このプロトコルは、生細胞におけるミトコンドリア膜電位およびミトコンドリア質量の測定を可能にする単純なフローサイトメトリーベースのアッセイである。標準的な代謝アッセイは、造血幹細胞などの稀な集団で働くときに失敗する。この方法により、細胞数が少ない場合にミトコンドリア膜プロファイリングを行い、HSCなどの細胞の新規代謝モジュレーターを決定することができます。
また、骨髄移植やコロニー形成アッセイなどの下流機能アッセイと組み合わせて、培養後の細胞の機能性を決定することができます。我々の技術は、骨髄移植およびアブレーション療法後の造血免疫回復の文脈においてHSC機能を改善することができる新しい分子の同定に利用することができる。我々のプロトコルで述べたように、我々の方法は免疫T細胞の代謝適合性を評価するために使用することができる。
細胞が染色後に光への暴露を最小限に抑えることを非常に重要です。また、ポンプエフラックスの寄与を評価するためにポンプ阻害剤ベラパミルの使用を含める必要がある。しかし、ユーザーは、ベラパミルがイオン平衡を深く摂動し、ミトコンドリア膜電位に対する代謝変調器の効果を評価するために使用できないことを認識する必要があります。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、セル数が少ない場合に注意が必要な重要な手順がいくつかあり、ユーザーが PubMed で読む通常の文書では、これらの手順が非常に多く欠けているため、非常に重要です。FAC分類の場合、LKS集団は、リネージュネガティブ、Sca1陽性、cKit陽性によって定義される。LKS集団の約5〜10%の造血幹細胞は、HSCとして標識されたCD150陽性、CD48陰性集団の格言によって同定される。
造血幹細胞の選別後、摂氏4度で5分間300倍gのチューブを遠心分離する。ペレットを外さずに上清の大部分を静かに取り除き、細胞ペレットの上に50〜80マイクロリットルを残します。幹細胞拡張培地中の細胞ペレットを200マイクロリットルの最終体積まで再懸濁する。
96 U-底ウェルプレートを処理した滅菌組織培養を準備し、細胞が培養されるウェルを特定します。これらのウェルであらかじめ調製した2倍基底培地の100マイクロリットルを移す。よくマークされたNRで、100xニコチンアミドリボシド溶液の2マイクロリットルを追加します。
2x基底培地100マイクロリットルを染色制御用のウェルに移します。2x基底培地を含むウェルの上に調製された造血幹細胞の種子100マイクロリットル。染色制御としてマークされた井戸の全体骨髄細胞の種子100マイクロリットル。
細胞を含む井戸からの蒸発を減らすために、すべての周囲の井戸に200マイクロリットルのオートクレーブ水を加えます。プレートをインキュベーターに37°Cの2酸化炭素5%で72時間放置します。プレートを取り出して24時間ごとにニコチンアミドリボシドを補充し、インキュベーターに戻します。
培養期間の終わりに、100x TMRM溶液の2マイクロリットルと100x緑色蛍光染色液の2マイクロリットルを各試験井戸に加えます。TMRM染色制御に100x TMRMの2マイクロリットルを加えます。MitoTracker染色制御によく100x緑色蛍光染色の2マイクロリットルを加えます。
プレートの上部にアルミホイルを覆います。プレートを5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーターに45分間戻します。インキュベーターからプレートを取り出し、5分間300回gで遠心分離します。
プレートを反転して上清を除去し、200マイクロリットルの標準FACSバッファを追加して再中断します。プレートをホイルで覆います。プレートを300回gで5分間遠心します。
この洗浄工程を3回繰り返します。FACSバッファーの200マイクロリットルで細胞を再懸濁し、FACSチューブに移します。フローサイトメーターでサンプルを実行するには、まず単一のカラーコントロールをマシンにロードし、各イベントに少なくとも5,000個のイベントを1つずつ記録します。
ソフトウェアで、ダッシュボードの取得と記録を押して、単一のカラーコントロールを取得して記録します。[報酬の設定] を押し、[報酬の計算] をクリックして報酬を計算します。補償が適用されたら、造血幹細胞サンプルを取得し、できるだけ多くのイベントを記録します。
サイトメーターからFACSファイルをエクスポートし、解析ソフトウェア上のファイルを開きます。FlowJo では、前方散乱と側面散布のゲージを使用して、細胞の母集団を識別します。次のゲートでシングルを識別し、ライブセルを表すDAPI負の分数をプロットします。
生細胞ゲートでは、TMRMと緑色蛍光染色チャネルで輪郭プロットを行い、それぞれミトコンドリア膜電位と質量を測定します。ライブセルゲート内のこれら2つのチャネルの平均蛍光強度をエクスポートします。次に、TMRM 低ゲート内のセルの割合をすべてのサンプルにエクスポートします。
ニコチンアミドリボシド治療は、TMRM低集団の明らかな増加を示した。また、TMRM低ゲートにおける細胞の割合を有意に増加させ、TMRM蛍光強度の著しい低下を示した。ミトコンドリア質量はニコチンアミドリボシド補充時に変化しなかった。
さらに、幹細胞マーカー染色をミトコンドリア染色ポスト培養と組み合わせた。造血幹細胞を同定するゲーティング戦略では、ニコチンアミドリボシドへの曝露は、TMRMの低集団の有意な増加およびゲート化されたHSCにおけるTMRM蛍光強度の有意な減少を示した。緑色蛍光ミトコンドリア染色グリーンシグナルは、2つの条件で変化しないままであった。
染色したサンプルへの光の露出を最小限に抑えるために、染色板をアルミ箔で覆うことが重要です。この方法は、骨髄移植やコロニー形成アッセイなどの下流アッセイと組み合わせて、幹細胞の機能を決定することができます。したがって、この技術は、HSCの新規代謝変調器の同定のための簡単なスクリーニング方法を可能にする。
