이 작품은 웰치 재단 (I - 1657)와 NIH (RO1EY18884)에서 보조금에 의해 지원되었다. PRH는 바이오 메디컬 연구에 유진 맥더멋 학자이다.

1. 소개 이 비디오에서는, 우리는 photoreceptor 세포에 초점을 라이브 영상과 immunohistochemistry를위한 Drosophila의 두뇌와 retinae를 준비하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 첫째, 뇌 해부를 위해 준비하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 살아있는 준비의 기초를 형성 일반적으로 immunohistochemistry에 사용되는 두 가지 기본적인 해부를 보여줄 것입니다. 이 두 준비는 성인 두뇌와 눈 해부하고 있습니다. 다음, 우리는 photoreceptors 라이브 영상 그들의 사용에 중점으로 성인과 개발 두뇌의 라이브 이미징에 사용되는 해부를 보여줄 것입니다. 마지막으로, 우리는 우리가 어떻게 이미지 사는 조직을 설명하고 공진 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 영상의 몇 가지 예입를 표시합니다. 2. 해부 준비 <ol><li> 좋은 해부 들어, 날카로운 집게가 필요합니다. 엔드 좋은 지점에서 만날 때까지 선명하게 차단하거나 매우 미세한 모래 종이 (&gt; 1500)를 사용하여, 부드럽게 양쪽에 앞뒤로 포셉을 전달합니다. 우리는 표준 선명하게 돌을 사용합니다. 우리는 여기에 선명하게 기술을 커버지만, 날카로운 집게가 사는 해부에 필수적인 유의하지 않습니다. 우리는 모든 해부하기 전에 포셉를 선명하게. </li><li> 성인 뇌 해부에 대한, 그들을 마취하고 원하는 유전자형을 정렬하는 CO 2 패드에 파리를 놓으십시오. pupal 해부 들어, 단순히 유리병에 도달하고 신중하게 pupal 사건을 깨는 않도록주의하고, 당신의 집게와 번데기를 제거합니다. </li><li> 물로 Kimwipe을 축축하게하다. 당신은 포셉에서 파편을 제거하기 위해 절개하는 동안 이것을 사용합니다. 입체경의 무대에서 해부 접시를 위치하고 HL3 솔루션 1을 입력합니다. 모든 해부는 조직의 해부 과정 중에 살아있는 건강한 상태를 유지하기 위해 HL3에서 실시됩니다. 또한, 우리는 해부 동안 포셉을 보호하기 위해 Sylgard의 하단 덮개를 가진 해부 접시를 사용합니다. </li><li> 이제, 당신이 immunohistochemistry을 수행하려는 경우 정착액 준비합니다. 500μL microcentrifuge 관에 HL3의 플레이스 180μL. 3.7 %의 포름 알데히드 용액을 얻기 위해 37 % 포름 알데히드의 20μL를 추가합니다. </li><li> 마지막으로, 적절한 손의 위치는 좋은 해부 중요합니다. 좋은 손 위치와 함께, 당신의 집게는 안정 제어, 섬세한 움직임이 가능합니다. 첫째, 네 손가락의 측면에 포셉 놓으십시오. 그런 다음 바로 아래 손가락의 끝 위에 달려 이러한 색인 손가락을 가져다. 이제 가운데 손가락의 측면에 포셉의 측면을 휴식과 해부 요리로 이동합니다. 당신의 엄지와 가운데 손가락으로 음식과 신체 접촉을합니다. 접시에 엄지와 가운데 손가락을 쉬고 있지만, 현미경 스테이지에 손목을 공장. 이렇게하면 세 점은 해부 동안 단단히 표면에 심어져하고 포셉 매우 미묘한 조작을하기 위해 현재 가능합니다. 이 기술은 처음에는 조금 어색하게 느낄 수 있지만, 연습, 당신은 곧 뇌 해부의 주인이되는 것입니다. </li></ol> 3. 성인 뇌 <ol><li> CO 2 패드에서 동양 성인 떨어진 손에서 머리 복부 쪽을 날아. 바로 머리 아래의 흉부를 잡아. 정상적으로 완료하면, 다리와 코이 연장됩니다. 입체경 아래에서 보는 동안 머리를 제거하려면 집게로 확장 코를 잡아. 신체 및 잠수함 머리를 삭제. 서브 머 지드 머리에 집중할. 전체 해부는 솔루션에 따라 수행됩니다. 그것은 항상 집게로 머리를 지키고 매우 중요합니다. 그렇지 않으면 머리가 부동하고 검색하기가 어렵습니다 것입니다. 머리가 절개 도중 초점 밖으로 이동하는 경우, 단순히 현미경을 조정하지 않고 초점 비행기로 다시 이동합니다. 이것은 겉보기에 간단한 작업은 처음에는 어려울 수 있지만, 초점에 머리를 유지하는 것은 시간이 지남에 따라 쉽게 될 것입니다. </li><li> 먼저 코와 눈 사이의 결합 조직을 찢어하여 절개를 시작합니다. 항상 적어도 하나의 집게로 단단히 누른 상태에서 눈에 눈물. 두뇌 아래의 손상을 방지하기 위해, 포셉의 발끝이 망막 또는 표피 아래에 그냥 ...임을 확신한다. 왼쪽 및 오른쪽 번갈아, 머리 뒤쪽 방향으로 노력하고, 망막을 떠날 귀하의 집게를 사용합니다. 망막 멀리 찢어하면 라미나이 절개를 통해 광 엽에 부착된 남아있는 가능성이 훨씬 높아지게됩니다. 길을 따라 표피를 찢어, 머리 뒤로 계속합니다. 다른 눈에 눈물과 멀리 표피를 당기 시작합니다. 오래 당신은 표피를 잡을 있으므로, 당신이 아는 당신은 머리를 분쇄하지 않습니다! 마음이로 두뇌가 드러났습 때까지 거리 표피와 망막을 당겨 계속. </li><li> 두뇌가 표시되면, 당신은기도의 두뇌 (그림 1A)에 첨부된 제거하실 수 있습니다. 두뇌가 격리 때까지기도하고 표피에 끌어 계속. 이 시점에서, 당신은 t을 위해 접시의 바닥에 집중할해야그는 단계 남아 있습니다. 머리가 달리 야간 항체 세척하는 동안 부동 수 있기 때문에 남아있는 기관을 제거합니다. photoreceptor 단말기의 영상을 위해, 그것은 얇은 판을 유지하는 것이 바람직하다,하지만 당신은 세포 기관 및 강력 autofluorescent 안료를 포함하는 망막을 삭제해야합니다. 이렇게하려면 신중하게 라미나을 손상없이 부쉬와 색소 세포의 유지에 당기십시오. 이것은 미세한 기술이며 연습이 필요. </li><li> 성인 두뇌는 우리가 섹션 6에서 설명합니다 조건을 사용하여 몇 시간 또는 며칠 동안 생명을 유지하실 수 있습니다. immunohistochemistry 들어, 성인 두뇌는 포름 알데히드에 이제 해결 될 준비가 된 것입니다. 2가 이미 준비했던 고정 솔루션에 어른 두뇌를 이동 5μL로 설정 P20 pipetteman을 사용합니다. 40-10 두뇌를 양보해야하는 20 분 동안 어른 머리를 해부 계속합니다. 추가 40 분 수정에 두뇌를 떠나, 그러나이 기간은 최적의 일차 항체 염색법에 따라 다를 수 있습니다. 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 이하 - 트라 이튼이라고 PBS와 0.4 % TritonX - 100을 포함하는 솔루션의 400μL 5 분 각 두뇌에게 3 회 씻는다. 완전히 해결책을 세척 후 일차 항체 솔루션을 추가할 수 있습니다. </li></ol> 4. 성인 눈 <ol><li> 성인 두뇌에 대한 설명으로 절개를 시작합니다. 머리를 잠수함이 잠수과 현미경주의를 환기 시켰을 뿐일세 후 코와 눈 사이의 결합 조직을 찢어하여 시작합니다. 코 위, 눈에서 표피를 구분한다. 자, 머리 뒤쪽 방향으로 노력하고, 눈 아래쪽에서 표피를 구분한다. 한 집게로 머리 뒤쪽의 중심을 잡아 야지. 다른과 함께 시선을 잡고 당기십시오. 눈이 (그림의 1B) 접시의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 라미나 아마 아직도 눈에 첨부되며,이 시간에 완벽하게 그대로 photoreceptor 세포의 터미널의 라이브 영상에 사용될 수 있습니다. photoreceptor 세포 기관의 라이브 영상을 계속하려면 섹션 4.5로 이동합니다. 다음 세 부분은 고정 눈 immunohistochemistry를 설명합니다. </li><li> immunohistochemistry 들어, 5μL로 설정 P20 pipetteman를 사용하여 솔루션을 해결하기 위해 눈에 이동합니다. 10 분 총 성인 눈 해부 계속합니다. 추가 30 분 수정에 눈을를 남겨주세요. 으로 성인 뇌 해부에 설명되어있는 해결책 및 실시 세척을 제거합니다. </li><li> 당신이 궁극적으로 이미지를 눈 ommatidial 구조를 원할 경우 라미나 지금 제거해야합니다. 귀하의 해부 접시에 고정 눈을 반환하고 그대로있을 수있는 기관이나 지방 세포를 제거합니다. 다음 한 포셉과 눈의 바깥쪽을 잡고 있지만, 다른과 라미나를 제거합니다. 그것은 (그림의 1B) 아래 cellbodies를 노출 한 조각으로 잘라야한다. 단지 얇은 판을 움켜주의! 그렇지 않으면, 당신은 망막에서 photoreceptors을 분리 위험. </li><li> P20의 pipetteman 사용 500uL 튜브 400uL PBS - 트리톤으로 눈을 이동합니다. 부드럽게 photoreceptors에서 autofluorescent 붉은 색소를 제거하는 야간 4 정도에 그들을 바위. 그 다음날, 당신은 씻어 솔루션을 버리고 기본 항체 솔루션을 추가할 수 있습니다. </li><li> 성인 눈 라이브 영상을 위해 우리는 pharate 성인 파리를 사용하여 바로 eclosion 전에 늦은 무대 pupae 즉. 이 단계에서는 해부 동안 라미나의 터미널에서 별도의 photoreceptor 세포 기관. </li><li> Pharate 성인 pupae는 잘 정의된 날개, 눈, 그리고 pupal 사건을 통해 보이는 표피 있습니다. 번데기를 선택하고 머리 영역을 노출 pupal 사건의 앞쪽에 부분을 제거합니다. 조심스럽게 추가 개발 파리를 encloses 얇은 막 내부를 제거합니다. 당신의 집게와 끌어와 머리 받침대를 잡아. 머리가 가라 앉 유지하면서 번데기의 나머지 부분을 삭제. </li><li> 로 immunohistochemistry에 대한 눈 해부에 시연 진행합니다. pharate 성인 단계에서는 그러나, photoreceptor 세포 기관은 이미지 망막에 자리잡고 세포 기관을 수 있도록, 얇은 판에서보다 쉽게​​ 분리됩니다. 또한, 얇은 판은 이미지 말초 라미나을 수 있도록 광 엽에 붙어 남아 있습니다. 이 이미지에 photoreceptor 터미널 카트리지 볼 수있는 근위 라미나을 원하시면, 다음 라미나가 더 강력하게 눈에에 첨부되어 성인 즉시 안과 절개를 수행합니다. </li></ol> 5. 눈 디스크 두뇌 단지를 개발 <ol><li> 비교적 큰 발전 세포의 단일 층이 쉽게 공촛점 현미경을 사용하여 관찰할 수 있기 때문에 20% pupal 개발 (P 20%)에서 개발 눈 디스크 우리가 실험실에서 살고 이미지에 대한 선호되고있다 3. </li><li> 20 % 번데기를 선택하려면, malpighian tubules,이 pupal 경우 아래 나타나는 녹색 지점을보고, &quot;어둠의 몸&quot;4를 갖고 pupae을 피하십시오. 귀하의 해부 접시에 HL3에서 P 20% 번데기, 잠수함을 선택한 후 조심스럽게 신중, pupal 자루의 앞쪽에 부분을 제거얇은 막 내부에 침투하지 않습니다. 당신의 집게와 내부 멤브레인을 파악하고 분열 시키려고. </li><li> 조심스럽게 (그림 1C) 꽤 유명한있는 개발 두뇌와 눈 디스크를 찾을 수있는 발표 내용을 통해 검색할 수 있습니다. 눈 디스크 두뇌 복잡한 쉽게 변태의이 단계에서 구분합니다. 해부 접시의 바닥에 머리를 분리. 조심스럽게 광학 엽의 중앙 두뇌를 구분한다. 광학 엽 / 눈 디스크는 라이브 이미징에 사용됩니다. </li></ol> 6. 이미징 라이브 : 현미경에서 <ol><li> 당신은 단 하나 또는 두 개의 솔루션의 짧은 기간에 대한 이미지를 원한다면, 당신은 유리 슬라이드에 이미지 귀하의 조직을 수 있습니다. 이 경우에는 먼저 코팅 제조 업체의 지침을 사용하여 Sylgard로 표면하여 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드 중간에 20μL HL3를 배치합니다. 슬라이드 HL3 20 추가 μL에서 해부하는 조직을 전송. 조직은 공기에 노출 절대해야합니다. 또한, 피펫 처리 또는 솔루션 표면 장력로부터 응력이나 변형을 피할 수 있어야합니다. </li><li> 라이브 이미징 들어, 조직은 확고 최소한의 핸들링과 연락처와 보안해야합니다. 우리는 안전 microelectrode를 통해 적용된 물 polymerizing 수술 아교 GluShield를 사용하여 두뇌 위치, 기술은 정기적으로 전기 생리학 5 배아 준비를 위해 사용됩니다. electrophysiological 레코딩을위한 뽑아 그 같은 유리 전극을 구합니다. 팁을 중지하고 GluShield이 입에 의해 생성된 부정적인 공기 압력을 이용하여 끝을 입력합니다. 단 정도 접착제가 입력할 수있는 전극의 중지. 지금 HL3의 드롭 아래 Sylgard에 접착제의 작은 금액을 적용하기 위해 긍정적인 압력을 사용합니다. 자, 빨리 라이브 영상에 원하는 방향을 유지, 접착제의 조직을 설정합니다. 물 침지 렌즈는 이제 이미지에 사용될 수 있습니다. 당신은 막 투과의 염료를 추가하려는 경우, 당신은 영상하면서 목욕탕에 추가할 수 있습니다. </li><li> 우리는 시간 또는 교환 솔루션을 오랜 기간 동안 이미지에 대한 photobleaching 감소 6. 완전히 또는 여러 번, 우리가 연동 펌프에 연결 재관류 챔버 (하버드 IC30 공촛점 영상 챔버)를 사용할 빠르게 이미지를 허용 공진 스캐닝 공촛점 현미경을 사용하여 그렇게 천천히 (그림 2A) 살아있는 조직을 통해 문화 솔루션을 perfuses. 지속적인 액체 교류와 최소한의 GluShield 문의 운동 시간이 7 이상 기간 동안 관찰되어 조직의 평평화을 줄일 수 있습니다. 발달 시간대의 영상을 위해, 눈을 디스크 두뇌 복잡한 그대로 유지하고 접착제로 최소한의 접촉을해야 필요합니다. </li><li> 그것이 얇고 평평 렌더링을 면도있다 Sylgard 한 방울로 코팅된 표지 전표를 사용하십시오. coverslip 및 접착제 Sylgard로 살아있는 조직의 중심에 20μL HL3 하는걸. 거품이 공기 (그림 2B)로 살아있는 조직을 노출하지 않고 챔버 통과 수있는 개스를 생성합니다. 가스켓은 조직 있지만 공촛점 현미경 렌즈에 가까운 조직을 제공할 정도로 얇은을 깔아 뭉 갠다고 피할 정도로 두께가 있어야합니다, 우리 설정에서 250μm 사용합니다. 완전히 항상 변할 조직을 유지하기 위해주의되는, 재관류 챔버를 조립. 연동 펌프를 사용하여 분당 요금 가까이 100μL 속도로 초기 재관류를 시작합니다. 이 속도는 상당히 빠른 챔버의 높이를 정의하는 근육의 두께에 따라 수 있습니다. 시간의 규모 이미징 들어, 20 hydroxyecdysone 및 항생하지만, antifungal하지를 추가하고, 분당 10μl 주변 훨씬 낮은 속도에서 재관류를 수행 할 수 있습니다. 재관류 챔버를 제공 문화 매체에 마지막으로, 우리는 거품 산소. </li></ol> 7. 대표 결과 : 우리의 비디오 프로토콜의 끝에 우리는 제 5에 표시되는 준비를 사용하여 개발 photoreceptor 세포에 살고 이미징에 대한 예를 보여줍니다. 이 준비는 세포 특별히 형광 기자를 표현하는 Drosophila transgenesis을 활용합니다. 멤브레인 - 태그 myrRFP 및 endosomal 마커 2xFYVE - GFP 9 표시된 예제에서는 두 개의 형광 기자는 photoreceptor 특정 GMR - Gal4 드라이버 8 통제하에 표현됩니다. 70x70x17.5μm의 경계 상자 137x137x700nm (512x512x26)의 voxel 크기가 2 채널 3 차원 데이터 세트는 매 1 분을 획득했다. 영화는 세포내 endosomal 인신 매매와 소포의 융합 이벤트의 역학 관계를 보여이 4D의 세트에서 시간이 지남에 따라 선택한 비행기를 보여줍니다. 눈과 얇은 판의 고정 조직 준비를위한 대표 이미지는 그림에 표시됩니다. 3.

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이미징에 사용 형광 프로브 여기 세 가지 클래스에서 형광 프로브의 선택에 대한 Drosophila 영상 시스템 준비의 강점과 한계를 설명합니다 : exogenously 살아있는 조직을 준비에 추가됩니다 (1) 프로브, 유전자 살고 모두 인코딩됩니다 (2) 형광 단백질 고정 이미지, immunohistochemistry에 대한 고정 조직에 추가됩니다 (3) 형광 염료. 1. 외인성 프로브 : Lysotracker 그린 DND - 26 또는 DND - 99 레드 (Invitrogen, 주식 회사) 이들은 형광 막 - 투과 가장 눈에 띄게 세포, lysosomes에 강력히 산성 구획에 축적 화합물, 후반 endosomes, 그리고 autophagosomes 상용 사용할 수 있습니다. nanomolar 농도 (우리가 일반적으로 50 nm의 사용)에서 Lysotracker 완전​​히 미만 분 L3와 P 20% 아이 디스크를 투과해 들어갔던 것이다. Lysotracker은 지속적으로 축적하고 5 분 미만의 alkalizing 효과, 우리는 이미지를 미치는 때문에. 눈에 디스크와는 달리, Lysotracker은 조직의 파괴없이 머리를 침투하지 않습니다. 그러나, 외부 멤브레인의 찢어주의는 광 엽 몇 세포 직경의​​ 침투 수 있습니다. Lysosensor DND - 189 Lysotracker 대조적으로 (Invitrogen 주식 회사)가 Lysosensor은 산성의 구획에 축적되지 않지만, 전시 산성 산도에 형광 증가했다. Lysosensor는 Lysotracker 매우 유사 침투 특성이 있습니다. 우리는 1μM의 농도에 Lysosensor을 사용합니다. 2. 유전자 인코딩 프로브 : 많은 라이브 이미징 실험을 위해, 우리는 GFP, TagRFP 10 바이너리 Gal4/UAS 표현 시스템 12 통제 산도에 민감한 pHluorin 11 같은 다양한 형광 분자로 태그 유전자를 표현한다. 개발 photoreceptors의 표현 Gal4 - 라인 GMR - Gal4 (모든 photoreceptors) 8 mDelta0.5 - Gal4 (R4와 R7을 개발) 13가 포함되어 있습니다. 몇몇 subtype 특정 Gal4 - 드라이버 라인 사용하는 다른 Rhodopsin의 발기인 14 존재합니다. 라이브 영상에 특히 유용합니다 형광 프로브는 photoconvertible 단백질입니다. 우리는 성공적으로 Dendra2, monomeric 녹색 - 투 - 붉은 photoconvertable 단백질 15를 사용했습니다. Dendra2가 488nm 아르곤 레이저 라인을 사용하여 photoconvertible 수 있도록 설계됩니다. 그러나, 우리는 기존의 또는 공진 중 공촛점 스캔 모드에서의 설정을 사용하여 보이는 푸른 불빛을 사용하여 변환을 달성할 수 없습니다. 반면, 405nm UV 레이저로 변환 효율적입니다. 3. Immunohistochemistry : 고정 성인 아이에 대한, 우리는 자주 rhabdomeric 구조 (그림 1A)를 시각화하는 rhodamine phalloidin (Invitrogen 주식 회사) 또는 방지 Chaoptin (photoreceptor 특정 항체 16) 중 하나를 선택합니다. 라미나 카트리지 구조를 분석하는 좋은 방법은 안티 - chaoptin 16, glial 마커 방지 흑단 17 및 안티 sec6 18 일 (그림의 1B)를 결합하는 것입니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 3 항체의 조합은 주요 presynaptic (chaoptin)와 postsynaptic (sec6) 프로세스뿐만 아니라 라미나 19 상피 glia (흑단)을 구별. 재관류 회의소 조립 라이브 영상을 위해, 우리는 조직 준비를 방해하지 않고 솔루션의 느린 교환을 허용하는 재관류 챔버를 사용합니다. 재관류 챔버 어셈블리의 행동은 동영상에 포함되어 있으며 간략하게 구조 그림 2에 표시됩니다. 재관류 챔버의 어셈블리 그림 그림입니다. 2A. 먼저 표본을 통해 근육을 마련함으로써 시작하고, 다음 그림과 같이 조립을 계속합니다. 가스켓의 목적은 챔버의 기본과 뚜껑, 조직 밀봉하고이를 통해 솔루션이 흐름되는 내부 공간 사이에 공간을 만드는 것입니다. 개스킷 내부 공간은 입구 (솔루션이 여기 입력), 조직 준비하고, 솔루션은 챔버 나뭇잎하는 통해 콘센트를 포함해야합니다. 가스켓의 두 기능은 중요합니다 : 첫째, 가스켓 아직 고해상도 렌즈 영상을 허용하도록 충분히 얇은 두뇌 정도 두께가되어야합니다. 이상적인 가스켓 두께가 설정 특정 매개 변수에 따라 달라집니다. 둘째, 근육에있는 노치가 거품이 시편 (그림 2B)를 문의하지 않고 통과하도록 허용하는 구획을 제공합니다. 현미경에서 이미징 우리는 직접 슬라이드에있는 문화 매체에 재관류 챔버 또는 63x 물 침지 렌즈를위한 63x (조리개 1.3) 글리세린 침지 렌즈를 사용합니다. 글리세린 렌즈는 석유 렌즈보다 작동 거리를 제공합니다. 우리는 종래의 스캐너 (8,000 Hz에서 1,400 Hz에서 비교, 각각)보다 훨씬 빠른 속도로 스캔 공진 스캔 공촛점 현미경을 사용합니다. 공진 스캔 빠르게에서 시간이 지남에 3 차원 녹음이 가능합니다어 프레임 속도. 또한, 빠른 스캔 속도는 상당히 살아있는 조직의 반복 검사에 대한 주요 관심사입니다 레이저 phototoxicity 6 줄일 수 있습니다. 레이저 강도와 PMT 전압 (이득)의 균형은 노이즈를 최소화하고 photobleaching하면서 신호를 최대화하기 위해 달성해야합니다. 중요한 추가 고려 사항 주어진 지역에 레이저에 미치는 영향의 크기는 해상도와 줌에 의해 결정됩니다 것입니다. 예를 들어, 선택의 지역은 512x512, 확대 1X에서와 같은 256x256, 확대 2X에서 동일한 해상도로 스캔, 아직 maximally 가능한 라이브 영상 속도는 256x256에서 줌 2 배 4 배 빠릅니다. 신속 세포내 구획을 이동의 활동을 기록하기 위해, 우리는 성공적으로 다음과 같은 설정으로 기록했습니다 : Z - 스택 당 5 프레임 하나의 속도로 8,000 Hz에서와 2X 라인 평균의 스캔 속도로 10초 당 Z - 스택. 시간의 규모에 긴 이미징 세션에, 우리는 종종 몇 분 당 한 프레임 속도를 줄이고 준비가 전환 될 가능성이 더욱 높아집니다로 큰 영역을 선택합니다. Drosophila 비주얼 시스템 해부학 그림 3은 Drosophila의 성인 아이 (그림 3A), 성인 뇌 (그림 3B), 그리고 20 % -25 % pupal 눈 디스크 / 두뇌 복합 (그림 3C)의 해부를 보여줍니다. 그림 3A 함께하고 얇은 판과 연결된 지방세포없이 모두 성인 눈을 보여줍니다. 성인 눈 해부 동안 photoreceptor 세포 기관 (왼쪽)에 의해 형성된 그릇에 자리잡고 눈의 중앙에있는 얇은 판은, (오른쪽) 아래 세포의 시체를 중단하지 않고 제거해야합니다. 성인 뇌 해부 들어, 하나는 photoreceptor 세포 기관, 얇은 판, 광 엽, 중앙 두뇌 및 기관 (그림 3B)를 구별할 수 있어야합니다. 광학 엽에 부착된 얇은 판을 떠나는 동안 photoreceptors과 기관이 해부를 위해 삭제해야합니다. 20-25% pupal 눈 디스크 / 두뇌 단지의 식별에 투입, 실제 이미지가 그림 3C에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. (A) 성인 뇌. (B) 성인 아이. (C) 20 % -25 % pupal eye-disc/brain 복합 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. (A) 재관류 챔버 어셈블리 및 표본에 비해 (B) 개스킷 위치. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 방지 chaoptin를 사용하여 (A) 성인 rhabdomere 염색법. 안티 chaoptin (녹색, photoreceptors), 안티 - 백 (빨강, glia), 그리고 sec6 (파란색, interneurons)를 사용하여 (B) 성인 라미나의 얼룩.

특수 장비 : <ol><li> 절개 범위 : 디지털 카메라와 Leica Mz12.5 </li><li> 종래와 공진 스캔 Leica TCS SP5 공촛점 탄뎀 - 스캐너 현미경 라이브 블루 (488nm), 녹색 (561nm), 오렌지 (594nm)과 멀리 붉은 (633nm) 레이저뿐만 아니라 특별한 63x, 1.4 글리세린 및 63x, 1.3 물 침지 렌즈를 포함한 이미징 현미경. </li><li> 하버드 악기 공촛점 이미징 회의소 RC - 30과 연동 펌프 모델 720 </li><li> 서터 피펫 풀러 P - 97 </li><li> 소프트웨어 : Amira 5.2 비세 영상 </li></ol>

preparation of developing and adult drosophila brains and retinae for live imaging

<em&gt; Drosophila</em&gt; 두뇌와 시각 시스템의 연결을 광범위하게 개발, 기능과 퇴보를 공부하기 위해 모델 시스템을 이용하고 있습니다. 여기는 세 두뇌의 준비와 개발 pupae의 개발 눈을 디스크 뇌의 복잡한에서 파리 성충에서 각각의 안구와 뇌 해부 범위를 커버 영상 시스템을 보여줍니다. 모든 프로토콜은 준비 라이브 문화 최적화되어 있습니다. 그러나, 우리는 고정 조직 immunohistochemistry 어디에 적용을위한 조건을 제시한다. 마지막으로, 우리는 재관류 챔버에서 종래와 공진 4D 공촛점 라이브 이미지를 사용하여 이러한 준비에 대한 라이브 이미징 조건을 보여줍니다. 함께,이 프로토콜은 몇 시간의 규모 발달이나 퇴행성 프로세스 분 규모의 기능성 세포 assays에 이르기까지 다양한 시간 스케일에서 라이브 영상에 대한 기초를 제공합니다.

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Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

이 프로토콜은 세 설명<em&gt; Drosophila</em&gt; 준비 : 눈을 디스크 두뇌 단지의 절개를 개발 1) 성인 뇌 해부, 2) 성인 망막의 해부 3). 모든 준비가 고정 조직 immunohistochemistry 사용할 수 있지만 강조는 특별한 준비 기술과 라이브 영상을위한 조건 마련이다.

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

preparation-developing-adult-drosophila-brains-retinae-for-live

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

35.2K 조회수.  University of Texas Southwestern Medical Center. 이 프로토콜은 세 설명 Drosophila 준비 : 눈을 디스크 두뇌 단지의 절개를 개발 1) 성인 뇌 해부, 2) 성인 망막의 해부 3). 모든 준비가 고정 조직 immunohistochemistry 사용할 수 있지만 강조는 특별한 준비 기술과 라이브 영상을위한 조건 마련이다.

비디오: Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

연구

생물학

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

개별 준비 Drosophila</em라이브 이미징을위한> 계란 회의소

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...