözleri bırakın. , Yetişkin beyin diseksiyonu açıklandığı gibi düzeltme çözüm ve davranış yıkar çıkarın. </li><li> Sonuçta resme göz ommatidial yapısı isterseniz lamina artık kaldırılması gerekir. Diseksiyon çanak sabit gözler dönün ve hala bağlı olabilecek herhangi bir trakea veya yağ hücreleri çıkarmak. Sonra, bir forseps ile gözün dışında tutarak, diğer lamina çıkarın. (Şekil 1B) altındaki cellbodies açığa, tek parça olarak gelmelidir. Sadece lamina kapmak için dikkatli olun! Aksi takdirde, retinanın fotoreseptör ayrılmakta riski. </li><li> P20 pipetteman kullanarak, bir 500uL tüp içinde 400uL PBS-Triton gözleri taşımak. Fotoreseptörlerin autofluorescent kırmızı pigment hafifçe kaldırmak için gece 4 derece kaya. Ertesi gün, yıkama solüsyonu atmak ve primer antikor çözümü eklemek. </li><li> Yetişkin gözleri canlı görüntüleme için sadece pharate yetişkin sinekler, kısa bir süre eclosion önce kullanımı, geç dönem pupa yani. Bu aşamada, diseksiyon sırasında lamina terminallerinden ayrı fotoreseptör hücre gövdeleri. </li><li> Pharate yetişkin pupa iyi tanımlanmış kanat, göz, ve pupa halinde görünür manikür var. Bir pupa seçin ve baş bölgesinde ortaya çıkarmak için pupa halinde ön kısmını kaldırın. Ek olarak gelişmekte olan sinek içine ince iç zarı dikkatlice çıkarın. Forseps ve çekme ile kafa tabanı tut. Baş batık tutarken pupa geri kalanı atın. </li><li> Immünohistokimya için göz diseksiyonu gösterdiği gibi devam edin. Bununla birlikte, pharate yetişkin aşamada, fotoreseptör hücre gövdeleri görüntü retina içinde yuvalanmış hücre gövdeleri izin, lamina daha kolay ayırır. Ayrıca, lamina distal lamina görüntü sağlayan optik lob bağlı kalır. Görüntü proksimal lamina, fotoreseptör terminali kartuşları görülebilir istiyorsanız, lamina daha güçlü, gözü bağlı bir erişkin sinek göz diseksiyon. </li></ol> 5. Göz disk beyin kompleksleri geliştirilmesi <ol><li> Nispeten büyük gelişmekte olan hücreler bu tek katman konfokal mikroskobi kullanarak kolayca gözlemlenebilir, çünkü% 20 pupa gelişme (P +% 20) gelişmekte olan göz disk laboratuvarda canlı görüntüleme için bir favori haline gelmiştir. 3 </li><li> % 20 pupa seçmek için, pupa halinde altında görünen yeşil bir nokta malpighian tübüller bakmak ve &quot;karanlık bir beden&quot; 4 olduğunu pupa önlemek . P% 20 pupa, batığın diseksiyon çanak HL3 de seçtikten sonra ve dikkatli bir şekilde, dikkatli olmak, pupa çuval anterior kısmı kaldırmakince iç zarı nüfuz değil. Forseps ile iç zarı kavrayın ve ayrı çekin. </li><li> Oldukça belirgindir (Şekil 1C) gelişmekte olan beyin ve göz diskler dikkatlice bulmak için piyasaya içeriğini arama. Göz disk beyin kompleksi metamorfoz bu aşamada kolaylıkla ayrılır. Diseksiyon çanak alt beynin kesin. Merkezi beyin, optik lob dikkatlice ayırın. Canlı görüntüleme, optik lob / göz disk kullanılır. </li></ol> 6. Görüntüleme Canlı: mikroskop <ol><li> Eğer kısa bir süre için sadece bir veya iki çözümler görüntü isterseniz, Kağıt mendili bir cam slayt görüntü olabilir. Bu durumda, ilk kaplama Sylgard ile yüzey üreticinin talimatlarına kullanarak slayt hazırlamak. 20μL HL3 slayt ortasına yerleştirin. 20 ek mcL slayt için HL3 disseke doku taşınması. Doku havaya maruz ASLA gerekir. Buna ek olarak, herhangi bir stres ya da zorlanma pipet kullanımı veya çözüm yüzey gerilimi kaçınılmalıdır. </li><li> Canlı görüntüleme, doku az yol tutuşu ve iletişim sıkıca ile güvenli olması gerekir. Biz, güvenli bir mikroelektrot yoluyla uygulanan su polimerize cerrahi yapıştırıcı GluShield kullanarak beyin konumu, bir teknik, rutin elektrofizyoloji 5 embriyonik hazırlıkları için kullanılır. Elektrofizyolojik kayıtlar için çekilmiş gibi bir cam elektrot elde. Ucu kırın ve GluShield ağız yoluyla yaratılan negatif hava basıncı ile sona doldurun. Sadece yeteri kadar tutkal girebilirsiniz elektrot kesiyorum. Şimdi, HL3 bir damla altında Sylgard için küçük bir miktar yapıştırıcı uygulamak için pozitif basınç kullanın. Şimdi hızlı, canlı görüntüleme için istenilen yönünü koruyarak, tutkal doku. Su daldırma objektif görüntüleme için kullanılabilir. Bir membran geçirgen boya eklemek istiyorsanız, görüntüleme sırasında banyo ekleyebilirsiniz. </li><li> Biz, zaman ya da döviz çözümler uzun süre üzerinde görüntüleme için photobleaching azalttı. 6 tamamen ya da birden çok kez, peristaltik bir pompa ile bağlayan bir perfüzyon odası (Harvard IC30 konfokal görüntüleme odası) ile hızlı görüntüleme sağlayan bir Rezonans Taraması Konfokal Mikroskop bu yavaş yavaş canlı doku üzerine kültür çözüm perfuses (Şekil 2A). Sabit sıvı döviz hareketleri ve minimal GluShield temas süresi 7 daha uzun süre boyunca görülmüştür doku düzleştirme azaltır. Gelişimsel süreler görüntüleme için, göz-beyin disk kompleksi, bozulmadan kalması ve tutkal ile minimal temas olması gerekir gerektiğini unutmayın. </li><li> , Ince ve düz hale traş olan Sylgard bir damla ile kaplı bir kapak kayma kullanın. 20μL HL3 merkezi lamel ve tutkal Sylgard canlı doku üzerine koyun. Kabarcıkları hava (Şekil 2B) canlı doku maruz kalmadan odasına geçmesine izin verecek bir conta oluşturur. Conta ama konfokal mikroskop objektif yakın doku getirmek için yeterince ince doku ezilmesi önlemek için yeteri kadar kalın olmalıdır; kurulum 250μm kullanın. Doku her zaman tamamen sular altında tutmak için dikkatli olmak, perfüzyon odasının birleştirin. Başlangıçta bir peristaltik pompa kullanılarak dakikada bir oran yakın 100μL perfüzyon başlayın. Bu hızı oldukça hızlı odası yüksekliği tanımlar conta kalınlığına bağlı olarak. Saat ölçekte görüntüleme için, 20 hydroxyecdysone ve antibiyotik, ancak antifungal ekleyin ve perfüzyon dakikada 10μl etrafında çok daha düşük hızlarda gerçekleştirmek için gerekebilir. Son olarak, perfüzyon odasının sağlayan kültür ortamı içine kabarcık oksijen. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Video protokol sonunda Bölüm 5 sunulan hazırlık kullanarak gelişmekte olan fotoreseptör hücrelerinin canlı görüntüleme için bir örnek göstermektedir. Bu preparat floresan gazetecilere hücre özellikle ifade etmek Drosophila transgenesis yararlanır. Membran etiketli myrRFP ve endosomal marker 2xFYVE-GFP 9: gösterilen örnekte, iki floresan gazetecilere fotoreseptör-GMR-Gal4 sürücü 8 kontrolü altında ifade edilir. 70x70x17.5μm bir sınırlayıcı kutu ve 137x137x700nm (512x512x26) voksel boyutu ile iki kanal 3D veri setleri, her 1 dakikada elde edildi. Film intrasellüler endosomal kaçakçılığı ve vezikül füzyon olayları dinamikleri açığa 4D veri kümesi zaman içinde seçilen bir düzlemde gösterir. Şekil, göz ve lamina sabit doku hazırlıkları için Temsilcisi görüntüleri gösterilmiştir. 3.

<ol>
	<li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions.">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li><li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system.">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li><li>Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+lobe+development.">Optic lobe development.</a> Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+-+A+Laboratory+Handbook.">Drosophila - A Laboratory Handbook.</a> , (2005).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching.">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69, 689-692 (2006).</li><li>Ayaz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87 (4), 651-660 (1996).</li><li>Wucherpfennig, T., Wilsch-Brauninger, M., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Drosophila+Rab5+during+endosomal+trafficking+at+the+synapse+and+evoked+neurotransmitter+release.">Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release.</a> J Cell Biol. 161, 609-624 (2003).</li><li>Merzlyak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=monomeric+red+fluorescent+protein+with+an+extended+fluorescence+lifetime.">monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime.</a> Nat Methods. 4 (7), 555-557 (2007).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36 (3), 463-474 (2002).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Cooper, M. T., Bray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frizzled+regulation+of+Notch+signalling+polarizes+cell+fate+in+the+Drosophila+eye.">Frizzled regulation of Notch signalling polarizes cell fate in the Drosophila eye.</a> Nature. 397 (6719), 526-530 (1999).</li><li>Cook, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+subtype+specification:+from+flies+to+humans.">Photoreceptor subtype specification: from flies to humans.</a> Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).</li><li>Gurskaya, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaoptin,+a+cell+surface+glycoprotein+required+for+Drosophila+photoreceptor+cell+morphogenesis,+contains+a+repeat+motif+found+in+yeast+and+human.">Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human.</a> Cell. 52 (2), 291-301 (1988).</li><li>Richardt, A., Rybak, J., Stortkuhl, K. F., Meinertzhagen, I. A., Hovemann, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebony+protein+in+the+Drosophila+nervous+system:+optic+neuropile+expression+in+glial+cells.">Ebony protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells.</a> J Comp Neurol. 452 (1), 93-102 (2002).</li><li>Beronja, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+function+of+Drosophila+Sec6+in+apical+exocytosis+of+epithelial+photoreceptor+cells.">Essential function of Drosophila Sec6 in apical exocytosis of epithelial photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 169 (4), 635-646 (2005).</li><li>Mehta, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Drosophila+sec15+reveal+a+function+in+neuronal+targeting+for+a+subset+of+exocyst+components.">Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components.</a> Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).</li></ol>

Görüntüleme için kullanılır Floresan problar Burada üç sınıfa flüoresan millerini bir seçim için Drosophila görsel sistem hazırlanması gücünü ve sınırlarını açıklar: (1) canlı bir doku hazırlanması Eksojen eklenir Problar; (2) canlı ve hem de genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri sabit görüntüleme; immünohistokimya için sabit doku eklenir (3) floresan boyalar. 1. Eksojen problar: Lysotracker Yeşil DND-26 veya DND-99 Kırmızı (Invitrogen, Inc.) Floresan membran geçirgen en belirgin hücre, lizozomlar güçlü asitlendirilmiş bölümlerinde biriken bileşikler, geç endosomes ve autophagosomes ticari olarak mevcuttur. Nanomolar konsantrasyonları (biz genellikle 50 nM kullanımı) Lysotracker tam bir dakikadan az bir L3 ve P +20% göz disk nüfuz eder. Lysotracker sürekli birikir ve 5 dakikadan daha az alkalize etkisi, görüntü uygular. Lysotracker göz disklerinin aksine, doku bozulması olmadan beyin nüfuz değildir. Ancak, dış zarı yırtılması dikkatli optik lob birkaç hücre çapları penetrasyon sağlar. Lysosensor DND-189 Lysotracker için aksine (Invitrogen, Inc.) Lysosensor asitlendirilmiş bölmeleri birikir değildir, ancak sergiler asidik pH floresan arttı. Lysosensor penetrasyon Lysotracker çok benzer özelliklere sahiptir. Biz 1 mikrona kadar bir konsantrasyon Lysosensor kullanın. 2. Genetik olarak kodlanmış problar: Birçok canlı görüntüleme deneyleri için, GFP, TagRFP 10 veya ikili Gal4/UAS ifade sistemi 12 kontrol altında pH-duyarlı pHluorin 11 gibi çeşitli flüoresan molekülleri ile etiketlenen genleri ifade eder. GMR-Gal4 (tüm fotoreseptör) 8 ve mDelta0.5 Gal4 (R4 ve R7 geliştirme) 13 gelişmekte olan fotoreseptörlerde ifade Gal4 hatları içerir . Birçok alt tipi özel Gal4 sürücü hatları kullanan farklı Rodopsin rehberleri 14 mevcuttur. Özellikle canlı görüntülemede faydalı flüoresan millerini photoconvertible proteinlerdir. Biz başarıyla Dendra2, yeşil-kırmızı bir monomerik photoconvertable protein 15 kullandık. Dendra2 488nm Argon lazer çizgisi kullanarak photoconvertible olmak için tasarlanmış olduğunu unutmayın. Ancak, set-up ya geleneksel ya da rezonans konfokal tarama modunu kullanarak görünür mavi ışık kullanarak dönüşüm elde etmek mümkün değildir. Buna karşılık, 405nm UV lazer ile dönüşüm verimlidir. 3. İmmünohistokimya: Sabit bir yetişkin göz için, sık sık rhabdomeric yapısı (Şekil 1A) görselleştirmek için rodamin Phalloidin (Invitrogen, Inc.) Ya da anti-Chaoptin (fotoreseptör-spesifik antikor 16) seçebilirsiniz . Lamina kartuş yapısını analiz etmek için iyi bir yolu birleştirmek karşıtı chaoptin 16, anti-abanoz 17 glial marker ve anti-sec6 18 (Şekil 1B). Şekil. 3, antikorların bu kombinasyon en büyük presinaptik (chaoptin) ve postsinaptik (sec6) süreçleri gibi epitelyal lamina 19 glia (abanoz) ayırır. Perfüzyon Odası Montajı Canlı görüntüleme, doku hazırlanması rahatsız etmeden çözümler yavaş değişimi sağlayan bir perfüzyon odasının istihdam. Perfüzyon odamız meclisinin bir gösteri video ve şematik olarak Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Perfüzyon odasının Meclis Şekil gösterilmiştir. 2A. Ilk örnek üzerinde conta koyarak başlayın ve sonra montaj ile gösterildiği gibi devam edin. Conta amacı odasının taban ve kapak, doku mühürlü ve bu yolla çözüm akacaktır içinde bir uzay arasında bir boşluk oluşturmak için. Conta içindeki boşluk giriş (çözüm burada girer), doku hazırlık ve çözüm odasına bırakır çıkış içermelidir. Conta iki özellik önemlidir: Birincisi, conta henüz yüksek çözünürlüklü lens ile görüntüleme yetecek kadar ince beyin için yeterince kalın olmalıdır. Ideal bir conta kalınlığı özgü parametreleri set-up bağlıdır. İkincisi, conta bir çentik bir kabarcık numune (Şekil 2B) ile iletişime geçmesine olanak sağlayan bir bölmesi sağlar. Mikroskop az Görüntüleme Biz, doğrudan bir slayt kültür ortamı içine perfüzyon odası veya 63x suya daldırma lens 63x (diyafram 1.3) gliserin daldırma lens kullanabilirsiniz. Gliserin lensler yağ lensler daha fazla çalışma mesafesi sağlar. Biz, geleneksel bir tarayıcı (8000 Hz 1400 Hz karşı, sırasıyla) çok daha hızlı fiyatla tarayan bir rezonans tarama konfokal mikroskop kullanın. Rezonans tarama hızlı zaman içinde 3 boyutlu kayıtları sağlarer çerçeve oranları. Buna ek olarak, daha hızlı tarama hızları lazer fototoksisite 6 canlı doku tekrar taramalar için önemli bir endişe önemli ölçüde azaltır. Sinyal gürültü en aza indirilmesi ve photobleaching ise en üst düzeye çıkarmak için lazer yoğunluğu ve PMT gerilimi (kazanç) bir denge sağlanmalıdır. Önemli bir diğer dikkate belirli bir bölgeye lazer etkisinin çözünürlük ve zoom miktarı tarafından belirlenir. Örneğin, tercih edilen bir bölge, 512x512, zum 1x itibariyle 256x256, Zoom 2x aynı çözünürlükte taranır, henüz maksimum olası canlı görüntüleme hızı, 256x256 Zoom 2x 4 kat daha hızlı. Aktivite, hızlı bir şekilde hücre içi bölmeleri hareket kaydetmek için, aşağıdaki ayarları başarıyla kaydettik: z-stack ortalama 5 kare tek bir oran, 10 saniyede bir tarama hızı ile 8000 Hz ve 2x hattı ortalama z-yığını. Saat ölçekte uzun görüntüleme oturumları için, genellikle birkaç dakika başına bir kare hızını azaltmak ve hazırlık kayma olasılığı daha yüksektir gibi daha geniş alanları seçin. Drosophila Visual Sistemi Anatomisi Şekil 3 Drosophila yetişkin göz (Şekil 3A), yetişkin beyin (Şekil 3B) ve% 20 -% 25 pupa göz disk / beyin kompleksi (Şekil 3C) anatomi gösterir. Şekil 3A ve lamina ve yağ hücrelerinin bağlı olmadan her iki yetişkin göz göstermektedir. Yetişkin göz diseksiyon sırasında, fotoreseptör hücre gövdeleri (sol) oluşturduğu bir kase içinde yuvalanmış göz merkezinde lamina (sağda) altındaki hücre organları bozmadan kaldırılır olmalıdır. Yetişkin beyin diseksiyon için bir fotoreseptör hücre gövdeleri, lamina, optik lob, merkezi beyin ve trakea (Şekil 3B) ayırt etmek gerekir. Fotoreseptör ve trakea optik lob bağlı lamina bırakarak bu diseksiyon için kaldırılması gerekir. % 20-25, pupa göz disk / beyin kompleksi belirlenmesinde yardımcı olmak için, canlı bir görüntü Şekil 3C sunulmuştur. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 (A) yetişkin beyin. (B) yetişkin göz. (C) 20% -25% pupa eye-disc/brain kompleksi. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 (A) Perfüzyon oda montaj ve numune göre (B) conta konumlandırma. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. (A) anti-chaoptin kullanarak Yetişkin rhabdomere boyama. Anti-chaoptin (yeşil, fotoreseptör), anti-abanoz (kırmızı, glia) ve sec6 (mavi, internöronlar) ile (B) Yetişkin lamina boyama.

Özel Ekipman: <ol><li> Diseksiyon Kapsamı: dijital kamera ile Leica Mz12.5 </li><li> Konvansiyonel ve rezonans tarama için Leica TCS SP5 Konfokal Tandem-Tarayıcı Mikroskop yaşadığı görüntüleme mikroskopi, mavi (488nm), yeşil (561nm), portakal (594nm) ve uzak-kırmızı (633nm) lazerler yanı sıra özel 63x, 1.4 gliserin ve bir 63x, 1.3 su altında kalacak lensler de dahil olmak üzere. </li><li> Harvard Instruments Konfokal Görüntüleme Odası RC-30 ve peristaltik pompa modeli 720 </li><li> Sutter Pipet çektirmesi P-97 </li><li> Yazılım: Amira 5.2, Visage Görüntüleme </li></ol>

preparation of developing and adult drosophila brains and retinae for live imaging

<em&gt; Drosophila</em&gt; Beyin ve görme sistemi, yaygın nöronal gelişim, işlev ve dejenerasyon incelemek için model sistemler kullanılmaktadır. Burada üç beyin hazırlıkları ve gelişmekte olan gelişmekte olan pupa göz-beyin disk kompleksi yetişkin sinekleri tek tek göz ve beyin diseksiyonu aralığı kapsayan görsel sistem göstermektedir. Tüm protokol hazırlıkları canlı kültürü için optimize edilmiştir. Ancak, biz de sabit doku immünohistokimya hallerde için şartlar mevcut. Son olarak, perfüzyon odasında konvansiyonel ve rezonans 4D konfokal canlı görüntüleme kullanarak bu hazırlıkları için canlı görüntüleme koşulları göstermektedir. Birlikte, bu protokoller, gelişimsel veya dejeneratif süreçlerin dakika ölçekte birçok saat ölçekte fonksiyonel hücre içi testleri arasında değişen farklı zaman ölçeklerinde canlı görüntüleme için bir temel sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging at JoVE.com

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Bu protokol, üç açıklar<em&gt; Drosophila</emGöz-beyin disk kompleksleri diseksiyonu gelişmekte&gt; müstahzarlar: 1) yetişkin beyin diseksiyonu, 2) yetişkin retina diseksiyon ve 3). Tüm hazırlıklar sabit doku immünohistokimya için kullanılabilir olsa da vurgu, canlı görüntüleme için özel hazırlama teknikleri ve koşulları üzerine koydu.

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

preparation-developing-adult-drosophila-brains-retinae-for-live

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

35.1K Görüntüleme.  University of Texas Southwestern Medical Center. Bu protokol, üç açıklar Drosophila müstahzarlar: 1) yetişkin beyin diseksiyonu, 2) yetişkin retina diseksiyon ve 3). Tüm hazırlıklar sabit doku immünohistokimya için kullanılabilir olsa da vurgu, canlı görüntüleme için özel hazırlama teknikleri ve koşulları üzerine koydu.