このプロトコルは、ポールマーティンとアントニオサンジャシントの研究室とのコラボレーションの中でとの我々の仕事を通じて開発されています。我々は、フライラインを共有し続けるための素晴らしいサービスとショウジョウバエコミュニティのためのブルーミントンストックセンターに感謝します。 BSは現在BBSRCプロジェクトの助成金によって賄われています。 WWは、ウェルカムトラストのキャリア開発奨学金によって運営されている。

準備<ol><li>血球特異Gal4のドライバ（例：SRP - Gal4の 2）とUAS制御（例えば、UAS - GFP）の下で遺伝的に符号化された蛍光レポーターを含む適切なショウジョウバエの行を取得します。 SRP - GAL4、UAS - GMA 3またはCRQ - GAL4、UAS - GFP 4、5のホモ接合体ハエは、イメージングのために（NB GMAはモエシンのアクチン結合ドメインに融合したGFPです）特に有効です。については下記を参照してくださいGal4のドライバーとUASの範囲は（ブルーミントン証券センターでは様々なを含む）利用可能な構築。 </li><li>一般的に遺伝的交雑は、その突 ​​然変異対立遺伝子をGal4のドライバと代替相同染色体上に運ばUAS構築物で、蛍光バランサCTGまたはTTG 6を使用してバランスしている行われている。これはCTG / TTG関連GFP蛍光（このはステージ2.11で行われる）の有無に基づいてホモ接合変異体を選択することが可能になります。 </li><li>リンゴジュース寒天プレート7と産卵ケージに株式や場所のハエを増幅する。ハエは、十分な胚が敷設され始める前に敷設ケージに慣れるために最低2日必要です。一般的に雌雄各二十ハエは、イメージングのための十分な胚を生成するために十分なはずですが、それは別の線が生殖能力の度合いが異なることに留意すべきである。私たちは、空気の流れを可能にするために、その基部に穴を開け、プラスチックビーカーの底部に収まる55ミリメートルペトリ皿を、使用してください。胚のコレクションの正確な意味は重要ではありませんが、タイミングは胚の段階を正しく収集するために不可欠です。 </li><li> 25℃を維持して一晩リンゴジュース寒天プレートからまたはタイムアウトしたプレートから胚を収集する。後者について我々は一般的にハエがプレートを取り外すと前胚の取り付けに15〜16時間18 ° Cでそれを配置する前に、4時間予め温めておいた皿にレイアウトすることができますが、これは後半ステージ12からを通じて胚を提供します。開発の15段階まで。一晩プレートはステージの多様化が含まれているが25時間の長い期間に起因する血球細胞における蛍光レポーターの発現の高いレベルの利点を提供° CはGAL4 - UASシステムとして、温度に敏感です。 </li></ol>手順<ol><li>少量の水と柔らかい先端絵筆を使ってリンゴジュース寒天プレートから胚を押しのける。外れた胚は、肉眼で容易に見ることができます。 </li><li>セルストレーナー（フィッシャー）に胚を移したり、排水を収集するためにビーカーに開催されたバスケットにリンゴジュース寒天プレートから水を注ぐことによってバスケット7のホームメイド。 </li><li>あなたがリンゴジュース寒天プレートから転送された十分な胚を持って満足するまで、手順2.2を繰り返します。 </li><li>水を使用してセルストレーナー/バスケットで胚を洗浄してください。 </li><li>リンゴジュース寒天プレートのペトリ皿の蓋の場所のセルストレーナー/バスケットと十分なセルストレーナー/バスケットに胚を中断するためにきちんとした漂白剤を追加。 </li><li>明視野の下に解剖顕微鏡で胚のdechorionationに従ってください：dechorionationは2分以内に発生する必要のある、背の付属物が溶解したときに完了です。 </li><li>漂白剤から胚を含むセルストレーナー/バスケットを取り外し、水を使用して残留漂白剤を洗い流す。漂白剤のすべてのトレースは2.8段階に進む前に削除する必要があります。すべての漂白剤が除去されたかどうかを評価する1つのトリックは、青い色の実験室組織に残留水をオフブロットになります - 残留漂白剤が存在する場合、青色がピンク/白漂白されます。 </li><li>セルストレーナー/バスケットの下側に適用される研究室組織/ mediwipesを使用して残りの水をオフに汚点。 </li><li>ペトリ皿の蓋で水の液滴を配置。細かい絵筆で、胚のバスケットからすべてdechorionated胚を収集し、液滴に再懸濁します。次のマイクロピペットを用いて水を吸引したり、慎重に実験室での組織/ mediwipesでそれを吸収することにより胚を乾燥させる。 </li><li>胚が乾燥したら、すべての胚をカバーするためにvoltalef油の滴を追加します。胚を含む液滴に隣接する油の第二の小さなドロップを置く。 NBは、我々はvoltalef油の英国ベースのサプライヤーを見つけることができませんでした;ハロカーボンのオイル700（Sigma）を代わりに使用することができます。 </li><li>蛍光解剖顕微鏡下で適切に油滴から時計ピンセット（5番）のペアを使用して、目的の遺伝子型の胚を上演選択。これらの鉗子は、卵黄膜に穴を開けることなく、胚をすくい上げるために、曲げ内側（図1）でなければなりません。第二次オイル滴に選択された胚を移す。それはあなたが共焦点顕微鏡（図2）で良好な画像を収集できるようにするために解剖顕微鏡で蛍光血球を見ることができることが重要です。我々は通常、腹側正中またはステージ15胚の血球の画像横移行する段階14分の13の胚をマウントします。画像胚上に分散、以下の血球の運動をする。 </li><li>それらの（図3）の間に約1cm残し、voltalef油の2つの小さな滴を使用して、Petriperm / Lumoxディッシュ（ザルスタット）の下側に2つのカバーグラス（18x18mm、厚さ1）を守っています。これらは、上に配置カバースリップをサポートするために使用されます。胚は、これはそれらを押しつぶすた​​めではない。 Petripermの皿（直径50mm）は疎水性、ガス透過性膜が含まれています。我々は、料理は、彼らが（料理は70％エタノールで拭くと再利用できる）を複数回使用された後、より使いやすくなることがわかります。 </li><li>解剖顕微鏡で明視野の下に、カバースリップの端（図3）までと平行に曲がったピンセットとライン、それら腹側で選択された胚を一つずつピックアップ。あなたの器用さと忍耐によっては、この方法では15胚まで揃えることが可能です。胚とPetriperm皿膜の両方が壊れていると簡単に破裂することができるとして、それは穏やかに胚を操作することが重要です。 </li><li>一度胚は油の小滴を追加し、これに2つのカバーガラスの間に均一な層を形成するために広がっせ整列されます。油が広がっている後に（これは数分かかる場合があります）胚がまだ腹側であることを確認してください。胚はわずかにロールバックしている場合は、鉗子で再びそれらを再配置。 </li><li>最後に、ピンセット（3番）場所いた2つの付着したカバースリップ上休んで胚オーバーカバー（18x18mm、厚さ1）を、使用して。カバースリップに接着剤このカバーはマニキュアを（図3）を使用してサポートしています。 </li><li>共焦点または広視野顕微鏡にマウントされている胚でPetriperm皿を取り、適切なアダプタを使ってステージ上でPetriperm皿をマウント。正立または倒立顕微鏡は、カバースリップを介して焦点対物レンズ（のような膜を介してではなく）で、いずれも使用可能である。 </li></ol>代表的な結果： このプロトコルは、胚の腹側にある血球のライブイメージングのために、ショウジョウバエの胚をマウントする方法について説明します。正しく行えば、それは、血球の静止画または動画のどちらかを生成することが容易になります。主要な決定要因は、画像血球を（特に対物レンズの）ために使用する顕微鏡ですが、取得した画像の性質にも開発の段階に依存する、温度は胚がで育ち、Gal4のとUASラインを使用した。 蛍光タンパク質の発現の高いレベルは、血球がより簡単に撮像されるようになります、したがって、それは（図2は胚内で明確な血球の例が含まれている、で撮影した胚はプロトコルの段階2.11にいるときは血球を見ることができることが重要です解剖顕微鏡に取り付けたカメラ）。 Gal4のとUASの構造のそのための増加の数値が高い信号対雑音比を有効にします。さらに、これは順番に血球挙動を可能にするイメージングは​​、より長い期間にわたって続くことに高いレーザー強度の増加または露光時間の必要性が軽減されます。 GFP発現の非常に高いレベルは、円形の細胞体（図4A - B）を囲む、特に血球形態の細部、薄いシート状のラメラが表示されます。 GFPを除く円形の領域は、ファゴソーム（図4A - C）を表しています。指状の糸状仮足もラメラ（図4B）から出て見ることができます。二つのGal4のドライバが1つ以上のがSRP - Gal4の （議論を参照）である場合は特に、（図4C）これらのプロセスを参照するのに十分残っている、しかし遅いスキャン速度や共焦点顕微鏡に大きなレーザーパワーが必要になることがあります。発現レベルが低下するとして、それは画像血球の突起をすることはより困難になり、それにもかかわらず、それは、突起が（図4D）あまり明確な場合であっても細胞体が明らかに残っているとして、これらの条件の下で血球の移行を追跡することも可能です。 開発の初期段階（ステージアップ13〜）血球が互いに密接に連絡を移行し、それは個々の細胞を区別することは困難です。ステージの終わりで13血球は、腹側正中（図5A）ダウン単一の行を形成して、その後、より多くの運動になって、腹側神経索（図5B）の端に横方向に移行する。血球の動的な突起内のアクチン細胞骨格は直接GMA（図5C）や桜モエシンの発現を通して観察することができます。 このように胚をマウントすると、ガス交換を可能にし、脱水を防ぎ、胚は、実行可能な以下の画像のまま。胚は、それをマウント中に破損している場合、胚のコンテンツは、その卵黄膜を介して漏洩するとして、一般的に明白です。胚はその後、脱水を開始しない場合、これは多くの場合、卵黄膜の変形が見られたこともできます。時折胚のタイムラプスムービーの途中でロールバックされます、しかしこれだけ長いタイムスケールの映画の問題となる傾向があります。 Lastlyは、一度に複数の胚をマウントすると、実験家に彼らの実験に最適な向きで胚を得る絶好のチャンスを与えます。 <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 dechorionated胚の操作のための鉗子 。 時計職人鉗子（サイズ番号5）のヒントがここに示されているように胚をすくい上げるためのツールのファッションへ順番に曲げ内側にする必要があります。彼らはパンク胚をアップできる鋭いエッジを持っていないとしてPetriperm膜上に配置するときに曲がって地域の外表面には、胚を操作すると便利です。 <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。良いライブイメージングの結果が得られる胚の代表的な画像 。 voltalef油でdechorionated胚（プロトコルの段階2.11時）の画像は、蛍光実体顕微鏡で撮影。 CRQ - GAL4、UAS - GFPの胚、ステージ13（A）とステージ15（B）SRP - GAL4、UAS - GFPの側面図。ステージ15 SRP - GAL4、UAS - GFP / +の側面図、CRQ - GAL4、uas-GFP/uas-N17Racの胚は（C）これで血球は時血球どのようなものかを胚実演、ヘッドからの移行に失敗しているそれらの渡り鳥の経路に沿って明らかではありません。開発（D）のこの段階で腸内の複雑な構造を示すCRQ - GAL4、UAS - GFPの胚;ステージ17 SRP - GAL4、UAS - GFPの側面図筋収縮の発症は、これ以上の胚のライブイメージングを防止開発の段階。ステージ13（E）とステージ14の腹側のビュー（F）SRP - Gal4の、蛍光標識した核と血球の分散を示すUAS -赤スティンガーの胚。プロトコルの段階で2.11での蛍光による血球の観察は、優れた画像を得るための前提条件であり、前方には、すべての画像の右側にあります。 <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 Petriperm / Lumox皿に胚の取付け 。 二つ18x18mmカバースリップ（厚さ1）に示すように約1cmで区切られた油の小滴を、使用してPetriperm皿の底面に貼り付けています。胚はその後、カバースリップの端に彼らの長い（前後）方向の平行と腹側を上に並べられ、油の小滴で覆われている。一度油はサードカバースリップ（18x18mmの厚さ1）を静かに押しつぶされてから胚を防ぐために、ブリッジとして2つの以前に付着したカバーグラスを使用して油で覆われた胚の上に配置されている2つのカバーグラスの間のギャップを埋めるために広がっている。このカバーは、マニキュアの二つの小さな滴を使用して、2つのカバースリップのブリッジに糊付けされています。一度設定すれば、胚は、カバースリップを下に焦点対物レンズ（のようなPetripermの膜を介してではなく）と正立または倒立顕微鏡上に結像することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 GFP標識した血球のライブイメージングから代表的な結果 。 CRQ - GAL4、UAS - GFPの胚（AB）、ステージ14 SRP - GAL4、UAS - GFPの腹側にある血球のZ -予測。 （A）タイムラプスムービーで血球発達移行を監視するために使用されるような低倍率の画像です。 （B）、その形態の細かい詳細を示す、腹側正中線上の血球のさらに高い倍率です。 Gal4のドライバーとUASのそれより低いコピー数を明らかに、CRQ - GAL4、UAS - GFP / +胚、（C）ステージ14 SRP - GAL4、UAS - GFP / +の腹側正中線上血球の単一の1 mのスライスです。構文はまた、良好な画像を生成するのに十分です。 （D）ステージ14 CRQ - GAL4、UAS - GFPの胚における血球のz -射影を表示します。ここで血球突起が原因でGFPの低い発現にはあまり明白ですが、それは映画を作るとGal4のドライバとUAS構築のこの組み合わせで血球移行を追跡することも可能です。画像は、ライカLSM510共焦点顕微鏡で撮影した、前方には、すべての画像で、最大であり、画像の周辺部でのリングは卵黄膜の自家蛍光によって引き起こされます。 <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。 GMA表現する血球のライブイメージングから代表的な結果 。 Z -突起ステージ13（）とステージ14（B）SRP - GAL4、UAS - GMAの胚、血球の発育への移行を表示するボックスに追加映画から取られたの腹側正中線上に血球の。アクチンダイナミクスの詳細情報は、GM​​A表現血球（C）の高倍率撮影することにより得ることができる。 GMAはモエシンとラベルアクチンフィラメントのアクチン結合ドメインに融合したGFPで構成されています。前方には、すべての画像で最高であり、画像は共焦点顕微鏡で撮影された。

<ol>
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この手順の最も重要な要素は明記された血球との健全な胚の選択であり、それらを傷つけることなく慎重にそれらをマウントする。一度胚は、脱水に耐性があると一度にマウントされている数時間のためにイメージングすることができるハロカーボンのオイルになります。私たちの手では40倍の目標と私たちのツァイスLSM510共焦点顕微鏡で3分ごとに画像のz -スタックを取っ胚やフォトダメー?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>70&mu;m pores</td>
</tr>
<tr>
<td>Halcarbon oil 700</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8898</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lumox/Petriperm dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>96077305</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations

使用して多くの研究のアドレスの細胞遊走<em&gt; in vitroで</em&gt;の方法は、生理学的に関連する環境に対し、生物自体のことです。ここでは、取り付けのためのプロトコルを提示<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;胚と蛍光標識血球のその後のライブイメージング、この生物の胚マクロファージ。 GAL4 - UASシステムを使用する<sup&gt; 1</sup&gt;我々は胚全体に彼らの発達分散に従うことを血球に遺伝的に符号化された、蛍光標識マーカーの様々な発現を駆動する。開発の目的の段階で胚のコレクションに続いて、外側の絨毛膜が除去され、胚は、その後疎水性、ガス透過膜とライブイメージング用ガラスカバースリップ間のハロカーボンのオイルにマウントされます。このような速度と方向性として総渡り鳥のパラメータに加えて、蛍光F -アクチンの記者と微小管の使用と相まって、高解像度のイメージングは​​、これらの細胞骨格成分の動態に関するより詳細な情報を提供することができます。

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Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

live-imaging-of-drosophila-melanogaster-embryonic-hemocyte-migrations

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

15.6K ビュー.  University of Bath. ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。

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Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

生物学

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

開発と大人の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>脳と網膜

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

大人からOenocytesの解剖キイロショウジョウバエ</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

の分離キイロショウジョウバエ精巣

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

個々の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>エッグチェンバース

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

における寿命の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...