我々はモハメドアブダラとアリソンアーレンズと共に、神経科学会議とこのビデオ制作の2009年学会でポスター発表ではこの実験と彼女の助けを行う上で彼女のサポートのためにリアMcAleerに感謝します。また、この実験のためのデータ収集と分析で彼らの支援についてロージーマドックス、レイチェルChavana、とリンダチュを高く評価しています。このプロジェクトは、NIH / NIDAグラント3R01DA014640 - 05S1（CLD）、アルコールや中毒研究ジョーンズフェローシップとNIH / NIAAトレーニンググラントAA07471（AAF）のためのワゴセンターによってサポートされていました。コカイン塩酸は寛大NIDA薬の在庫と電源制御プログラムによって提供されました。

*=最も重要なステップ<ol><li>よく扱わ雄Sprague - Dawleyラットは、食品の報酬（;バイオ- SERV、フレンチ、ニュージャージー州45mgのシュークロースのペレット）とレバー押すように訓練されています。 </li><li> *静脈カテーテルは、ステンレス鋼カニューレ（プラスチックOne、VA）およびシラスティックチューブから構成されている。ラットは、薬物自己投与できるように、頸静脈カテーテル挿入手術を受ける。ガス供給システム（VetEquip、株式会社、プレザントンを介して配信、およびイソフルラン（AErrane、バクスターヘルスケア、ディアフィールド、イリノイ州2.5〜4パーセント）、麻酔は、酸素の混合物（Airgasの西南、コーパスクリスティ、テキサス州0.8リットル/分）で構成され、CA）。手術後、カテーテルの開存性は、毎日0.9％生理食塩水、ヘパリンとTimentin（抗生物質）溶液0.1mlで洗浄によって維持されます。ゲンタマイシン、局所抗生物質は、感染を防ぐために、頭蓋骨のキャップと胸切開に適用されます。すべての外科的手技は、無菌動物の手術のためのガイドラインに従いました。手術用品はオートクレーブされた測定機器は、化学溶液とホットビーズ滅菌器で滅菌した。注入されたカテーテルは準備中にメタノール、水と空気でフラッシュしてから、手術日に70％エタノール溶液を浴びていた。ラットはbetadineソリューションのアプリケーションを続けて頭と胸面積を削って手術のために調製した。手術後、ラットは動物のコロニーに戻った開始する前に、いくつかの時間を監視した。 </li><li>コカイン（NIDA薬の在庫と供給と制御プログラム、RTIインターナショナル、リサーチトライアングルパーク、ノースカロライナ州）この実験で使用されているが、動物の重みに応じて適切な投与量の濃度の等張食塩水（0.9％）に溶解した。コカインのソリューションは、日常の使用に先立って0.2 UM滅菌シリンジフィルターを通して濾過した。 </li><li> *装置は、住宅と刺激ライトとphotobeamsの3組（メッドアソシエーツ、セントオールバンズ、VT）を搭載したつのシングルレバーオペラントチャンバー（28 × 22 × 21センチ）のものから構成されて。チェンバースが建設さプレキシグラス路地（21 × 25 × 25センチ）で接合されている。路地には白のストライプ二つの黒の壁と二つの金属の壁、透明なプレキシグラスの上部、および白のプレキシグラスのフロアーで構成されています。 twoオペラントチャンバーはスチールグリッドロッド（4.8 mm）の床は取り外し可能な金属ケージの底部を介してインストールされている。感覚手がかりは、ユニークな、識別可能な環境を作成するためにオペラントチャンバー内に配置されています。視覚的な手掛かりは、白または黒のどちらかで構成され材料前面と背面の壁に取り付けられ、ケージの上から感じた。嗅覚手掛かりは、石油ベースの香り（バラやシナモン）飽和チャンバのロッドの床の下にある綿球です。 </li><li>実験手順は、薬物自己投与セッション（8または16日）に続いてベースラインの設定のテスト（2日）、で始まる、と条件付け場所し好性（CPP）テスト（1日）で終了する、複数日にわたって行われます。 </li><li> *ベースラインの設定およびCPPテスト手順の実行中に、動物は両方オペラントチャンバーへのアクセス権を持っている。装置の上にマウントされているビデオカメラは、各チャンバーのために、ラットの入口と出口を記録します。チャンバー内Photobeamsは、運動活性の指標として使用されるビームの破損を検出する。レバーの反応と自発運動（例えば、photobeamの破損）データはメッド- PCソフトウェア（メッドアソシエーツ社、装備メッドペンティアム100 MHzのコンピュータで記録されている間、薬物自己投与セッション中に、動物は、単一の操作室に制限されていますセントオールバンズ、バーモント州）。 </li><li>ベースラインの設定の測定は、二日連続で収集されます。開始するには、ラットを20分にわたって両方オペ​​ラントチャンバーへのアクセス権を持つ中央の路地に配置されます。直ちにチャンバー内に配置した後、ビデオカメラ、メッド- PCのソフトウェアプログラムとタイマは、同時に活性化される。ベースラインの設定データは、ビデオ録画の動画を見る際に評価されています。 </li><li> *薬物自己投与セッションは、最後のベースラインテストの翌日に開始。感覚手がかり（例えば、白または黒の壁材やバラやシナモンの香り）とプレキシグラス中心路地へのアクセスを遮断するパネルは、動物の前にチャンバー内に配置されます。マウントされている薬剤の注射器からチューブが動物のカテーテルの入口に接続されている間にセッションを開始するには、動物をチャンバー内に配置されます。オペラントチャンバーの扉を閉じた後、メッド- PCのプログラムとタイマーが開始し、コカインのアクセスは、1時間使用可能です。 0.1コカインmlの（0.75 mg / kg体重/ INJ）または生理食塩水の注入で各レバーの応答の結果。それぞれの自己管理セッションの終了時にラットは、薬剤のチューブから切断されているチャンバーから取り出し、ホームケージに入れ。 </li><li>最後に自己管理のセッションの翌日は、動物は条件付け場所し好性（CPP）のテストを受ける。 （7を参照）ベースライン測定のために説明するように手順は同じです。 </li><li> *データ評価：グループの割り当てに盲目実験では量を決定する時間の動物は15分の期間（装置内に配置後に開始5分）のためのコンパートメントの間に入口と出口を評価するためにビデオテープを見ることによって、各コンパートメントで過ごす。同じ手順は、ベースラインの設定およびCPPテストの点数を決定するために使用されます。 </li><li> *データ分析：ベースラインの測定とポストコンディショニングCPPスコアの違いは、薬剤コンディショニング効果を決定するために使用されています。差得点は、CPP試験（薬剤ペアのコンパートメントの秒数）の間に薬剤ペアのコンパートメントに費やされる時間の量から生理食塩水ペアリングコンパートメントに費やされる時間の量を差し引くことによって計算されます - （生理食塩水の秒数）コンパートメントペアリング。ベースラインからのテストセッションに差がスコアの変化に関する統計解析は、薬物のコンディショニングの効果を決定するために実行することができます。 </li></ol> CPPのスコアは、CPP差のスコアの割合（％）として表すことができます。本研究では、CPP差スコアの％は次の式を用いて、各操作室で費やされた時間のパーセントを決定することにより、最初に計算した：（医薬品の時間（または生理食塩水）商工会議所/各商工会議所の合計時間）* 100 =％条件付け場所し好性（CPP）。 - （生理食塩水ペアリング％）= CPP差スコアの％（薬剤ペアの％）：相違点のスコアの割合は、式によって決定した。 <img src="/files/ftp_upload/1998/1998fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。コカイン摂取と条件付け場所し好性との関係ピアソンの相関分析は、8つのセッション（例えば、長期のグループのために自己管理コカインを持っていた動物の総コカイン強化レバー応答とCPP差のスコア％の間に有意な正の相関を決定する。。P &lt;0.05）ではなく、短期群の動物（例えば、4コカインのセッション）。オープンダイヤモンドは長期コカインのための個々のデータポイント（N = 9）を表し、黒丸はコカイン短期（N = 8）グループを表します。ベストフィットラインは長期のために破線、および短期のデータポイントのための固体されています。

<ol>
	<li>Sanchis-Segura, C., Spanagel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+assessment+of+drug+reinforcement+and+addictive+features+in+rodents:+an+overview.">Behavioural assessment of drug reinforcement and addictive features in rodents: an overview.</a> Addict Biol. 11 (1), 2-2 (2006).</li><li>Tzschentke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reward+with+the+conditioned+place+preference+(CPP)+paradigm:+update+of+the+last+decade.">Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade.</a> Addict Biol. 12 (3-4), 227-227 (2007).</li><li>Koob, G. F., Bloom, K. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-administered+and+passive+cocaine+infusions+produce+different+effects+on+corticosterone+concentrations+in+the+medial+prefrontal+cortex+(MPC)+of+rats.">Self-administered and passive cocaine infusions produce different effects on corticosterone concentrations in the medial prefrontal cortex (MPC) of rats.</a> Pharmacol Biochem Behav. 94 (1), 163-163 (2009).</li><li>Ciano, P. D. i., Blaha, C. D., Phillips, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+changes+in+dopamine+oxidation+currents+in+the+nucleus+accumbens+of+rats+by+stimuli+paired+with+self-administration+or+yoked-administration+of+d-amphetamine.">Conditioned changes in dopamine oxidation currents in the nucleus accumbens of rats by stimuli paired with self-administration or yoked-administration of d-amphetamine.</a> Eur J Neurosci. 10 (3), 1121-1121 (1998).</li><li>Twining, R. C., Bolan, M., Grigson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yoked+delivery+of+cocaine+is+aversive+and+protects+against+the+motivation+for+drug+in+rats.">Yoked delivery of cocaine is aversive and protects against the motivation for drug in rats.</a> Behav Neurosci. 123 (4), 913-913 (2009).</li><li>Moolten, M., Kornetsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+self-administration+of+ethanol+and+not+experimenter-administered+ethanol+facilitates+rewarding+electrical+brain+stimulation.">Oral self-administration of ethanol and not experimenter-administered ethanol facilitates rewarding electrical brain stimulation.</a> Alcohol. 7 (3), 221-221 (1990).</li><li>Schindler, C. W., Panlilio, L. V., Goldberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-order+schedules+of+drug+self-administration+in+animals.">Second-order schedules of drug self-administration in animals.</a> Psychopharmacology (Berl). 163 (3-4), 327-327 (2002).</li><li>O'Dell, L. E., Khroyan, T. V., Neisewander, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+characterization+of+the+rewarding+and+stimulant+properties+of+cocaine+following+intraperitoneal+and+intravenous+administration+in+rats.">Dose-dependent characterization of the rewarding and stimulant properties of cocaine following intraperitoneal and intravenous administration in rats.</a> Psychopharmacology (Berl). 123 (2), 144-144 (1996).</li><li>Liu, Y., Roberts, D. C., Morgan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+the+reinforcing+effects+of+self-administered+cocaine+in+rats:+effects+of+dose+and+intravenous+injection+speed.">Sensitization of the reinforcing effects of self-administered cocaine in rats: effects of dose and intravenous injection speed.</a> Eur J Neurosci. 22 (1), 195-195 (2005).</li></ol>

この記事のビデオ制作は、この記事で使用する楽器を作り出すメッド准後援した。

オペラント静脈内薬物自己投与と場所コンディショニングの手順は、薬物依存や中毒1 2 3の神経生物学的基盤を研究するための信頼性と有効なモデルです。どちらの方法が広く前臨床薬物乱用の研究で使用され、乱用薬物4の補強性を測定することができますされています。しかし、両方の方法は、ここで紹介する新たな装置及び方法は、5を改良したという欠点を持っている。 従来のCPPの手順のいずれか大きな欠点は、薬剤投与の非偶発的なモードです。薬物摂取のこのモードは、自己投与6 7 8 9 10 11異なる行動と神経化学的成果を有し、そしてヒトの薬物服用経験と一貫性がありません。さらに、薬物自己投与の手順とは異なり、CPPのパラダイムは、増加した薬物摂取に反映されている薬剤のモチベーションの進歩的な変化を測定することができない、手に負えない薬物中毒にレクリエーションの薬物使用のスイッチで推定ターニングポイント。しかし、薬物自己投与行動は、同様に解釈の制限があります。例えば、応答率がよく報酬の値を推定するために使用されますが、直接薬物の動機づけ効果とは無関係自己管理薬、の運動の効果によって影響を受ける可能性がある。さらに、薬剤強化応答の数は、薬剤注入に関連した刺激12の有無によって影響を受ける可能性が。 コカインは、容易にラットでの自己投与と投与量と投与2 13 14の種々の経路で堅牢な条件付け場所嗜好を生成することが知られている。本研究の結果は、薬物の強化モデルの以前の報告をサポートしています。さらに、コカイン強化レバーの応答とCPPのスコアの間に有意な正の関係が長期ではなく短期コカインのグループで決定されたものです。これらの結果は、場所のコンディショニングと自己投与は、報酬の同型の措置とは限らないことを示唆している。例えば、それはCPPは短期的なコカインの暴露後に、通常、最初のレクリエーションの薬物使用と見られる急性の補強性を反映すると考えられる。一方、より多くのコカインの経験を持つラットでは、条件強化の増加レベルに対応して、コカインの摂取量のエスカレーションは、薬剤感受性または特定の集団の強化報酬薬の効果で進歩的な変化を示している可能性があります。 この装備方法は、薬剤の肯定的な補強効果を評価を超えてユーティリティを持っています。例えば、初期の薬物使用中に存在していない医薬品の忌避効果は、拡張薬物暴露（例えば、条件付け場所嫌悪、またはCPA）をemergeすることができますし、この手法を用いて検出可能になる。その他の用途は、コカイン、キュー連合学習に最も敏感な部分母集団の画面への潜在的な、コカインに動機づけられた行動の経験を介した変化を評価するため、および薬物禁欲および/またはキューさ復職時の永続的な薬の効いた効果を検出することが含まれています。結論として、この装置とアプローチは、時間とコスト効果的な、薬物乱用に関連するトピックの広い配列を調べるために使用され、CPPまたは単独で、自己管理の方法よりも、実験デザインの柔軟性を提供することができます。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Operant Conditioning Behavior (Drug Self-administration) Test Package for Rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.med-associates.com/">Med Associates, Inc</a></td>
<td>MED-008-CT-B1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Infrared Source and Detector (Photobeams)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.med-associates.com/">Med Associates, Inc</a></td>
<td>ENV-253SD ENV-253</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Med PC Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.med-associates.com/">Med Associates, Inc</a></td>
<td>SOF-735</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Single speed syringe pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Razel Scientific Instruments</td>
<td>Model R-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>45 mg sucrose pellets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Serv</td>
<td>F0042</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catheter cannula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plastics One</td>
<td>C313G-5UP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cocaine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RTI International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

novel apparatus and method for drug reinforcement

補強の動物モデルは、薬物中毒の根底にある神経生物学的メカニズムを理解するために有用であることが証明されている。オペラント薬物自己投与し、条件付け場所し好性（CPP）の手続きは、発展​​的に薬物の強化、消費、およびヒトでの中毒の様々なコンポーネントをモデル化するために、動物研究で使用されています。本研究では、従来のCPPと自己管理の手法を組み合わせることにより、ラットにおける薬物の強化を研究するための新しいアプローチを使用する。我々は2つ​​メッド准オペラントチャンバー、感覚刺激、とプレキシグラスに構築されたニュートラルゾーンを使用して装置を組み立てた。これらの変更は、我々の実験は、自己投与およびCPPのテストと薬剤/キューコンディショニングの強さの薬剤無料査定により薬物の摂取の動機づけの側面を包含することができました。我々の実験で、ラット自己管理コカイン（0.75 mg / kg体重/ INJ、IV）は、4つ（例えば、&quot;短期的&quot;）または8のいずれかの間（例えば、&quot;長期的&quot;）における交互日間のセッション独特の感覚手がかり（例えば、嗅覚と視覚）を含むオペラント環境。別の日には、他の（異なる - キューさ）オペラント環境では、生理食塩水は自己注入（0.1ミリリットル、IV）でのみ使用可能でした。最後self-administration/cue-pairingセッション24時間後、CPP試験を実施した。典型的なCPPの所見と一致し、コカインの自己投与に伴うチャンバーのための重要な嗜好があった。さらに、動物での長期実験、CPPの大きさとコカイン強化レバーの応答の数の間に有意な正の相関を迎えて。結論として、この装置とアプローチは、時間とコスト効果的な、薬物乱用に関連するトピックの広い配列を調べるために使用され、CPPまたは単独で、自己管理の方法よりも、実験デザインの柔軟性を提供することができます。

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Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

オペラント薬物自己投与し、条件付け場所し好性（CPP）の手続きは、発展​​的に薬物の強化、消費、およびヒトでの中毒の様々なコンポーネントをモデル化する研究に使用されています。このレポートでは、我々はラットにおける薬物の強化と中毒を研究するための新しいアプローチとして、従来のCPPと自己管理の方法を組み合わせる。

薬物の強化のための新規装置および方法

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

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JoVE Core

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Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Drug Abuse and Addiction

SCIENTISTS IN ACTION

19.0K ビュー.  University of Texas at Austin. オペラント薬物自己投与し、条件付け場所し好性（CPP）の手続きは、発展​​的に薬物の強化、消費、およびヒトでの中毒の様々なコンポーネントをモデル化する研究に使用されています。このレポートでは、我々はラットにおける薬物の強化と中毒を研究するための新しいアプローチとして、従来のCPPと自己管理の方法を組み合わせる。

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A Novel Method for Assessing Proximal and Distal Forelimb Function in the Rat: the Irvine, Beatties and Bresnahan (IBB) Forelimb Scale

Several experimental models of cervical spinal cord injury (SCI) have been developed recently to assess the consequences of damage to this level of the spinal cord (Pearse et al., 2005, Gensel et al., 2006, Anderson et al., 2009), as the majority of human SCI occur here (Young, 2010; www.sci-info-pages.com). Behavioral deficits include loss of forelimb function due to damage to the white matter affecting both descending motor and ascending sensory systems, and to the gray matter containing the segmental circuitry for processing sensory input and motor output for the forelimb. Additionally, a key priority for human patients with cervical SCI is restoration of hand/arm function (Anderson, 2004). Thus, outcome measures that assess both proximal and distal forelimb function are needed. Although there are several behavioral assays that are sensitive to different aspects of forelimb recovery in experimental models of cervical SCI (Girgis et al., 2007, Gensel et al., 2006, Ballerman et al., 2001, Metz and Whishaw, 2000, Bertelli and Mira, 1993, Montoya et al., 1991, Whishaw and Pellis, 1990), few techniques provide detailed information on the recovery of fine motor control and digit movement.
The current measurement technique, the Irvine, Beatties and Bresnahan forelimb scale (IBB), can detect recovery of both proximal and distal forelimb function including digit movements during a naturally occurring behavior that does not require extensive training or deprivation to enhance motivation. The IBB was generated by observing recovery after a unilateral C6 SCI, and involves video recording of animals eating two differently shaped cereals (spherical and doughnut) of a consistent size. These videos were then used to assess features of forelimb use, such as joint position, object support, digit movement and grasping technique.
The IBB, like other forelimb behavioral tasks, shows a consistent pattern of recovery that is sensitive to injury severity. Furthermore, the IBB scale could be used to assess recovery following other types of injury that impact normal forelimb function.

A Novel Method for Assessing Proximal and Distal Forelimb Function in the Rat: the Irvine, Beatties and Bresnahan IBB Forelimb Scale

Here we will describe a rodent behavioral assay that can detect recovery of both proximal and distal forelimb function including digit movements during a naturally occurring behavior that does not require extensive training or deprivation to enhance motivation.

ラットの近位および遠位前肢の機能を評価するための新手法：アーバイン、ビーティーズやブレスナハン（IBB）前肢のスケール

Several experimental models of cervical spinal cord injury (SCI) have been developed recently to assess the consequences of damage to this level of the ...

神経科学

A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish (Danio rerio) and the Quantification of Withdrawal

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed. 
This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish Danio rerio and the Quantification of Withdrawal

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

複数のゼブラフィッシュへの医薬品の新規方法（<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）と撤退の定量

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

小脳顆粒ニューロン培養におけるFluorescein Diacetate-Propidium Iodide二重染色を用いたニューロン生存率の評価

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

新しい方法を用いた自由に動く新生児ラットの脳波記録

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

冷痛覚のための新規アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic Brain Injury (mTBI). The mechanisms responsible for its complex pathological changes remain largely elusive, despite a recent consensus to define the neuropathological criteria. Here, we describe a novel method to develop a model of CTE in Drosophila melanogaster&#160;(Drosophila&#160;)&#160;in an attempt to identify the key genes and pathways that lead to the characteristic hyperphosphorylated tau accumulation and neuronal death in the brain. Adjustable-strength impacts to inflict mild closed injury are delivered directly to the fly head, subjecting the head to rapid acceleration and deceleration. Our method eliminates the potential problems inherent with other Drosophila mTBI models (e.g.,animal death might be induced by damage to other parts of the body or to internal organs). The less labor- and cost-intensive animal care, short life span, and extensive genetic tools make the fruit fly ideal to study CTE pathogenesis and make it possible to perform large-scale, genome-wide forward genetic and pharmacological screens. We anticipate that the ongoing characterization of the model will generate important mechanistic insights on disease prevention and therapeutic approaches.

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

Here, we describe a new approach to inflict closed-head traumatic brain injury in Drosophila melanogaster. Our method has the advantage of directly delivering repetitive impacts with adjustable strength to the head alone. Further exploration of the invertebrate system will help to illuminate the pathogenesis of chronic traumatic encephalopathy.

慢性外傷性脳症モデルの新しい方法<em&gt;ショウジョウバエ</em

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced electrodes for large-scale electrophysiological recording of neuronal activity, but the procedures for their chronic implantation are still underdeveloped. The activity of hippocampal place cells is known to correlate with an animal&#39;s position in the environment, but the underlying mechanisms are still unclear. To investigate place cells, here we describe a set of techniques which range from the fabrication of devices for chronic silicon probe implants to the monitoring of place field activity in a cue-enriched treadmill apparatus. A micro-drive and a hat are built by fitting and fastening together 3D-printed plastic parts. A silicon probe is mounted on the micro-drive, cleaned, and coated with dye. A first surgery is performed to fix the hat on the skull of a mouse. Small landmarks are fabricated and attached to the belt of a treadmill. The mouse is trained to run head-fixed on the treadmill. A second surgery is performed to implant the silicon probe in the hippocampus, following which broadband electrophysiological signals are recorded. Finally, the silicon probe is recovered and cleaned for reuse. The analysis of place cell activity in the treadmill reveals a diversity of place field mechanisms, outlining the benefit of the approach.

We describe the diverse steps to implant chronic silicon probes and to record place cells in mice that are running head-fixed on a cue-enriched treadmill apparatus.

慢性的なシリコン プローブと豊かなトレッドミル装置海馬場所細胞の記録

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

CMAP Scan MUNE (MScan) - A Novel Motor Unit Number Estimation (MUNE) Method

Like other methods for motor unit number estimation (MUNE), compound muscle action potential (CMAP) scan MUNE (MScan) is a non-invasive electrophysiologic method to estimate the number of functioning motor units in a muscle. MUNE is an important tool for the assessment of neuropathies and neuronopathies. Unlike most MUNE methods in use, MScan assesses all the motor units in a muscle, by fitting a model to a detailed stimulus-response curve, or CMAP scan. It thereby avoids the bias inherent in all MUNE methods based on extrapolating from a small sample of units. Like &#39;Bayesian MUNE,&#39;&#160;MScan analysis works by fitting a model, made up of motor units with different amplitudes, thresholds, and threshold variabilities, but the fitting method is quite different, and completed within five minutes, rather than several hours. The MScan off-line analysis works in two stages: first, a preliminary model is generated based on the slope and variance of the points in the scan, and second, this model is then refined by adjusting all the parameters to improve the fit between the original scan and scans generated by the model.
This new method has been tested for reproducibility and recording time on 22 amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patients and 20 healthy controls, with each test repeated twice by two blinded physicians. MScan showed excellent intra- and inter-rater reproducibility with ICC values of &#62;0.98 and a coefficient of variation averaging 12.3 &#177; 1.6%. There was no difference in the intra-rater reproducibility between the two observers. Average recording time was 6.27 &#177; 0.27 min.
This protocol describes how to record a CMAP scan and how to use the MScan software to derive an estimate of the number and sizes of the functioning motor units. MScan is a fast, convenient, and reproducible method, which may be helpful in diagnoses and monitoring disease progression in neuromuscular disorders.

CMAP Scan MUNE MScan - A Novel Motor Unit Number Estimation MUNE Method

This protocol describes a new method to estimate the number of functioning motor units in a muscle, by fitting a model to a detailed stimulus-response curve of the compound muscle action potential. It is quick and easy to perform and analyze and has excellent reproducibility.

CMAP スキャン胸 (MScan) - 小説の運動単位数推定 (胸) 法

Like other methods for motor unit number estimation (MUNE), compound muscle action potential (CMAP) scan MUNE (MScan) is a non-invasive electrophysiologic ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

シンプルかつ強力な可視化と薬理学的ターゲットの評価法として放射線写真法

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...