Mouse Cardiac Progenitor Cell Isolation, Digestion, and Freezing

安楽死させた2〜6か月齢の妊娠雌マウスから解剖した胚を、1%ウシ胎児血清を含む冷たい完全培地に入れることから始めます。5倍の倍率で胚から子宮内膜組織、胎盤、卵黄袋を取り除いた後、鉗子を使用して胚性心臓領域から心臓前駆細胞を解剖します。5匹のマウス胚から解剖したすべての心臓領域を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで引き出し、摂氏4度に予め冷却したスイングバケットで遠心分離します。

上清を除去し、1ミリリットルの組織培養グレードのPBSで組織を洗浄します。チューブを300Gで摂氏4度で1分間遠心分離します。その後、上清を除去し、1ミリリットルPBSで2回の洗浄を繰り返す。

完了したら、PBSを0.05%トリプシン-EDTAに交換します。遠心分離し、0.05%トリプシン-EDTAで2回の洗浄を繰り返します。組織を消化するには、50マイクロリットルの0.05%トリプシン-EDTAを加え、摂氏37度で10分間加熱します。

次に、ワイドオリフィスフィルターチップを使用して懸濁液を上下に吸引することにより、5分後に穏やかな機械的解離を適用します。解離した細胞に350マイクロリットルの完全培地を添加することにより、トリプシン消化活性を不活性化します。細胞懸濁液を40マイクロメートルの細胞ストレーナーに通します。

新たに解離した細胞懸濁液を遠心分離することにより、凍結用の細胞を準備します。上清を注意深く取り除き、ペレットを1ミリリットルの冷やした凍結培地に再懸濁します。細胞懸濁液を予冷したクライオバイアルに移し、クライオバイアルを予冷した凍結容器に入れます。

凍結容器をマイナス80°Cで4〜8時間置いてから、シーケンシング実験のために液体窒素に移します。