まず、凍結バイアルを含む凍結解離した胚性心臓細胞懸濁液を摂氏37度の水浴に1〜2分間入れます。解凍した懸濁液に摂氏37度で予熱した1ミリリットルの完全培地を加え、ピペットで3回混合する。次に、懸濁液を10ミリメートルの温かい完全培地を含む15ミリリットルの円錐管に移します。
細胞懸濁液全体を30マイクロメートルのストレーナーに通し、1〜2ミリリットルの温かい完全培地でストレーナーをすすぎます。同じ円錐形のチューブに流れを集めます。次に、チューブを300 Gで5分間遠心分離します。
上清を除去した後、ペレットをPBSで洗浄し、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。細胞懸濁液を遠心分離し、ペレット化された細胞に100マイクロリットルの提供された磁気マイクロビーズを加える。室温で15分間インキュベートする前に、幅の広いイノシシピペットチップを使用して懸濁液を5回ホモジナイズします。
それまでの間、磁気分離カラムを500マイクロリットルの結合バッファーですすいでください。インキュベーションが完了したら、500マイクロリットルの結合バッファーを使用してマイクロビーズ細胞懸濁液を希釈します。次に、0.6ミリリットルの細胞懸濁液を磁気分離カラムに加える。
生細胞流出液を15ミリリットルの遠沈管に回収します。次に、細胞懸濁液を収容した1.5ミリリットルのマイクロチューブを1ミリリットルの結合バッファーを用いてすすぎます。すすぎ後、結合バッファーを1.5ミリリットルのマイクロチューブからカラムに移し、同じ15ミリリットルのチューブに流出液を集めます。
1ミリリットルの結合バッファーを使用して1.5ミリリットルのチューブのすすぎを繰り返します。廃液を300Gで5分間遠心分離した後、細胞ペレットを破砕することなく上清を除去した。1ミリリットルのPBS BSA溶液を加え、幅の広いオリフィスピペットチップを使用してピペッティングして穏やかに混合します。
次に、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。再度、細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを破砕することなく上清を除去する。1ミリリットルのPBS BSAを2回繰り返します。
1ミリリットルのPBS BSAを除去した後、細胞を100マイクロリットルのPBS BSA溶液に再懸濁する。10回ピペッティングして混合します。トリパンブルーアッセイを実行して濃度を決定し、100, 000細胞以上の細胞数を確保し、細胞の生存率について蛍光ベースの評価を実行します。
解凍後に死細胞を選別して除去する追加のステップにより、細胞生存率が有意に高いよりクリーンな細胞懸濁液の調達が可能になり、出発サンプルの品質が向上しました。より正確にするために、トリパンブルーおよび生存率の蛍光ベースの評価を含む、細胞および核を定量するために2つの異なる計数方法を使用した。このプロトコルでは、細胞生存率が核分離前の80〜90%から核分離後の5%未満に通過したことが観察されました。
