Mini-Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR

L.reuteriを適切な抗生物質を含む10ミリリットルのMRSブロスに接種し、摂氏37度で一晩好気的にインキュベートします。翌日、培養物を予冷遠心分離機で遠心分離する 上清を廃棄し、ペレットを2ミリリットルの標準P1緩衝液で洗浄する 遠心分離機を再度遠心分離し、上清を廃棄してから、ペレットを250マイクロリットルの修飾P1緩衝液に再懸濁する。摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。

次に、250マイクロリットルのバッファーP2を加え、4〜6回反転させて混合します。5分後、350マイクロリットルのバッファーN3を加え、チューブを反転させて混合します。10, 000 Gで10分間遠心分離し、できるだけ多くの上清をスピンカラムに移します。

再び60秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。スピンカラムを500マイクロリットルのバッファーPBと遠心分離機で洗浄し、フロースルーを廃棄します。スピンカラムを750マイクロリットルの緩衝液PEで洗浄し、10, 000 Gで60秒間遠心分離します。

フロースルーを廃棄し、再び60秒間遠心分離して、残留バッファーを除去します。スピンカラムを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。20〜30マイクロリットルのDnaseおよびRNaseを含まない二重蒸留水をスピンカラムフィルターに加え、1〜2分間放置してから10, 000 Gで60秒間遠心分離します。

鋳型DNAを提供する溶出液を用いてプラスミド特異的プライマーを用いて標準的なPCR反応を行い、E.coliミニプレップ由来のプラスミドを用いたポジティブコントロールを含む。ミニ分取溶出液をアガロースゲルに通すと、観察可能なバンドではなく塗抹標本が得られます。ただし、溶出液をDNAテンプレートとして使用するその後のPCRでは、予想されるバンドサイズが生成されます。