トランスフェクトされたHeLa細胞の蛍光強度をImageJソフトウェアで測定するには、ファイルをクリックして開くを選択します。ダイアログ ボックスで、実験用のイメージング ファイルを選択し、[OK] をクリックします。バイオフォーマットのインポートオプションウィンドウが表示されたら、分割チャンネルを選択して[OK]をクリックします。
テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩、またはTMREの実験では、YFPが最初のチャネル、MitoTrackerが2番目のチャネル、TMREが3番目のチャネルです。画像を選択して明るさを調整し、次に明るさを調整します。次に、[分析]、[ツール]、[ROIマネージャー]の順にクリックして、保存した関心領域またはROIを読み込みます。
ROIマネージャーで、[その他]をクリックし、リストから開いて、保存したROIを選択します。次に、ROIマネージャーから保存されたROIを選択し、ROIをセル内のランダムな位置に移動して、1つのセル内の5つのランダム領域の蛍光強度を測定します。蛍光強度を測定するには、キーボードのMを押し、オーバーラップしない4つの領域を追加してこれを繰り返します。
領域と平均グレー値を含むダイアログ ボックスが表示されたら、値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けて分析します。TMREおよびMitoSOX蛍光強度の結果は、既知の脱共役剤CCCPによるそれらの処理が対照条件と比較してTMRE蛍光強度を低下させることを示した。さらに、20マイクロモルのCCCP処理はスーパーオキシド産生を誘導し、MitoSOX蛍光強度を増加させました。
軽度または5マイクロモルのCCCPストレス条件では、パーキン野生型およびパーキンT240Rの発現は、空のYFP対照ベクターと比較してより高いTMRE強度をもたらした。MitoSOX強度は、YFPコントロールベクターを発現する細胞と比較して、パーキン野生型およびパーキンT240Rを発現する細胞で低く、Parking発現がより高いミトコンドリア膜電位と低いスーパーオキシドレベルを維持することによってミトコンドリアネットワークの健全性を維持するのに役立つことを示唆しています。
