Quantitative Image Analysis to Measure the mtDNA and Gene Expression Levels in the Transfected HeLa Cells

トランスフェクトされたHeLa細胞のイメージングを開始するには、イメージングソフトウェアによって生成された強度ヒストグラムに基づいて、ライブビューモードで個々の蛍光チャネルに対して十分に長い露光時間を選択します。Z 軸でのイメージングに適した平面数を設定します。ウェルごとに表示する適切な数の視野を選択します。

取得した画像の定量分析を開始するには、すべての蛍光チャンネルからのすべての画像に対してバックグラウンド補正を実行します。分析されたオブジェクトのサイズに応じて、適切なフィルターサイズを選択します。次に、細胞核に対応するチャネルの背景に対する蛍光シグナルの強度の比に基づいて主物体のマスクを作成することにより、画像セグメンテーションを開始する。

BrdUおよびミトコンドリアDNAスポットを表すサブオブジェクトのマスクを、所定の構造に適した蛍光チャネルを使用して作成します。パラメータを設定し、すべての蛍光チャンネルの各マスク内の個々のピクセルの強度を測定します。BrdUまたはミトコンドリアDNAチャネルの総蛍光強度を取得するには、特定の細胞核に割り当てられたすべてのサブオブジェクトの強度を合計します。

平均蛍光強度を得るには、総蛍光強度を、所与の細胞核に割り当てられたサブオブジェクトの面積の合計で割る。イメージング結果は、定量的リアルタイムPCRを用いてミトコンドリアDNAおよび遺伝子発現レベルを測定することによって検証された。ジデオキシシチジンまたはDDCによる治療は、ミトコンドリアDNAレベルの非常に強い減少をもたらしました。

TFAMおよびTWINKLEヘリカーゼサイレンシングでは弱い効果が観察されましたが、ミトコンドリアDNAポリメラーゼγまたはPOLG siRNAによる細胞のトランスフェクションは、ミトコンドリアDNAコピー数にわずかな影響を及ぼしました。TFAMおよびTWINKLEヘリカーゼの発現を定量すると、mRNA発現が対照レベルの約15〜20%に効率的に低下することが確認されました。POLGでは、mRNA発現は30%までしか減少しなかったこれは、ミトコンドリアDNAコピー数に対する予想外の適度な影響を説明しています。