我々は器官のスライス培養系とヴォルフガングヒューと原稿の重要な読書のためのLiviuガブリエルBodeaを確立する彼らの助けのためにマルティーヌEmondとイザベルBrachmannに感謝。我々は、ShhのCreERマウスのためのR26レポーターマウスとクリフTabin用フランクコンスタンティーニに感謝します。本研究では、ノルトラインヴェストファーレン州（PROGRAMMツアFörderungルワールRückkehrデwissenschaftlichen Spitzennachwuchses AUS DEM Ausland）の科学研究省から研究賞によって資金を供給された。

このプロトコルの部分はダサらから変更されています。、2007 7。 1。準備<ol><li>前日調製することができる<ol><li> ：1Xクレブスバッファー（1.5 L）を準備 126 mMのNaCl、2.5mMのKClを、1.2 mMのはのNaH 2 PO 4：H 2 O、1.2 mMのMgCl 2、2.5mMのCaCl 2を 、11 mMグルコース、25mMのNaHCO 3水溶液は 、7.4にpHを調整する。滅菌フィルター（0.22μm孔径）と4℃で保存します。 </li><li> 5 mLのHBSS、9 mLのDMEM高グルコース、30％グルコースの850μL、5 mLのウマ血清（25％）：培養液を（20mL）を準備します。 200μL100X Penicllin /ストレプトマイシンを追加。 4℃で保存します。 </li></ol></li><li>解剖を開始する前の準備<ol><li> 1Xクレブス緩衝液中4％低融点アガロース（LMPアガロース）を100 mLの調製：マイクロ波ソリューションをアガロースが完全に溶解し、次いで45℃の水浴中にアガロースを配置されるまで。 </li><li>振動を埋める登米市バッファの氷冷した1 ×クレブスバッファーとトレーと（4℃に保つ）冷却素子を開始します。ブレードキャリアのかみそりの刃を固定して、メス、細かいブラシとスライスを拾うミニ穴あきスプーンでビブラトームエリアを設定します。スライスを収集するために1 ×クレブス緩衝液と滅菌ペトリ皿（35 × 10 mm）を用意します。氷上に置きます。 </li><li>解剖のための滅菌ペトリ皿（100 × 15 mm）と小型滅菌ペトリ皿（35 × 10mm）を埋め込み、小さなはさみ、二つの微細な鉗子（デュモン5）、ミニ穴あきスプーン、ガラスと解剖の領域を設定するラウンドで研磨パスツールピペットの火災は、氷の上でヒントと1Xクレブス緩衝液1 Lを閉じました。 70％エタノールですべての解剖ツールを拭きます。 </li><li> 6ウェルプレート（1.5 mLの/ウェル）のウェルに培養液を追加し、37℃のインキュベーターに入れてください。 </li><li> 1.5 mLの/ウェル滅菌1Xクレブスバッファーおよび15μLPenicilin /ストレプトマイシン（100X）/ウェルで6ウェルプレートを準備します。無菌条件下で、ミルを配置各ウエルにlicellのセルカルチャーインサート。脳スライスがすぐに切削後はフィルター膜に転写することができるようにビブラトームの隣に6ウェルプレートを置きます。 </li></ol></li></ol> 2。胎児の脳の解剖と埋め込み<ol><li>イソフルランを使用して妊娠した雌マウスを麻酔し、（胚の段階E12.5にあるはずです）頚椎脱臼によりマウスを犠牲にする。鉗子で子宮を引き上げて、マウスの子宮をばらばらにする。子宮から子宮間膜を分離するために他のピンセットを使用してください。氷冷した1 ×クレブス緩衝液中で子宮を置きます。胚から子宮、ライヒェルトの膜と内臓卵黄嚢の筋肉壁を分離するために微細な鉗子を使用してください。子宮から胚を削除します。滅菌1Xクレブスバッファーを持つ別のシャーレに切除した胚を置きます。 </li><li>実体顕微鏡下で脳を解剖。脳を解剖するには、まず胚の頭部を切断。頭を修正頭部（目の高さ）によって微細な鉗子を刺すことによって。慎重に皮膚や頭蓋骨を削除するには、鉗子の別のペアを使用してください。慎重に脳を持ち上げ、滅菌1Xクレブスバッファーを持つペトリ皿にそれを転送するために鉗子を使用してください。それは、脳組織への損害賠償はビブラトームで切片中に問題（例えば、組織の破砕など）を作成するので、脳全体の整合性は、解剖中に維持されることが非常に重要です。 </li><li> 1回4％低融点（LMP）アガロースの脳を洗ってください。新鮮な4パーセントLMPアガロースの時点で2〜3頭を埋め込みます。さらに可能な限り氷上で埋め込む皿を置きます。アガロースの底部が固化されるまで、脳を持ち上げるためにファイアーポリッシュラウンドチップでパスツールピペットを使用してください。脳には、アガロースブ​​ロックの底部に水平フラット位置に落ち着くはず。 </li><li>アガロースが完全に（約3分後）固化した後、アガロースは、試料ステージに脳と接着剤アガロースブ​​ロック周囲のトリムビブラトームの。ときに接着ブロックが、脳を水平断面でカットする必要があるので、脳の腹側には、プラットフォームに平行であることを確認してください。 </li></ol> 3。切片ビブラトーム<ol><li>セクショニングのかみそりの刃を使用してください。そのままスライスを得るためには、セクショニング時に4℃で温度を維持するために非常に重要です。 </li><li> 50ヘルツの周波数でセクション300μm厚の水平スライス、ブレード1.1mmの振幅および25mm /秒の速度。 </li><li>脳スライスを収集し、滅菌、氷冷1Xクレブスバッファーで皿にそれらを転送するためにミニ穴あきスプーンでスライスをプッシュする微細な絵筆を使用してください。 （ 図1を参照）腹側中脳の組織を含むスライスを選択してください。 E12.5マウスの脳ではドーパミン作動性ニューロンを含む腹側中脳の組織が含まれている一つ300μmの水平スライスがあります。 </li></ol> 4。スライスの文化ステップ4.2から4.5は、無菌条件下で行う必要があります。 <ol><li> 1 ×クレブスバッファー（ポイント1.2.5を参​​照）で6ウェルプレートでMillicellの細胞培養膜インサート上の脳切片を移す。スライスを転送するには、ミニ穴あきスプーン（ファイン科学のツール）と微細なブラシを使用してください。最大3スライスが一つの膜上に配置することができます。 </li><li>培地で6ウェルプレートにスライス（ポイント1.2.5を参​​照）を持つ膜を転送する。膜の上部には、培地によってカバーされるべきではない。脳スライスは上から下と空気から培地を受け取ります。 </li><li> 37℃5％CO 2でインキュベーターで6ウェルプレートを配置℃にそれは、スライスが解剖の最初のステップの後2時間以内にインキュベーターに配置されていることを非常に重要です。より拡張された準備時間は、スライスの生存率が低いことになる可能性があります。 </li><li>スライスは、3日前までin vitroで維持することができます。第2日目に培地の50％を変更します。 </li></ol><ol><li>タイムラプスイメージングを開始する前に、スライスは4〜5時間インキュベーターにリカバリできます。 </li><li>タイムラプスイメージングのために、メンブレンインサート上のスライスを保ち、35ミリメートルIbidiのμ-皿（皿の底は、高い光学的品質を有する材料から構成される）への挿入を移す。 </li><li>皿に培地を1mL加え、1.5μLアスコルビン酸（200 mm）を追加します。アスコルビン酸は、光毒性に対するスライスを保護します。 </li><li> 37℃の環境室内のスライスをインキュベート° Cタイムラプスイメージングの間に5％CO2で。 </li></ol> 6。代表的な結果 図1は、E12.5マウスの脳から器官切片培養の準備を示しています。 図2は、水平方向の器官型スライス（急性と文化の数日後に）得られるフォームE12.5マウスの脳を示しています。同等の発達段階での比較のために、凍結脳切片示されています。中脳ドーパミン作動性ニューロンは、チロシン水酸化酵素（TH）の免疫組織化学と視覚化されます。中脳ドーパミン作動性ニューロンのプロジェクト前脳内のターゲットに。これらの予測は12.5日で形成し、その後の日中に脳に向かって拡張するために始めます。我々は、培養中のドーパ​​ミン作動性ニューロンの正常な開発のための良い指標として脳の突起の発達を考慮してください。水平スライスの中脳ドーパミン作動性ニューロン内の適切な前脳のターゲット領域に向かって突起を延長する。 3 DIV（in vitroでの日数）場合や、前脳の対象領域が損傷された後、異常な突起は背側中脳に向かって延びている。 E12.5中脳の冠状スライスの例を図3に示されています。ドーパミン作動性ニューロンは、THは、背側中脳に異常な突起を拡張するための免疫染色で可視化した。 図4器官切片培養における増殖、壊死とアポトーシス細胞の分析を示しています。 BrdUのIM増殖細胞を可視化するmunostainingは、細胞が1 DIVの後に培養条件下で増殖することを示しています。増殖は4 DIVの後に削減されます。 3 DIVの後、腹側中脳の多くの細胞が壊死（ヨウ化プロピジウム染色）とアポトーシスを（切断されたカスパーゼ3の免疫染色）を行います。 図5は、急性スライスのタイムラプスイメージングの実験に、監視YFP標識ニューロンの回遊経路を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig1.jpg" /> 図1。器官切片培養の準備を示す回路図。 300μmの水平方向の脳のスライスをビブラトームを用いてE12.5脳を切片によって調製される。 E12.5マウス脳の（A）の回路図矢ビュー。セクションのレベルが示されます。ドーパミン作動性ニューロンを含む領域がピンク色で描かれている、予測は青色で表示されています。 （B）腹側と股関節に背側から得られる3つのスライスの回路図は、tは前脳（FB）と中脳（Mb）の両方が含まれています。 1つのスライスがドーパミン作動性ニューロン（スライスb）を含むことに注意してください。適切なスライスは、心室の位置と中脳と前脳組織（矢印、セクションAとCとセクションBを比較）の連続性に基づいて識別することができます。ドーパミン作動性ニューロンを含む領域がピンク色で示され、ドーパミンの前駆体を含む領域は、開発の予測を示す緑、青の矢印で描かれている。 （C）ドーパミン作動性ニューロンを含むスライスを膜インサート上で培養される。略語：VMB、腹側中脳、DMB、背側中脳、HYP、視床下部、ヘモグロビン、後脳。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig2.jpg" /> 図2。器官切片培養における中脳ドーパミン作動性ニューロンの予測は、前脳の整合性に依存しています。ドーパミン作動性ニューロンを標識するためにチロシンヒドロキシラーゼ（TH）の免疫組織化学。 （A）急性スライス（0 DIV）腹側中脳のドーパミン作動性ニューロンの正常な位置を示している。白い矢印は、はめ込みの高倍率で表示されている領域を示します。前脳への投射は未だ開発されていない。 1 DIVの後、前脳に突起が形成され始める。の予測は2-3 DIVで前脳に拡張する。白い矢印は、インセットの高倍率（白枠）に示すように細胞体の位置を示している。黄色の矢印は、インセットの高倍率（黄色枠）に示すようにそのままのスライスで、通常の予測を強調表示します。異常な予測は、損傷した脳を持つスライスに開発する。赤い矢印は、インセットの高倍率（赤枠）に示すように背側中脳への異常な予測を示している。ダメージは赤いアスタリスクで示されます。 3 DIVの後、ほとんどのスライス（N = 5 / 7）背側中脳に向かって異常な突起を持っていた。 （B）の異なる発生段階において水平凍結脳切片の免疫染色THは、開発を表示するin vivoでのドーパミン作動性投射の。白い矢印は、インセットの高倍率（白枠）に示すように細胞体の位置を示している。黄色の矢印は、インセット（黄色枠）の高倍率に示すように突起の位置を強調表示します。凍結切片のレベルと密接器官切片培養のレベルに合わせて選ばれた。単一の凍結切片（12μm）と全体の器官型スライス（300μm）を表していないことに注意してください。従って、E13.5およびE14.5に示すように、突起が細胞体（黄色のアスタリスク）を含むセクション以外は120μm以上の腹側の節で観察された。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig3.jpg" /> 図3。ドーパミン作動性ニューロンのマーカーとしてのチロシンヒドロキシラーゼ（TH）のために染色した中脳冠状切片培養。 1、2または3 DIVの後（AC）のスライス。ドーパミン作動性ニューロンは背側中脳（Rに向かって異常な突起を開発するedの矢印）。矢頭は、ドーパミン作動性細胞体の位置を示しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig4.jpg" /> 図4中脳器官切片培養における細胞増殖と細胞の生存。 （A）増殖する細胞は、18時間培養液にBrdUを（50 ng / mLの、シグマ）を添加することにより標識したスライスは、その後のBrdUに対する免疫染色を行った。 1 DIVの後、BrdUの標識細胞は心室ゾーン（赤色の矢印）に配置されています。 4 DIVの後、増殖細胞はより多くの散乱であり、別個の脳室帯はもはやメンテナンスされていない。 （B）壊死性細胞は、2時間の培養液にヨウ化プロピジウムの加算（1μg/μL、シグマ）で標識し、蛍光顕微鏡で可視化した。 1 DIVの後、腹側中脳（VMB）は壊死性ではなく、多くのヨウ化プロピジウム標識された細胞は背側中脳と前脳で見ることができます。 3 DIVの後に細胞の生存率は、腹側midbraに減少するインチスケールバー：アポトーシス細胞を可視化するために、切断されたカスパーゼ-3に対するImmunostaingが500μm（C）。 1または2 DIVで、わずかドーパミン作動性ニューロン（TH）がアポトーシスです。 3 DIV後は、ドーパミン作動性ニューロンはアポトーシスを開始します。途中で、右上のパネルは、左のパネルで囲み領域の高倍率です。高倍率の画像を14-16フレームのz -スタックの最大強度の予測です。画像はツァイス線分のセットアップですべての0.5μm程度を採取した。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig5.jpg" /> 図5。急性スライスにおけるYFP標識ニューロンの遊走経路。 （A） 水平方向のスライスは、YFP標識ニューロンのタイムラプスイメージングに使用する。スライスは、イメージングの前に5時間インキュベートした。細胞は、誘導性のCre / loxP部位システム6を使用して標識した。Shhの CreERマウス 8およびROSA つのloxP - STOP - loxP部位- EYFPのレポーターマウスは9我々再使用する。 ROSAレポーターの対立遺伝子（およびEYFPの発現）の組換えが明示CreER（Shhの発現細胞）が、しかし唯一のタモキシフェン（シグマ）の投与時に細胞内で誘導される。この例では、タモキシフェン（3 mg/40 g体重）はE8.5で妊娠中のマウスに投与した。この実験的な主に腹側中脳10,11におけるドーパミン作動性ニューロンとその子孫の前駆体のラベリングの結果を設定します。スケールバー：500μmである。 （B）急性スライスにYFP標識ニューロンの回遊ルートをトレース。 YFP標識運命マッピングされた神経細胞のタイムラプス画像は5時間の合計時間ツァイスAxioは、オブザーバー顕微鏡（対物EC PlnN 10倍/ 0.3）で30分間毎に30分を取得した。スライスは37℃の環境室（インキュベータXLS1 Pecon）でインキュベートし、撮像中に5％CO 2で供給された。細胞の初期位置は赤い矢印でマークされ、移行の位置は赤いアスタリスクでマークされます。

<ol>
	<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).</li><li>Martini, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136 (1), 41-41 (2009).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).</li><li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trekking+across+the+brain:+the+journey+of+neuronal+migration.">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-29 (2007).</li><li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron.">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).</li><li>Legue, E., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+using+site-specific+recombinases.">Genetic fate mapping using site-specific recombinases.</a> Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).</li><li>Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+embryonic+brain+tissue.">Organotypic slice culture of embryonic brain tissue.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Harfe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities.">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-517 (2004).</li><li>Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).</li><li>Joksimovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+separable+Shh+domains+in+the+midbrain+define+distinct+dopaminergic+progenitor+pools.">Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).</li><li>Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-spatial+changes+in+Sonic+Hedgehog+expression+and+signaling+reveal+different+potentials+of+ventral+mesencephalic+progenitors+to+populate+distinct+ventral+midbrain+nuclei.">Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei.</a> Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).</li></ol>

我々は、開示することは何もない。

ここで紹介する器官のスライス培養法は、胚の腹側中脳のドーパミン作動性ニューロンとそれらの回遊と投影経路の開発の in vitro解析における短期的なシステムを提供する。我々は慎重に腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンの正常な発展を可能にするスライスを得るためにに出席されるべきプロトコルの重要なステップの数があることがわかった。最も重要なステップは、高?...

特定の試薬と機器の表<table border="1"><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> DMEM </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D6429 </td><td></td></tr><tr><td>グルコース30パーセント</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G7528 - 250 </td><td></td></tr><tr><td>ウマ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM（4,5 g / Lのグルコース、L - Glnを、ナトリウムフエンヒローラ、NaHCO 3で） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D6429 - 500 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン100倍</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P4333 - 20 </td><td></td></tr><tr><td> L -アスコルビン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4403 </td><td> -20℃で200mmの株式や店舗を準備する</td></tr><tr><td>超高純度LMPアガロース</td><td>インビトロジェン</td><td> 15517-022 </td><td></td></tr><tr><td> Millicelインサート</td><td>ミリポア</td><td> PICMORG50 </td><td></td></tr><tr><td>低μ皿35ミリメートル、 </td><td> Ibidi </td><td> 80136 </td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td> Microm </td><td> HM 650V </td><td></td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td>プラノ社</td><td> 121〜6 </td><td></td></tr><tr><td> Histoacryl接着剤</td><td> BRAU9381104 </td><td>ブラウンAesculap </td><td></td></tr><tr><td>穴あきスプーン径 直径15ミリメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10370 -18 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子5 Dumoxel </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11252〜30 </td><td></td></tr></table> immunostainingsのために使用される抗体。 <table border="1"><tr><tD 抗体の &gt; 名前 </td><td> 会社 </td><td > カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ</td><td>ミリポア</td><td> AB152 </td><td>希釈1:500 </td></tr><tr><td>マウス抗チロシンヒドロキシラーゼ</td><td>ミリポア</td><td> MAB318 </td><td>希釈1:500 </td></tr><tr><td>マウス抗BrdU </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 555627 </td><td>希釈1:200 </td></tr><tr><td>ウサギ抗切断型カスパーゼ3 </td><td>セルシグナリングテクノロジー</td><td> 9661 </td><td>希釈1:200 </td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG -アレクサ488 </td><td>インビトロジェン</td><td> A21206 </td><td>希釈1:500 </td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgG - Cy3を</td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 715-165-150 </td><td>希釈1:200 </td></tr></table>

organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain: a system to study dopaminergic neuronal development in vitro

マウスは、分子や遺伝子データの豊富さに起因する哺乳類の脳の発達を研究するための優れたモデル生物です。マウスの胚にアクセスできず、不透明であるしかし、発展途上のマウスの脳は、 生体内で容易な操作と画像処理には適していません。胎児の脳の器官切片培養したがって、広くin vitroでマウスの脳の発達を研究するために使用されています。 生体外の操作やトランスジェニックマウスの使用ニューロンやグリア細胞の亜集団は、蛍光タンパク質で標識することができるように遺伝子発現を変更できます。標識された細胞の挙動は、タイムラプスイメージングを用いて観察することができます。タイムラプスイメージングは、後期胚の段階1-2に大脳皮質の発達の基礎となる細胞の挙動を研究するために、特に成功している。前脳の外側の脳領域における胚器官スライス培養系ではあまりよくestablisですHED。したがって、神経細胞の遊走を記述するタイムラプスイメージングデータの富は前脳3,4に限定されています。それは、背側の脳のために発見された原則は、腹側脳の領域に対しても当てはまるかどうか、まだ知られていないです。腹側脳では、神経細胞は神経細胞のクラスターではなく、レイヤーで構成されており、彼らはしばしば、彼らの最終的な位置に到達するための複雑な渡り鳥軌道を受けなければならない。腹側中脳は腹側脳の発達のための唯一の良いモデル系ではなく、またそのような病気のプロセスに関連するドーパミン作動性ニューロンなどの神経集団が含まれています。ドーパミン作動性ニューロンの機能と変性が成人と高齢化、脳内の非常に詳細に研究されている一方で、少しはその分化と移行フェーズ5の間にこれらのニューロンの振る舞いについては知られている。ここでは、胎生（E）12.5マウス腹側中脳から切片培養の生成を説明します。これらのスライスカルトURESは、in vitroで数日間にわたってドーパミン作動性ニューロンの開発を監視するための潜在的に適しています。我々は、胚発生のこれらの初期の段階で脳のスライスを生成するための重要なステップを強調表示し、in vitroでドーパミン作動性ニューロンの正常な発展を維持するために必要な条件を議論する。タイムラプスイメージング実験から我々はまた、今回の結果。これらの実験では、腹側中脳前駆体（ドパミン前駆体を含む）およびその子孫は、Creを/つのloxPベースの誘導性の運命のマッピングシステム6を使用してモザイクのように標識した。

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro at JoVE.com

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

E12.5マウス胚中脳から器官型スライスを生成する方法が記載されている。器官切片培養は、ドーパミン作動性ニューロンや他の腹側中脳の神経細胞の挙動を観察するために使用することができます。

胚腹側中脳の器官型スライス培養：ドーパミン作動性ニューロンの発達を研究するための体制 in vitroで</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

organotypic-slice-cultures-embryonic-ventral-midbrain-system-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

17.8K ビュー.  University of Bonn. E12.5マウス胚中脳から器官型スライスを生成する方法が記載されている。器官切片培養は、ドーパミン作動性ニューロンや他の腹側中脳の神経細胞の挙動を観察するために使用することができます。

ビデオ: Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

神経損傷を調べるための器官型海馬スライス培養モデル

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

神経科学

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

器官型海馬切片培養

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

器官培養における神経雪崩のマルチ電極アレイの録音

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

器官切片培養におけるプルキンエ細胞の樹状突起の形態分析

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

ドーパミン作動性ニューロンの開発における遺伝子機能を研究するためのニワトリ中脳でのOVOエレクトロポレーションに

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

腹チック中脳マイクロRNAの発現OVO中

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

微小電極アレイへの3Dエンジニア神経文化のインタフェース：革新的な<em&gt;インビトロ</em&gt;実験モデル

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...