著者らは、スケーリングプロトコルとデータの貴重な議論のためのグリア - 神経相互作用のためのカリフォルニア大学リバーサイドのセンターを承認したいと思います。著者はまた、誠実に自分の仕事の出版を後援するためにアブカムに感謝したいと思います。

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著者らは、これらの研究で使用テトロドトキシンは、アブカム社から購入したことを開示する。アブカムは仮説、設計、またはデータの収集には関与していなかった。ピア·レビュ​​ー·プロセスが完了した後にアブカムの作品への協賛に関するすべての通信が発生しました。

記載されスケーリングモデルは、アストロサイトのグループI mGluRの長期的な可塑性を研究するための実用的な方法を表しています。イメージング自発および誘発のCa 2 +のイベントは、しっかりした証拠は、アストロサイトのCa 2 +上昇がGqをGPCR活性化10の下流、IP 3 Rの影響を受けやすい店舗からのリリースに続いて発生することが確立されているように、アストロサイトのGq GPCR活性の変化を測定するための高感度のアッセイを提供する12、17、18。グループIのmGluRアゴニストおよび例えばCa 2 +応答のパターンに応答する集団のアストロサイトの割合はアストロサイトによるグループIのmGluRの変化を報告している。 Ca 2 +の指標とアストロサイトをロードするために使用される特定の技術は、アストロサイトのGq GPCR活性の変化を調べるための実験の設計における重要な検討事項である。ボーラスロードまたはバルク·ロードの複数のアストロサイト、またはp個々のアストロサイトのATCHクランプ負荷はアストロサイト内の画像のCa 2 +過渡に使用することができます。各アプローチは、特定の利点と欠点があります。直接パッチクランプを介したCa 2 +の指標とアストロサイトを充填することは、SR-101のような2次マーカを必要とせずに、星状細胞のような細胞の明確な同定を可能にする。指標のパッチクランプ送達はまた、潜在的により深い細胞が健康で（利用可能なレーザパワーに依存）シナプスとより完全な相互作用にあるスライス内、毛細プロセスを含む小さな星状の区画からのCa 2 +の活動の記録を可能にします。データは一度に1セルを収集されるが、パッチクランプ負荷は低いスループットに苦しんでいる。バルク·ロードは、対照的に、星状細胞の大多数は、Ca 2 +指示薬を負荷し、同時に撮像することができる。ただし、アストロサイト表面付近にスライスの（&lt;20μm）を関連する懸念で、ロードされている細胞の健康と完全なシナプス約S。 ここで紹介する背圧ボーラスローディングプロトコルは比較的高いスループットとスライス（40〜75ミクロン）の中に深くCa 2 +の活動を監視する機能を、妥協点を提供しています。ボーラスローディング技術を使用して自発的にアクティブアストロサイトの割合が大幅に増加は神経シナプスとアストロサイトのプロセス間の接続が15より完全であることを示唆し、バルクロードと比較して観察されている。良好なローディングでは、1つは、多くの場合、2光子顕微鏡を用いて星状細胞の主な処理（データは示していない）または潜在的にさらに小さな区画内のCa 2 +活性を監視することができる。ただし、注意が境界は、非特異的バックグラウンド染色に溶け込むように、特定のアストロサイトへの小さいプロセスを割り当てる際に行使される必要がある。バルク·ロードまたはボーラスローディング手順の使用と追加の懸念は、二次市場の必要性であるアストロサイトの識別のためのキブロン。それはアストロサイトが優先的にCa 2 +の指標を、AMエステルを取ることを長年知られてきたが、2次マーカのSR-101は、多くの場合、アストロサイトなどの負荷細胞を確認するために使用されている。 SR-101は、それ自体が、ニューロン29の固有の興奮性を変化させることができる。 SR-101の使用は、神経細胞の興奮上の可能なSR-101の効果を制限するためTTX内のすべての星状細胞のCa 2 +測定を実行する必要性を裏付ける。対照群と実験群の両方が、SR-101が含まれると仮定すると、それ自体がマーカーは、ニューロンの活動電位の長期的な操作次のアストロサイトのCa 2 +シグナル伝達に観察された効果を考慮してはいけません。それは、2.5mMのK +対の間の差を減少させることができるようにSR-101しかしながら、高K +の実験において懸念以上であってもよい5.0 mMのK +基礎発火率は比例して変更されていない場合。 Ca 2 +のを提供するための非常に有望なアプローチ</sup&gt;アストロサイトへの指標は、Ca 2 +染料を使用して、より伝統的なアプローチに魅力的な代替手段を提供していますこれは最近浮上している。重要な進歩は、アストロサイト30〜32を対象とし、遺伝的に符号化されたカルシウム指示薬（GECIs）で、過去数年にわたって行われてきた。 GECIsは、例えば海馬のような関心のある脳領域へのアデノ随伴ウイルスベクターのインビボでのマイクロインジェクションにより星状細胞に送達することができる。 GECIsの発現は、ウイルス感染32後約2週間後に達成される。アストロサイトにおけるGECIsの使用によって提示された多くの利点があります。まず、ベクターは、アストロサイト特異的プロモーターを使用して、星状細胞を標的とし、そのように標識された細胞は、アストロサイト32アールアール。第二に、信号対雑音がいますが、セル32上のパッチピペットを受けたことの侵襲性ではないが、色素のパッチクランプ送達を用いて得ることができるものに匹敵すると思われる。第三に、指標はデル可能iveredおよびバルク·ロードの配信方法を使用して問題がある成体組織で発現。さらに、発現は、複数のアストロサイトの中で分化する能力を提供し、モザイクである。同時に体細胞及び微細小枝で録音しつつ、いくつかの星状細胞は、潜在的に、同時に撮像することができる。したがって、潜在的に一つの技術は、大幅に効率が向上したGqアストロサイトのGPCRのスケーリング活性を記録するために3つの別々の技術（バルク·ロード、ボーラスローディング、パッチクランプローディング）の代わりに使用することができる。 アストロサイトへのCa 2 +指標のウイルス媒介送達を使用することの1つの潜在的な欠点は、スライスの健康32に可能な効果である。 GECIsを送達するために使用されるアデノ随伴ウイルスベクターは、星状細胞33の反応性神経膠症を引き起こすことが以前に示されている。一般に、脳切片の調製は、おそらくinfファイルの放出を含む病状の初期段階を開始するlammatory分子10。したがって、GECIsの使用は、ウイルスベクターを用いて送達星状細胞受容体のスケーリングを誘導するのに必要な長いインキュベーション時間と組み合わせ実験のこれらのタイプのスライスの健康との関連でさらなる考慮を受信する必要があろう。 このプロトコルを採用する場合には、応答を生成するためのアゴニスト印加時間は、受容体の可用性の関数として変化することに留意することが重要である。アゴニストの所与の濃度について、適用時間は、受容体が縮小され、より短いている場合、受容体は、Ca 2 +を生成するために十分に受容体を活性化する組織に適切な濃度に達するように薬物のために、スケールアップした場合に長くなる必 ​​要があります応答。したがって、薬物適用時間、および潜在的にそれらの濃度は、スケーリングの意図した方向に応じて調整されなければならない。例えば、アゴニスト濃度は、Cが低下する必要があるかもしれないTTXのASE反応を飽和を回避するために、さらには反応を見るために高K +でスライスをインキュベートした後に増加した。 5-15μMは、多くの場合に高信頼性応答を生成するのには低すぎたとして具体的には、DHPG濃度のCa 2 +応答パターンを研究するために5.0mMのK +処理後30〜50μMにTTX処理後5-15μMからずれたグループI mGluRのダウンスケーリング後のアストロサイト。 アストロサイトのCa 2 +の活動の記録は、原形質膜へのまたはからの受容体の挿入や内在化の直接的な証拠を提供しない。しかし、GqをGPCR発現レベルと自発の間の直接の関係を検討し、カルシウム2 +過渡21〜24のCa 2 +の変化の最も論理的な解釈を誘発in vitroでのこれまでの研究からのデータとのデータの顕著な類似性に基づいてシグナリングは、星状細胞表面受容体の発現レベルが有することである変更しました。 1は、Ca 2 +活性に対する効果の軌跡についての追加の証拠を提供したい場合は、補完的なアプローチが重要な考慮事項があります。我々が使用される戦略は、アストロサイトMrgA1Rマウスから海馬スライスでのTTXのインキュベーションの効果を検討することであった。これらのトランスジェニックマウスは、星状細胞における外国のGq GPCR（MrgA1R）を発現する。この受容体は、脳へのネイティブではないため、その活動レベルを変更するために存在する内因性神経伝達物質ではありません。以前の研究は、この受容体が同じアストロサイト34の内因性グループIのmGluRなどのシグナル伝達分子を同じ細胞内に係合することが示唆された。後のTTXでMrgA1Rマウスからの切片の長期のインキュベーション、同腹仔対照と比較して、アゴニスト誘発MrgA1R応答の差はスライスがアストロサイトのCa 2 +活性に対する影響は、特に、表面受容体に局在化の変化によるものであるという証拠を提供するであろうインキュベートしていないグループIのmGluRの回答はまだSIGNIFある場合icantly同じアストロサイトに高めた。代替として、おそらくより複雑な戦略がある限り、膜画分は、表面受容体の発現レベルの変化について分析することができるように、ウェスタンブロット分析用スライスからアストロサイトを単離することであるけれども。蛍光活性化細胞選別（FACS）またはフローサイトメトリーは、ここで役に立つかもしれません。 ニューロン、星状細胞とアストロサイト、神経間相互作用の研究にこの技術の可能なアプリケーションは多い。我々の実験では、唯一のDHPG誘発グループIのmGluR星状細胞のCa 2 +応答は、幼若マウスから単離された急性海馬スライスにおいて、研究した。この製剤は、シナプス後細胞（CA1錐体細胞）上に、これらのグルタミン酸作動性ニューロンの発火率を操作することが可能となる、無傷の求心性神経（シャファー側枝）だけでなく、それらを引き起こすニューロン（CA3錐体細胞）を有するのみならず、およびそのプロセスassociat放線層におけるアストロサイトこれらのシナプスとE。急性海馬スライスは、他のタイプのニューロンの発火率を操作するための最善の準備ではないかもしれないが、しかし、などの多くの求心性神経は、それらを引き起こすニューロンから切断される。それにもかかわらず、他の星状細胞のGq GPCRサブタイプの可塑性を観察するために、特定のスライス標本において可能であってもよい。たとえば、スライスがそのまま海馬、前脳基底部のコリン作動性ニューロンとその突起を調製することができた。 TTXまたは上昇したK +でこれらのスライスのインキュベーションは、コリン作動性入力1のかなりの部分を受信角質オリエンスのアストロサイトにおけるmAChRはスケーリングをもたらす、コリン作動性ニューロンの基礎発火率に影響を与える。スケーリングが行われている間、TTXの持続放出をプラストの注入によって達成されるin vivoモデルを使用することができるすべての接続はそのままで、脳の特定の領域内での星状細胞受容体のスケーリングを研究するための代替アプローチまだテストされていない関心35の領域上のICポリマーエルバックス40W。このアプローチは、神経細胞のスケーリングの研究で以前に使用されているだけでなく、アストロサイトのスケーリングに適用可能であるべきである。最後に、適切な読み出しと、今後の研究は、G、SまたはGの変化私のGPCRを含む他のGPCRファミリーを調べることができます。一つは、 私のGPCRがローカルに任意のスライス標本内のGABA介在ニューロンを投影における焼成の阻害以下の影響を受けることがアストロサイトの GABA B Gを予測することがあります。このような二次メッセンジャーcAMPのリアルタイムの指標として他のシグナル伝達分子を標的とする新たな指標の開発は、神経細胞へのアストロサイト受容体通信の研究のまったく新しいエリアを開くだろう。 基礎ニューロン発火率を操作することによってアストロサイトmGluRの双方向のスケーリングは、神経伝達物質のAP媒介リリースにアストロサイトの感度の尺度を提供する。アストロサイトは、明らかに自発的なAPとglutamaを感知することができる細胞外のK +は生理的な範囲内であってもシェーファー担保CA1錐体細胞シナプスにおけるTEリリース。 TTXの急性適用は自発的なアストロサイトの頻度アストロサイトの受容体は、AP検出器であるという証拠を提供するのCa 2 +活性の18、36、37、となりますが、36の非相関集団のアストロサイトの中のCa 2 +活性を低下させないながら。これはアストロサイトはありません彼らの全体的なCa 2 +の活動に影響を与えるとの自発的な神経細胞のAPを検出することを示唆している。これは、広くIP 3の細胞内濃度が、検出可能なCa 2 +の上昇につながることが十分にIP 3 Rsのを刺激するための閾値レベルに到達する必要があることが認められている。自発的な神経細胞のAPは、測定可能なCa 2 +の上昇を生じることなく、アストロサイトのGPCRを活性化することができた？今後の研究では、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）または同様？と思ったらを利用することができる<html>受容体へのGタンパク質結合（受容体活性化の尺度）および内部貯蔵からのCa 2 +放出との関係を調べるために（例えば、BRETなど）のiQue。この技術は、無傷の組織調製物における使用に利用可能になるまでにはしばらく時間がかかるかもしれないがBRETは、Gタンパク質のGPCRへのカップリング38を検出するためにインビトロで広く使用されてきた。これは、アストロサイトのGqのGPCRははるかに頻繁に、現在利用可能なのCa 2 +イメージングツールを使用して記録することができるよりも活性化されることが可能である。活動電位を感知することに加えて、星状細胞のGq共役GPCRはまた、最近の研究39で報告されたように神経伝達物質の小型の量子的放出を検出することができる。ここに記載の双方向スケーリング方法は、アストロサイトのGqのGPCRはインキュベーションプロトコルでバフィロマイシンA1を含むことにより、神経伝達物質の量子収率水疱性放出を検出する程度の尺度を提供するために、将来の研究に使用することができる。 &gt;これまで、スケーリングプロトコルのみ幼若マウス（P12-P18）から海馬スライスにおいて使用されているntent「星状細胞受容体のスケーリングもまた、成体マウスから得られた組織において誘導されなかった場合。したがって、現在のところ不明である。説得力のある最近の研究アストロサイトにおけるグループIのmGluR式は時代の最初の週後にかなり減少し、成人のアストロサイト40内の受容体発現の非常に低いレベルで、成人期まで減少し続けていることを示唆している。アストロサイトのmGluRは、長期以下のスケールアップ場合は、それゆえ決定するために興味深いものになるだろう幼若マウスからの星状細胞に見られるものに近づくレベルにまで成熟マウスの海馬スライスにおける神経発火の長期抑制。この発見は、星状細胞受容体の発現が特定の年齢で、静的ではなく、神経活動のレベルに応じて迅速に変更することができることを示唆している。とは対照的に成体マウスにおけるグループI mGluRの発現低下、証拠が含む＆＃そのアドレナリン受容体を、浮上している945; 1A、α2Aは、β1サブタイプは、主に成人の脳3、4にあるアストロサイトによって表現されています。 α1AはアドレナリンのGq GPCRは、これらの受容体がアドレナリン作動性ニューロンの発火率の変化に敏感であるかどうかを含め、ニューロンへのアストロサイトのコミュニケーションの今後の研究のための魅力的な標的となる可能性がある。

アストロサイトは、アストロサイトのGqのGPCRの活性化からほぼ独占的に生じた細胞質のCa 2 +の増加と神経細胞や神経細胞の軸索の刺激に数秒以内に応答します。例えば、ムスカリン性アセチルコリン受容体1、カンナビノイド受容体2、α1Aア ​​ドレナリン受容体3、4、およびグループIのmGluR（下記参照）急性神経活動に反応する全てのアストロサイトのGq GPCRのサブタイプである。感覚刺激8次の生体内でのアストロサイトのグループI mGluRの活性化（例えば、急性海馬スライスなど）、その場で神経細胞のグルタミン酸作動性求心性神経の刺激5-7以下、最も広く実証されているだけでなく、大人のマウスの皮質で。アストロサイト、神経細胞、またはアストロサイトニューロン相互作用の生物学と生理学上のアストロサイトのGq GPCRシグナル伝達の活性化の結果は、9月12日の議論の問題となっている。それはSになりますニューロンへの星状細胞受容体シグナル伝達の機能の前に青梅時間が十分に理解される。 それはニューロンが実験プロトコルを使用してアストロサイトの受容体を活性化することができることは明らかであるが、よくわかっていないままニューロンへのアストロサイト受容体通信の側面があります。まず、星状細胞Gq共役GPCRを活性化するのに必要なニューロンの活動の実際の量は、明確に定義されておらず、第二、使用依存性可塑性を発揮する星状細胞受容体の能力はほとんど注目を受けている。これらの質問に対処するために開始するには、我々は最近、神経細胞の活動電位の長期的な変化（AP）依存性シナプス活動に応答して、星状細胞集団の急性少年海馬スライスにおけるI mGluRの双方向のスケーリングを誘導するためのプロトコルを開発しました。私のmGluRはfoをスケールアップし、神経細胞のイオンチャネル型グルタミン酸受容体13、14、アストロサイト、グループの双方向恒常的可塑性のために発見されたことと同様に神経細胞の活動電位のllowing遮断し、神経活動電位周波数は15に増加されたときにスケールダウン。アストロサイトの受容体におけるこれらの代償の変化は、自然発生的な記録することによって測定し、アストロサイトのCa 2 +トランジェントを誘発し、対照条件でのアストロサイトからのものに、これらのイベントの特性を比較することができます。本稿では、星状細胞受容体スケーリングを誘発する急性海馬スライス、インキュベーション条件の調製を含めて、このプロトコルを使用するための完全な方法論を記載し、星状細胞のCa 2 +指示薬色素負荷のCa 2 +イメージング、共焦点顕微鏡を用いた技術、および期待される効果アストロサイトのGq GPCR活性上。アストロサイトのCaに対する予測可能な効果2 +シグナル伝達特性-のGqのGPCRの異なる発現レベルでトランスフェクションした培養細胞において以前に記録されたものと一致する-などの変化を分析するために、今後の研究に使用可能な「ロードマップ」を提供trocytic GPCR発現。この技術の使用のための波及効果と潜在的なアプリケーションは、健康で病気にかかった脳内のアストロサイト、神経間相互作用の理解に貢献していきます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Chamber Supplies</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:163px;">Brinkmann pipette storage container</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">03-491</td>
			<td style="width:159px;">Use the drawer portion as the incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:163px;">Electrical drill</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Flexible tubing</td>
			<td style="width:135px;">Tygon</td>
			<td style="width:131px;">R-3603</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Silicone seam sealant&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">Also called aquarium seam sealer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Gas tank</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">95% oxygen, 5% carbon dioxide</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Natural beveled pipette tip</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:131px;">1111-1000</td>
			<td style="width:159px;">Cut-to-fit to connect oxygenate lines</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">One-to-six lines manifold</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">64-0210 &#160;(MP-6)</td>
			<td style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="65" rowspan="2" style="height:65px;width:163px;">Eppendorf microloader</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">5242 956.003</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit</td>
		</tr>
		<tr height="6">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Floating Bubble Rack</td>
			<td style="width:135px;">Bel Art Scienceware</td>
			<td style="width:131px;">F18875-0400</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">600 micron Sefar Nitex nylon mesh</td>
			<td style="width:135px;">ELKO filtering Co.</td>
			<td style="width:131px;">&#160;06-600/51</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Krazy Glue</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:135px;">Baxter</td>
			<td style="width:131px;">1001936060</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">NaCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S271-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">P333-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">CaCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">C79-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">MgCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">M33-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S369-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S233-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">53188-07-1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">401471000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Tetrodotoxin citrate (TTX)</td>
			<td style="width:135px;">Ascent Scientific</td>
			<td style="width:131px;">Asc-055</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Sulforhodamine 101 (SR-101)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">284912</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D128-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pluronic Acid F-127</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">P6867</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">O6807</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td style="width:135px;">Ascent</td>
			<td style="width:131px;">Asc-020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Histamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H7125</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Carbamoylcholine chloride (Carbachol)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C4382</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Adenosine 5&#8217;-ATP disodium (Na-ATP)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7699</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Dissection Tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Single-edge razor blade&#160;</td>
			<td style="width:135px;">GEM</td>
			<td style="width:131px;">62-0161</td>
			<td style="width:159px;">For bisection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Double edge razor blade</td>
			<td style="width:135px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:131px;">121-6</td>
			<td style="width:159px;">For cutting slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Mayo Scissors, supercut</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">14010-15</td>
			<td style="width:159px;">For decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Fine iris scissors, straight</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">14094-11</td>
			<td style="width:159px;">For cutting the skull</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Iris forceps, curved</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">15915</td>
			<td style="width:159px;">To remove the skin and skull</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Small spatula</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">To remove/transfer the brain</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-10</td>
			<td style="width:159px;">For hippocampus dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Glass Pasteur pipette</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">13-678-20B</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pasteur pipette rubber bulb</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">03-448-22</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Polystyrene 100-mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">25020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Vibratome</td>
			<td style="width:135px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">VT 1200S</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="23" rowspan="2" style="height:23px;width:163px;">Water bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Fisher</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ISOTEMP 210</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For warm incubation</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:163px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:135px;">Narishige</td>
			<td style="width:131px;">PC-10</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:131px;">Olympus Fluoview 1000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">RC-26GLP</td>
			<td style="width:159px;">diamond bath with low profile</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Borosilicate glass pipette</td>
			<td style="width:135px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:131px;">TW150F-4</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="25" rowspan="2" style="height:25px;width:163px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Sutter instrument</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ROE-200</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:163px;">Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 &#181;m cellulose acetate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Costar</td>
			<td style="width:131px;">8161</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing plasticity of astrocytic receptors by manipulation of neuronal firing rates

研究の二十年に近いは、in situおよびin vivoでのアストロサイトはneuronallyリリース送信機によって刺激され得る多数のGタンパク質共役受容体（GPCR）を発現することを確立した。しかしながら、神経活動の変化に応じて可塑性を発揮する星状細胞受容体の能力はほとんど注目を受けている。ここでは、全体的にスケールアップまたはアストロサイトのグループの下、私は急性脳スライスにおけるグルタミン酸受容体（mGluR）の代謝調節に使用することができるモデルシステムについて説明します。含ま双方向に蛍光性Ca 2 +指示薬で神経細胞の活動電位周波数、負荷星状細胞およびアストロサイトのプロセスを操作し、長期的なスライスのインキュベーションに適し室を構築し、矢状海馬スライスを作成し、記録することにより、アストロサイトのGq GPCR活性の変化を測定する方法についての方法があります自発的な共焦点顕微鏡を用いて星状細胞のCa 2 +のイベントを引き起こした。本質的に、「カルシウムrをoadmap「アストロサイトのGqファンGPCRの可塑性を測定する方法のために提供される。アストロサイトの研究のための技術のアプリケーションが議論されている。アストロサイトの受容体シグナル伝達が神経活動の変化によってどのような影響を受けるかについての理解を持つことは、両方の正常なシナプス機能だけでなく、プロセスの基本的な神経疾患や神経変性疾患のための重要な意味を持っています。

図3の代表的な結果は、SRアストロサイトのCa 2 +活性への4-6時間のためのTTXの急性マウス海馬スライスのインキュベーションの効果を示す。データはACSFプラスTTX 対制御ACSF中でインキュベートスライスから、自発性Ca 2 +過渡とDHPG誘発グループIのmGluRのCa 2 +応答の両方が含まれる。基本的な特徴的な形態学的特徴、星状プロセスアセンブリと小さな細胞体の大きさ（〜10ミクロン）以外の、星状細胞を選択的星状細胞マーカーSR-101 19、20（とのCa 2 +指示薬OGB-1 AMのオーバーレイによってSRの識別されます図3A）。星状細胞の細胞体上の番号付けボックスは、 図3Bに示す時間トレース上の奇数蛍光に相当する。グループ1のmGluRアゴニスト（RS）-3.5-DHPGを、星状細胞におけるグループ1のmGluR上の特定のスケーリング効果を決定するために適用される。物理を区別するために他のGqファンGPCRに対してグループ1のmGluRにスケーリング効果の特異性iology、アゴニストのカクテルは、各実験の終了時に適用されます。ここでは、ヒスタミン、カルバ塩化（カルバコール）及びアデノシン5&#39;-ATP二ナトリウム（のNa-ATPを）アゴニスト、10μMのGq GPCRのそれぞれを使用しました。アゴニストカクテルはまた、細胞がそれらの特定のアストロサイトはDHPGに対する応答を誘発するのに十分な量の受容体を発現しないので、おそらく、DHPGに応答しない場合において、生存、応答性星状細胞を同定するための陽性対照として役立つ。 私たちは、アストロサイトのグループIのmGluRの変化を明らかにすることを支援するために、5μM及び15μMの（ 図3B）と同様に、30μMおよび50μM（ 図4A）を含むDHPGの異なる濃度を使用しました。細胞性のCa 2 +応答およびGq共役GPCR発現レベルとの関係は、インビトロ 21-24 に以前に検討されている。まず、特定のアゴニスト濃度に対応するためのしきい値は、各細胞によって発現される受容体の密度に依存する。細胞の集団において、より多くの細胞は、細胞が受容体のより高い密度でトランスフェクトされたアゴニストの所与の濃度に対するCa 2 +上昇に応答する。 TTXのスライスをインキュベートした後、集団における星状細胞の割合は増加するアゴニストの固定濃度（ 図3Bおよび3C）に応答する。私たちは、30および50μMDHPGは5.0 mMのK +対対照治療でグループIのmGluR応答を比較するために必要とされるのに対し、5μM及び15μMのDHPGは、制御、およびTTX処理された細胞間の反応性アストロサイトの割合の明らかな違いを明らかにすることを発見した細胞（ 図4A）。 星状細胞のCa 2 +応答パターンおよびアゴニスト濃度との関係はまた、 その場で検討されている。アゴニストの増加濃度は、単一のピークからアストロサイトにおけるCa 2 +応答のパターンのCa 2 +多峰する標高と高原のCa 2 +上昇は25〜27にシフトします。これらの以前の知見に基づいて、我々は、受容体発現のレベルの変化がある場合にアゴニストの単一濃度に応じてパターンがシフトすると予測した。したがって、2つのスケーリング方法のどの（ニューロン発火を阻害するか、またはそれを増加させる）を利用しているに応じて、特定の応答パターンを生成するのに必要なアゴニストの濃度が増加または減少する。例えば、TTXでインキュベートした星状細胞は、より多くの高原型Ca 2 +標高へのDHPG誘発Ca 2 +の応答パターンをシフトし、アストロサイト（ 図3C）と比較し 、アゴニストの濃度を下げるために応答します。考慮以前の研究を考慮して、これらの観​​察は、アストロサイトのグループIのmGluR受容体発現レベルが増加していることを示唆している。 Ca 2 +の上昇は時間と発症（レイテンシ）を上昇も直接培養細胞22〜24内のGq GPCR発現レベルの変化に相関することが示されている。受容体密度の減少は反対の効果を生成しながら、より高い受容体発現レベルは、より短い反応潜時より速い立ち上がり時間をもたらす。 TTXでインキュベートした星状細胞は、CA DHPGの適用により誘発2 +過渡が大幅に高速制御ACSF（ 図3D）中でインキュベートアストロサイトと比較して倍に上昇している。前述のように、アゴニスト誘発性Ca 2 +応答の振幅に関係なく、アゴニスト濃度又はスケーリングモデル15（ 図3D）の不変のままである。 DHPGを有するIのmGluRを直接活性化する基で観察された変化に加えて、自発的な星状細胞のCa 2 +活性も有意にこの操作により影響を受ける。私たちは、観察対照に対してTTX中でインキュベート自発的にアクティブアストロサイトの割合のDA 2.26倍の増加。これは、星状細胞（ 図3E）インキュベートTTXで42.1％に相馬の自発活性を示す制御アストロサイトの唯一の12.9％から増加している。それが知られているので、そのアゴニスト21、26、28の非存在、および受容体の発現レベルを増加させると、この固有の活性のレベルが増加するが、これらのデータは示唆しているという点でのGPCRを示す「内因性」又は構成的活性そのアストロサイトGq共役するGPCRの密度が増加する神経細胞の活動電位発火の長期的な削減以下。アゴニスト誘発反応と同様に、自発性Ca 2 +の上昇の立ち上がり時間も（ 図3E）増加する。 第二のプロトコル、高架外カリウム（5.0 mM）の中でのインキュベーションを使用した代表的なデータを、Fiの中で描かれているグレ4。基礎CA3ニューロン活動電位周波数15の有意な増加2.5〜5.0 mMの結果から、細胞外のK +の増加。 DHPGより高濃度（30μMおよび50μM）は、高カリウム（ 図4Aおよび4B）中でインキュベートアストロサイトからのグループIのmGluRのCa 2 +応答を呼び起こすするために必要である。これは神経細胞の活動電位の長期的な増加が以下のアストロサイトでグループIのmGluRの応答性のレベルの低下と一致している。また、DHPGの一定濃度に誘発応答パターンが弱く単峰応答（ 図4B）に高原のような応答からシフトします。 2カリウム条件で自発的にアクティブアストロサイトの割合を調べると、高K +でインキュベート少ないアストロサイトは、対照条件（ 図4C）に比べて自然に活性であることを明らかにしている。この効果はoppositである自発性のCa 2 +の上昇を示す星状細胞の割合は増加するTTX条件のε方向。最終両方を誘発自発的Ca 2 +の上昇は、対照条件（ 図4Cおよび4D）対高K +中でインキュベートしたアストロサイトに遅い立ち上がり時間を有する。全体的なこれらのデータは、星状細胞はGq GPCR発現レベルが双方向に長時間にわたってニューロンの活動電位活性のレベルに応じて拡大縮小することを示唆している。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。スライスインキュベーションチャンバーの製作と設置しました。（a）は気密蓋と一緒にブリンクマンピペット収納容器の引き出し部分はスライスインキュベーションチャンバーを構築するために使用されている。 （B）Dリル容器の側面にある穴に約1¼上から内および側から¼。柔軟性のあるチューブの一枚に収まる。 （C）は、柔軟なチューブの内側端にmicroloaderマニホールド装置を接続します。カットにフィット自然200μlのピペットチップ（白矢印）に注意してください。 （D）は、6つの20μlのエッペンドルフmicroloadersはカットにフィットしている1対6ラインマニホールドにmicroloaderマニホールド装置を作成する。 （E）の蓋の上二つの小さな穴を開けます。 （F）スライスホルダーを作るためのフローティングバブルラック。ナイロンメッシュ素材の部分が底に接着することができるように、（G）は 、フローティングバブルラックの一番下「足」は削除されます。 （H）ACSF十分な量のインキュベーションチャンバーを埋めるスライスホルダフロートするように。 microloadersの先端がチャンバ床の1コーナーで休むことができるように、チューブの長さを調整します。でインキュベーションチャンバーを配置するとき水浴、お風呂の水位は、チャンバー内のACSFと同じレベルにする必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。スライスの健康の推定。（A）微分干渉コントラスト（DIC）光学系を用いて、健康そうな海馬スライス。健康的なスライスは滑らかで、ビロードのような外観と健康的なCA1錐体神経細胞の割合が高い。放線層に突出する先端樹状突起に注意してください。ここに示されたもののように見えるのニューロンのパッチクランプは、いくつかの自発的活動電位を標準2.5 mMのK + ACSF中の低静止膜電位（-61 -62にMV）を明らかにしている。膜電位および発火率は、元の関数として変化するtracellular K +（謝ら 15）。矢印は、推定されるアストロサイトを指している。略語：SR、放線層、s.py.、角質錐体。スケールバーは10μm。 （B）は不健康なスライスは目玉焼きの外観があり、デッドCA1錐体ニューロンの割合が高いがあります。（白矢印は死んだ神経細胞の核を指す-目玉焼きの「卵黄」）を<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。のGq GPCR活性を増幅し、TTXでのインキュベーションにより神経細胞のAPの長期的な抑制後誘発グループIのmGluRのCa 2 +応答記録。（A）の記録領域内の細胞の代表的な画像は、CでインキュベートしontrolオレゴングリーンBAPTA-1 AMのCa 2 +指示薬色素（左パネル）とSR-101（中央のパネル）を取り上げている条件（上のパネル）またはTTX（下パネル）であった。スケールバーは10μmである。両信号のオーバーレイ（「マージ」）は、Ca 2 +の指標とそのアストロサイトの負荷を示している。ボックスは、アストロサイト内のCa 2 +の活動を監視するためにグリーンチャンネルでの経時的な蛍光強度を記録するために、個々の星状細胞体の上に描かれています。星状細胞中のCa 2 +活性のAにおける記録·ボックスから（B）サンプルトレース）。 TTXショーでインキュベートした星状細胞は、自発的な活動を増加させ、より強固な応答のパターンの変化によって証明されるように、グループIのmGluRのCa 2 +応答を誘発。単一ピーク（○）の例は、多峰（長方形）、および平坦域（点線の長方形）のCa 2 +トランジェントが示されている。応答パターン中の（C）の変更は、別のコンセントを使用して、特に明白であるグループIのmGluRアゴニストDHPGの配給。より多峰プラトー応答が与えられたアゴニスト濃度で対照と比較したTTXでのインキュベーション後に明らかである。振幅が（下のパネル）を変更しない間（D）は 「全か無か」の応答振幅を示す、コントロール（上のパネル）と比較して、TTXでインキュベートした星状細胞に速くDHPG誘発性Ca 2 +応答の時間をされて立ち上がり、一度対応する閾値に達した。 （E）の自発的なアストロサイトの倍の立ち上がりのCa 2 +過渡は集団のアストロサイトの割合は自発たGq GPCRのCa 2 +活性が上昇（下のパネル）を示しながら、アストロサイト（上のパネル）インキュベートも速くTTXでコントロール対インキュベートする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-wiDTH = &quot;6インチ&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot;幅= &quot;500&quot; /&gt; 図4。アストロサイトのGq GPCR活性を低下および上昇し、細胞外カリウム中でのインキュベーションによるニューロンのAPの長期的な増加は、以下のグループIのmGluRのCa 2 +応答を誘発記録。アストロサイトのCa（A）代表痕跡5.0 mMのK + ACSF中でインキュベートスライスから2 +レコーディングニューロンを脱分極し、ACSF（2.5mMのK + ACSF）と比較し、それらの基礎発火率を増加させる。 5.0 mMのK + ACSFの展示が少なく、自発体細胞のCa 2 +過渡弱いDHPGとインキュベートした星状細胞は、コントロールACSF中でインキュベートアストロサイトと比較して、応答を誘発。 （B）DHPGの複数の濃度に対する誘発反応のパターンを比較すると、神経細胞のAPの長期的な増加の後に弱い応答タイプを明らかにしている。 （C）POにおけるアストロサイトの割合の減少自発的活動の立ち上がり時間が遅く（下のパネル）になっている間の自発的Ca 2 +の活性を示すpulationは、上昇し、Kの長期のインキュベーション後に観察+ ACSF（上のパネル）と比較している。 （D）DHPGの異なる濃度に誘発アストロサイトの倍のCa 2 +応答立ち上がり制御ACSF中でインキュベートアストロサイトと比較して5.0 mMのK +処理後遅くなる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a>

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Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

ここでは、アストロサイトのGタンパク質共役受容体の可塑性の研究のためのニューロンにおいて恒常的な可塑性を誘導するために使用されるプロトコルの適合を記載している。最近、幼若マウスにおけるIのmGluRアストロサイトのグループ内の変化を調べるために使用される、この方法は、 インサイチューおよびインビボで 、成体マウスからの組織において、種々の星状細胞GPCRのスケーリングを測定し、星状細胞受容体の感受性のより良い理解を得るために適用することができる神経活動の変化に。

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

inducing-plasticity-astrocytic-receptors-manipulation-neuronal-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K ビュー.  University of California Riverside. ここでは、アストロサイトのGタンパク質共役受容体の可塑性の研究のためのニューロンにおいて恒常的な可塑性を誘導するために使用されるプロトコルの適合を記載している。最近、幼若マウスにおけるIのmGluRアストロサイトのグループ内の変化を調べるために使用される、この方法は、 インサイチューおよびインビボで 、成体マウスか?...

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Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

神経科学

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

レーザースキャニングの光刺激によって抑制神経回路のマッピング

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

アストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析グルタミン酸クリアランスの時間経過の導出

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

アン<em&gt;体外</em筋求心性神経の焼成特性を研究するための&gt;成体マウス筋肉神経の準備

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Pentylenetetrazole 誘起キンドリング マウス モデル

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) have become the most popular chemogenetic approach used in modern neuroscience. Most studies deliver the ligand clozapine-N-oxide (CNO) using a single intraperitoneal injection, which is suitable for the acute activation/inhibition of the targeted neuronal population. There are, however, only a few examples of strategies for chronic modulation of DREADD-controlled neurons, the majority of which rely on the use of delivery systems that require surgical intervention. Here, we expand on two non-invasive strategies for delivering the ligand CNO to chronically manipulate neural population in mice. CNO was administered either by using repetitive (daily) eye-drops, or chronically through the animal&#39;s drinking water. These non-invasive paradigms result in robust activation of the designer receptors that persisted throughout the CNO treatments. The methods described here offer alternatives for the chronic DREADD-mediated control of neuronal activity and may be useful for experiments designed to evaluate behavior in freely moving animals, focusing on less-invasive CNO delivery methods.

Here we describe two non-invasive methods to chronically control neuronal activity using chemogenetics in mice. Eye-drops were used to deliver clozapine-N-oxide (CNO) daily. We also describe two methods for prolonged administration of CNO in drinking water. These strategies for chronic neuronal control require minimal intervention reducing animals&#8217; stress.

DREADD制御神経活動の慢性操作に対する非侵襲的戦略

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...