犠牲にした妊娠中のマウスを解剖板の背中に置くことから始めます。鉗子を使用して、腹部の正中線をつまみます。鋭いハサミで、腹部を皮膚を通して、そして性器から胸郭まで正中線を越えて腹膜を切ります。
胚を含む子宮を取り除き、すぐに氷の上に置きます。胎盤側の卵黄嚢を慎重に切り、胚を取り除きます。次に、斬首された胚の頭をカルシウムとマグネシウム欠乏HBSSを含む氷皿に入れます。
頭を左向きの35ミリメートルの皿に入れます。鉗子の端で片方の目を突き刺し、もう片方の目であごをしっかりと保持します。頭皮の皮膚をうなじから正中線に沿って鼻に向かってそっと引き裂きます。
角度の付いた鉗子を使用して白い楕円形の脊髄から入り、正中線に沿って頭蓋骨を割って開き、脳を露出させます。頭蓋骨を側面からそっと剥がします。次に、脳を頭蓋骨から持ち上げ、頭蓋骨を処分します。
鉗子を使用して髄膜を取り除きます。2ミリリットルのカルシウムとマグネシウム欠乏HBSSを含むビジューに脳を置きます。250マイクロリットルの10Xトリプシンをビジューに加えます。
ビジューを振って脳を粉砕し、摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、各ビジューに2ミリリットルの大豆トリプシン阻害剤を追加します。振って阻害剤を均一に分散させます。
遠心分離せずに、各ビジューから2ミリリットルの上清を15ミリリットルの遠沈管に移します。5ミリリットルの注射器に取り付けられた19ゲージの針を使用して、懸濁液を2回吸引し、ビジューの残りの細胞を粉砕します。21ゲージの針で吸引を2回繰り返します。
23 Gの針を使用して、細胞をビジューから細胞上清を含む15ミリリットルの遠沈管に移し、200 Gで室温で5分間遠心分離します。5ミリメートルの血清学的ピペットを使用して、ペレットを乱すことなく、すべての上清を新しい15ミリリットルの遠沈管に移します。遠心分離を繰り返します。
両方の遠心分離ステップから組み合わせたペレットを含むチューブに10ミリリットルのメッキメディアを追加し、よく混合して懸濁液全体を作成します。細胞をトリパンブルーで染色し、血球計算盤またはセルカウンターを使用してカウントします。必要量のマウスE17胚性脳細胞懸濁液をウェルプレートに加えることによって細胞をプレートする。
細胞を摂氏37度で5〜7%二酸化炭素下で2〜4時間インキュベートします。培地を除去した後、新しい分化培地を各ウェルに追加します。滅菌ピペットチップを使用して、フローティングカバースリップを押し下げます。
上清の一部を除去し、週に3回、新鮮な分化培地と交換することにより、培養を維持します。発生マーカーとしてのNG2およびネスチン、神経細胞マーカーとしてのSMI31、MBP、およびNeuN、ならびにグリアマーカーとしてのCNP、GFAPおよびIba1の免疫蛍光染色により培養物を可視化した。 神経向性セムリキフォレストウイルスによる培養物の感染は、希突起膠細胞およびニューロンに影響を与えた。感染細胞のqRT-PCR調査では、インターフェロンベータで処理した培養物における走化性サイトカインCcl5 mRNAのアップレギュレーションが示されました。
ELISA研究では、上清中のCcl5の増加が示され、mRNAとタンパク質発現の相関関係が示されました。単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー研究では、細胞の70%が生存可能であることが示されました。多数のミクログリア、ニューロン、および星状細胞が存在しましたが、希突起膠細胞は最も豊富ではありませんでした。
