本研究は、NIHの学内研究プログラム、歯科および頭蓋顔面研究所の国立研究所によってサポートされていました。

パート1：顕微鏡とイメージングのセットアップの準備<ol><li>任意の倒立型共焦点顕微鏡は、IVMのために適していなければならない。この研究においてFLUOVIEW-1000レーザー走査共焦点ユニットを備えたOlympus IX81倒立顕微鏡を用いた。可能な限り最高の分解能を達成するために、このような水浸UPLSAPO 60x/1.20 Na及び油浸プラン-アポ60x/1.42 NAの高NA対物レンズの使用は、推奨されます。油浸対物レンズは、高い捕集効率を有し、それらが組織と対物との間のカバースリップの使用を必要としているが、それらは、表面から15〜150μmに画像領域に使用されるより良好な画像品質を提供する。さらに、油の使用は、長いイメージングセッション中に水の蒸発の懸念を排除します。温度および湿度を維持するために、顕微鏡は完全に封入されるべきであり、暖かい、加湿空気が供給される。あるいは、動物、顕微鏡ステージ、及び目的は、他の手段によって温められている必要があります。例えば、化学熱パッドは動物およびステージのために使用することができ、特別に設計された対物レンズは、対物ヒータ（ 図1A）のために使用することができる。客観的なヒーターは、手順を開始する前に、30分に切り替える必要があります。メモ：熱パッドはガーゼパッドと皮膚の間に配置してい温める動物を保つために使用されたとき。皮膚が火傷のために監視する必要があります。 </li><li>市販の共焦点顕微鏡の最も標準的な段階ではスライド、ペトリ皿、および異なるサイズのプレートに適合するように使用される種々のホルダを挿入するために使用される開口部を有する。 IVMを行うために35mmのペトリ皿のための標準的なステージインサートは、その後、高真空シリコーングリース又はマスキングテープ（ 図1A）によって固定さの40mmスライドガラスで覆われ、逆さまに反転される。カスタムインサートはまた、厚さ3mmのアルミニウム板から製造することができる。ガラス表面は、その後のclである70％エタノールでeanedとキムワイプでスワイプ。 </li><li>のSGの固定化（安定剤）のためにカスタマイズされたホルダーを製造しています。ホルダーの目的の場所のSGとステージとカバーガラスにそれら厳格にカップルを安定化させることである。ホルダーを60mmプラスチックペトリ皿から作製することができる。まず、皿の底部は、壁から離れて破断し、約15×10mmの長方形に切断される。その後、エッジは目の細かいサンドペーパーを使って丸められ、研磨される。四つのスペーサー（1.5〜2ミリメートル）は1ミリリットルのシリンジプランジャーのゴムのヒントを削除することにより構築されています。細かいサンドペーパーを用いて、スペーサ及びプラスチック片の四隅の表面が研磨される。スペーサーは、その後、ゼラチン状瞬間接着剤を使用して接着され、後に平らな面に細かいサンドペーパーを使用して平滑化される。高齢の動物のために、ホルダとスペーサのサイズが若干大きく腺を収容するために増加されなければならないことに留意されたい。 </li><li>光結合ゲルの調製。 0.3％カルボマー-940（表2）ゲルを超純水100mlをウォーミングアップし、D-ソルビトール5.47gの溶解することによって調製される。その後、カルボマー-940の0.3グラムを加える。ビーカーを数時間、またはすべてのカルボマー塊が完全に溶解するまでカバーし、攪拌ホットプレート（最低ヒートセット）に配置する必要があります。穏やかに攪拌しながら約7.4のpHに達するまで最後に、Trietanolamineは、滴下する。ゲルは、C 13、4℃で保存する。 </li></ol>パート2：動物と麻酔<ol><li>動物とのいずれかの実験を実施する前に、プロトコルは、お近くの動物のケアと倫理委員会の承認を得なければならない。重要なのは、研究者は、外科手術を行うために適切な訓練を受けなければならず、手続きを進める前に、地元の動物管理委員会や教育機関の獣医師に相談してください。 </li><li>本研究では、マウスモデル（GFP / mTomato - マウス）は、可溶性GFP（GFP-マウス）を発現するFVBマウスを交配することによって誘導されるのWi蛍光タンパク質タンデムトマト（mTomato -マウス）6と融合し、膜標的化ペプチドを発現番目のC57B6マウスを用いた。注：それは通常、完全に麻酔し、イメージングのために準備になるために動物のために20〜30分かかり</li><li>マウスは、動物施設での管理された環境内に収納されており、実験前に1週間馴化させる。このステップでは、強化された分泌活性12内の任意の窮迫結果以来のSGを画像化するために必要である。水および食物を自由に与えている。 2-5ヶ月齢の雄を画像化実験（20〜30 g）のために使用される。 </li><li>麻酔の前に、麻酔薬の適切な用量を決定するために動物の重量を量る。 </li><li>注射用麻酔薬の投与によって誘導される応力が前記SGsの分泌活性を損なうことがあるので、麻酔薬の注射に続いて、イソフルラン吸入により麻酔を予め誘導する。この目的のために、非常に穏やかに蒸発器チャンバ内にマウスを置き、酸素流量（800〜900 mmHgの）をオンにします。前麻酔導入を開始するために3％イソフルランレベルを設定します。 </li><li>動物が意識不明になったら、腹腔（25 G針）に100 mg / kgのケタミンおよび20 mg / kgのキシラジンの混合物を注入する。麻酔薬は、新たに生理食塩水中20 mg / mlの100 mg / mlのキシラジンを希釈し、次いでケタミンと混合することにより調製される。この混合物をさらに食塩水で1:1に希釈され、適切な量は、動物の体重に基づいて、注入される。この希釈は、偶発的な過剰摂取を防止するのに役立ちます。混合物を20分後にその有効性を失うことに注意してください。 </li><li>覚醒の兆候のために動物を観察し、麻酔から出てきている場合（その後、最初の注射後45分以内に初期投与量の約75％、および50％毎時）より麻酔薬の混合物を注入する。足をつまんし、応答を観察することによって、麻酔の深さは15分ごとに確認してください。注意：必ず防ぐために眼軟膏を管理する目の乾き。 </li><li>麻酔薬は、実験の再現性と動物の健康に影響を与えることができ、低体温を誘発する。したがって、マウスは、加熱ランプ下または実験の全期間加熱パッド上に維持されるべきである。注：加熱ランプは燃焼を防止するために、動物から少なくとも12〜18インチでなければなりません</li><li>動物の体温は直腸温度プローブを備えた温度計でモニターされなければならない。 </li></ol>パート3：生体顕微鏡用の動物の手術とポジショニング<ol><li>清潔で滅菌されていなければならないすべての手術器具（ 表1）でワークスペースを準備します。 </li><li>電気バリカンでマウスの首の領域を剃る。 70％エタノールに浸したガーゼスポンジで麻酔マウスの首部の腹側を下に拭いてください。キムワイプで余分を乾かします。 </li><li>鈍い湾曲したピンセットは正中線（近似で皮膚の小片を持ち上げてmately咬筋の下端）と、小切開（ 図1B）を作る。 </li><li>開口部にはさみを入れ、はさみの刃を開くことで、離れて下にある組織から皮膚を分離する。皮膚の下の方にハサミを向けることによって、基礎となる腺組織の損傷を防ぐ。皮膚がより深い組織（ 図1B）から分離されるまで、この手順を数回繰り返します。 </li><li>はさみを使用して、幅約3ミリメートルと10ミリメートル長い緩んだ皮膚のストリップを切り出す。開口部は神経、ダクトや血管が体の他の部分にグランドを接続するのSGのベース付近で開始するように皮膚をカットする必要があります。創傷領域を洗浄した後、得られた開口部の形状は楕円形でありかつ約8×12 mmで測定する。両方SGSは開口部（ 図1B）の後に表示されます。 </li><li>注射器で切断の途中に光結合ゲルを適用し、手前に拭く滅菌ガーゼで外に。ガーゼのクリーン片それぞれに使用すべきで露出した組織への血液又は毛髪の導入を防止するためにワイプ。すべての血液や抜け毛が除去されるまで、この手順を繰り返します。 </li><li> ＃7ピンセットを使って、離れて右顎下腺からの結合組織（あるいはこのプロトコルは、左のSGで使用することができます）腺のベースにすべての方法を分離する。まず、SGの先端を見つけ、数ミリ腺の先端の上に結合組織をつかむ。実質を傷つけることなく腺周囲の結合組織を引き裂く。 （ 図1B）。腺が露出されると、そっと腺から結合組織を分離する。出血が発生した場合は、生理食塩水で血を洗い流す。すべての結合組織を分離し、腺が完全に露出していることを確認してください。定期的に光結合ゲルを適用することにより、湿った腺を保管してください。 </li><li>顕微鏡に動物を持って来る前には、ガーゼの厚切りとHEAを配置tは38±2℃の温度を維持するために、顕微鏡ステージ上に詰める化学熱パックの温度が大気中に内袋を露出させるカットの大きさによって調整することができる。ガーゼは、金属ステージからの熱パックの一部の絶縁を提供します。だけでなく、ガーゼの薄片と熱パックの上部をカバーしています。 </li><li>その側面（右腺用右側）にし、ガーゼの上に動物を配置します。カバーガラス（ 図1C）の中央に配置顎下唾液腺で動物を置きます。 </li><li>動物は腺を固定化する前に、固定されており、この位置で安定させてください。マウスの右フロントの足の腹側にマスキングテープの一部を配置します。絹縫合糸（ 図1C、挿入図）によって、マウスの門歯を引っ掛けます。絹糸と足の間にいくつかの緊張を作成し、マスキングテープでステージに取り付けます。 SGは、途中で自然に静止されるべきであるカバースリップ。頭部と胸部は、さらに、ステージに結合することができるプラスチック楔によって安定化されるべきである。 </li><li>腺（ 図1C）を介して組織をレンズクリーニングの小片を置きます。少し腺を拡張し、グランド上でカスタマイズされたホルダーを配置します。マスキングテープでステージに密に結合安定剤。カップリングは、ステージ（ 図1C）に接続された金属クランプを向上させることができる。それらは血流を損なう可能性がある張力と鋭角は避けるべきである。安定化は、（それがピンク色の着色を保持すべきで）視覚的に腺を調べることによって、または落射蛍光のいずれかによって血流を検査した直後。血管や血液細胞のいくつかの両方をm-トマトで標識されているのでGFP / mのトマトマウスにおいて、血流の総変化は、容易に評価することができる。 </li><li>ガーゼ、加熱パッドで動物をカバーしています。 wを備えた温度計を使用して、露出した腺の温度を測定i番目の露出した腺の一方の側と接触して配置小さなフレキシブル熱電対プローブ。 </li></ol>パート4：撮影パラメータ<ol><li> GFPまたはRFPフィルターセットを用いてのいずれかによって腺の表面に落射蛍光照明焦点の使用。 SGの表面を発見し、毛細血管の血流や組織の全体的な形態を評価します。組織損傷の兆候は、膜ブレブ形成や大きな空胞の出現が含まれています。 </li><li>どちらエピ蛍光を介して、または選択した領域を事前にスキャンすることで組織の安定性を評価する。モーションアーチファクトのほとんどが処理後データ分析で除去又は補正することができないので、安定した調製物は、必須である。製剤が安定していない場合は、調整が必要である。 </li><li>適切な焦点面画像をプリスキャンモード（1×ズーム）内腺を見つけ、徐々に腺房構造、分泌顆粒とpまでカバーガラスに向けて目標を移動するにはlasma膜（ 図2）はっきりと見えるようになる。 </li><li>タイムラプス用撮像パラメータは、個々の実験に依存しています。イメージに分泌顆粒のダイナミクスは0.5〜2秒/フレームの走査速度を使用し、0.2ミクロン/ピクセル空間スケール（約50μm×50ミクロンの視野）で256×256ピクセル。最適には、顆粒及び原形質膜を可視化するために、光学的厚さは0.9〜1.2ミクロンの間に設定されるべきである。 GFPおよびタンデムトマトを励起するためには、それぞれ、488 nmおよび561 nmの波長を使用することができる。ピーク電力は488 nmおよび561 nmのための1ミリワットの周り0.5ミリワットに設定されている。これは、最小限の光退色を保証します。 </li><li>検出器の設定はダイナミックレンジ内に信号を維持し、検体の輝度に依存して調整されなければならない。 </li><li>すべてのパラメータが設定されると、撮影を開始することができる。まず、基準点として使用される視野のスナップショットを取る。同時に時間経過でのイメージング、X-YおよびZの中の組織のドリフトが発生することがあります。これは、手動でスキャン領域及びZ位置を調整することによって補償することができる。調整は徐々に少しずつ成果物を避けるためになされるべきである。また、参照画像は、光退色が発生するかどうかを決定するために使用することができる。有意な光退色が（蛍光以上の15〜20％減少）が検出された場合、0.1ミリワットによってレーザパワーを減少させる。 </li><li>生理食塩水中のイソプロテレノールの新たに調製した溶液の皮下注入0.1 mg / kgで、エキソサイトーシスを刺激する。エキソサイトーシスは、注射後約1分でトリガされます。原形質膜と融合する分泌顆粒は、顆粒の周りにGFP蛍光の増加およびそれらの制限膜にタンデムトマトペプチドの拡散（ 図3）によって検出される。私たちは、同じエリア内3-4タイムラプスシーケンス、10分ごとの取得をお勧めします。 </li><li>撮像セッションの後、ANEを安楽死させる安楽死室内のCO 2吸入（10分10月12日mmHgの）ことにより、動物をsthetized。 </li></ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Dunn, K. 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Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li><li>Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+exocytosis:+novel+insights+from+intravital+microscopy.">Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy.</a> Traffic. 13, 627-634 (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents.">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9, 1801-1810 (2008).</li><li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium:+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals.">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).</li><li>Sramkova, M., Najman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+you+need+to+know+about+intravital+microscopy:+A+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, (2012).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+image+membrane+trafficking+in+live+rats.">Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats.</a> Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).</li><li>Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport.">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> Intravital. 1, 44-53 (2012).</li><li>Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+excitation+microscopy+in+intact+animals.">Multi-photon excitation microscopy in intact animals.</a> J. Microsc. 222, 58-64 (2006).</li><li>Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+morphology+and+functional+dynamics+of+vital+murine+intestinal+mucosa+revealed+by+autofluorescence+2-photon+microscopy.">Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).</li><li>Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degranulation+of+rat+salivary+glands+following+treatment+with+receptor-selective+agonists.">Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).</li></ol>

これまでのところ、細胞内構造は、 インビトロ （ すなわち 、細胞培養）またはex vivoで （ すなわち 、臓器培養、組織切片、腺房の準備）は、多くの場合、完全な生体組織6の特性を再現しないモデル系で主に画像化されています。それは生きているマウスでは、特定の膜輸送の段階（ すなわち規制エキソサイトーシス）の動態を画像化することが?...

過去20年間で、ライブ顕微鏡の出現と蛍光タンパク質の使用は、細胞生物1の我々の理解を進め、ありとあらゆる細胞プロセスに大きなブレークスルーにつながっている。このフィールドには、それは実験操作に来る場合は特に、非常に強力なモデル系である哺乳動物細胞培養の使用から途方も恩恵を受けている。しかし、彼らはしばしば、複雑な多細胞生物2の生物学の真の表現を提供していません。この問題は、このような神経生物学、免疫学、腫瘍生物学の3などの分野で重要な生物学的な質問を調査への扉を開いた生体顕微鏡（IVM）の開発によって対処され始めている。今のところ、IVMに基づいて、研究のほとんどは、細胞内区画の動力学に関する情報を提供せずに、組織および個々の細胞のレベルで行われている。最近では、我々の研究室や他のsは、生きたげっ歯類4-7に13〜15細胞内構造を画像化およびインビボでの薬理学的および遺伝的操作を可能にすることができるIVM技術を開発した。このアプローチは、 インビボで膜輸送を研究し、より具体的には、エンドサイトーシスおよび調節性エキソサイトーシス6,7するために我々が使用されている。 我々の実験モデルシステムは、麻酔をかけたげっ歯類の顎下唾液腺（SGSに）安定化とイメージング、露光に基づいています。 IVMのモデル器官としてのSGの選択は、腺小手術を行うことで、容易にアクセス可能であるという事実に起因して、その生理機能を損なうことなく外部化、ハートビートと呼吸によるモーションアーチファクトを低減するために安定させることができる。また、SGsアソシエイトを選択的に唾液管8,9を介して、ウイルスまたは非ウイルスベースのベクターのいずれかを注入することにより、遺伝的に操作することができる。最後に、SGSは偏epithで構成される外分泌腺である腺房や導管、筋上皮細胞、間質細胞の複雑な集団を形成elial細胞。このため、彼らは我々の最近の研究10で強調されているように、エキソサイトーシス、エンドサイトーシス、遺伝子送達、およびアクチン細胞骨格を研究し、そのような細胞極性、細胞分裂、細胞などの細胞生物学の側面を研究する機会を提供するための優れたモデルである細胞間結合、およびイオンチャネル。 本論文では詳細に生きたマウスののSGの上皮で細胞内分解能を達成するための撮影プロトコルを記述します。具体的には、どのように画像を調整されたエキソサイトーシスの間のSGの腺房細胞内の分泌顆粒をするには、show。以前に示されているように、β-アドレナリン受容体のアゴニストで刺激すると、分泌顆粒は、頂端形質膜と融合し、徐々に崩壊し、腺房細管6にその内容を解放する。私たちの目標は、Mと研究者に基本的なツールを提供することです外科的処置の動物取り扱いのinimal経験、それらが正常に細胞内解像度でIVMを実行できるようにします。 IVMの中で最も困難な部分が動物の製造であるので、ここでは、その機能を損なうことなく、SGSに公開し、固定化するために利用されている基本的な手術手順の説明に重点を置いています。全身性蛍光プローブの送達は、トランスジェニック動物の使用、または両方の組み合わせとして細胞内構造、いくつかの戦略を標識するための手順としては、他の箇所に記載されている7,11。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflourane (Forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>101936-40</td>
			<td>Handle under chemical hood</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine (ketaved)</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health</td>
			<td>57457-034-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Akorn, Decatur</td>
			<td>61311-481-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neomycin/Polymyxin B</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>24208-785-55</td>
			<td>Use to lubricate the eye of the mouse</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbomer-940</td>
			<td>Ashalnd, Inc.</td>
			<td>4607-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td>Add drop wise to prevent the solution to solidify</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoproternol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16504</td>
			<td>Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 &deg;C</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>190AF</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Portable Downdraft table equipped with HEPA filter</td>
			<td>Hazard Technology</td>
			<td>PDDT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat lamp, Model HL1</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>HL-1 US</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MicroTherma 2T Thermometer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TW2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Operating Scissors (11.5 cm straight</td>
			<td>World Precision Instruments </td>
			<td>5003708-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#7 curved tip tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14187</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black Braided Silk suture #4.0</td>
			<td>George &amp; Tiemann &amp; Co</td>
			<td>160-1219-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gauze sponges 2" x 2"</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins

ここでは、共焦点生体顕微鏡を使用することに基づいているライブげっ歯類における画像細胞内構造に手順を説明します。彼らはいくつかの利点を提供するため、モデル機関として、我々は、生きたマウスの唾液腺を使用しています。第一に、それらは容易に光学素子へのアクセスを可能にするために露出し、心拍及び呼吸によるモーションアーチファクトの低減を促進するために安定させることができる。これは大幅に画像化し、小さな細胞内構造を追跡を容易にします。第二に、唾液腺の細胞集団の大部分は、器官の表面からアクセス可能である。これは、二光子顕微鏡などのインビボイメージングのために使用されている他の技術よりも高い空間分解能を有する共焦点顕微鏡の使用を可能にする。最後に、唾液腺、容易にこのようにして分子レベルでの生物学的プロセスを調査する堅牢なシステムを提供し、薬理学的および遺伝的に操作することができる。 本研究では、腺房細胞内の分泌顆粒のエキソサイトーシスおよび分泌顆粒は、β-アドレナリン受容体の刺激により融合頂端細胞膜のダイナミクスの動態に従うように設計されたプロトコルに焦点を当てています。具体的には、細胞質ゾル、GFP蛍光タンパク質タンデムトマトと融合した膜を標的とするペプチドを共発現するトランスジェニックマウスを使用していました。しかし、我々は唾液腺を安定させ、画像に使用する手順は、他のマウスモデルに拡張し、そのようなエンドソーム、リソソーム、ミトコンドリアなどの様々な細胞内構造の可視化を可能にする、in vivoでの細胞成分を標識する他のアプローチに結合することができ、アクチン細胞骨格。

GFP / mTomatoマウスでは、腺房細胞質ゾル、GFPと膜を標的とタンデムトマトペプチド（ 図2、破線）を発現するよう明確に異なる構造を、表示されます。個々の腺房では、腺房細胞は、タンデムトマトペプチドによって描写されています。 GFPはまた、腺房細胞（ 図2、矢印）の内部にはっきりと見える核において検出される。細胞質ゾルGFPは、直径約1〜1.5程度の暗い円?...

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Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

生体顕微鏡は、生きた動物の様々な生物学的プロセスを画像化可能にする強力なツールです。この記事では、生きたマウスの唾液腺では、このような分泌顆粒として細胞内構造のダイナミクスを画像化するための具体的な方法を提示する。

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.5K ビュー.  National Institutes of Health. 生体顕微鏡は、生きた動物の様々な生物学的プロセスを画像化可能にする強力なツールです。この記事では、生きたマウスの唾液腺では、このような分泌顆粒として細胞内構造のダイナミクスを画像化するための具体的な方法を提示する。 

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Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

生物学

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

の蛍光標識ショウジョウバエハートの構造

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

生細胞で蛍光タンパク質とのデュアルプローブ光の強調表示を精製の光変換

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Aggresome のような誘発構造で退色の黄色蛍光タンパク質タグ p62 後の蛍光回復

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...