まず、高解像度呼吸計の電源を入れて装置を準備し、データ収集と分析のために呼吸測定ソフトウェアVatLabに接続します。オキシグラフチャンバー内の70%エタノールを二重蒸留水と交換します。磁気攪拌子を使用して、チャンバー内で750RPMで連続的に攪拌します。
10分間放置してから、水を吸引します。チャンバーを二重蒸留水でそれぞれ5分間3回洗浄します。酸素センサーを校正するには、まず二重蒸留水を取り出し、2ミリリットルの細胞調製培地をチャンバーにピペットで移します。
空気交換気泡を残してストッパーを配置します。酸素校正値を記録するには、センサーのゲイン、分極電圧、データ記録間隔などの設定を調整します。次に、実験にラベルを付け、培地を入力します。
レイアウトをクリックし、01 Calibration Experiment GR3 Tempを選択します。 攪拌子で培地を750RPMで摂氏37度で少なくとも30分間攪拌し、センサーメンブレンの性能を監視します。マウスの左ボタンとShiftキーを押しながらマウスをドラッグし、酸素濃度の変化が安定している領域を選択します。
次に、オキシグラフをクリックし、次にO2キャリブレーションをクリックします。空気キャリブレーションで、選択したマークを前に選択した領域に変更します。次に、[キャリブレーションとクリップボードへのコピー]をクリックします。
記録を停止し、オキシグラフをクリックして保存します。続いてOKコントロールを選択し、保存して切断します。次に、呼吸評価を行うために、チャンバーを開き、内部の培地を吸引します。
精子細胞を最終容量の2ミリリットルのMRMにロードし、透過処理細胞解析を行います。下隅にあるPOSキャリブボックスをダブルクリックし、以前に実行したキャリブレーションを開いて、キャリブレーションをロードします。その後、実験を停止します。
4.5マイクロリットルの10ミリモルジギトニンを注入し、細胞を5分間透過処理します。安定したシグナルが得られるまで、無傷の細胞の呼吸を少なくとも5分間記録します。次に、複合体Iまたは複合体IIの基質を追加し、信号が増加し安定するまで酸素消費量を測定します。
次に、0.5モルADPを5マイクロリットル注入し、信号が増加し安定するまで酸素消費量を測定します。ATP合成酵素阻害剤であるオリゴマイシンを1ミリリットルあたり4ミリグラムの1マイクロリットル添加する。信号が減少して安定するまで、酸素消費量を測定します。
最大非共役呼吸数に達するまで、0.1ミリモルから1ミリモルまで、1マイクロリットルのFCCPを連続したステップで追加して滴定します。信号が増加して安定するまで、酸素消費量を測定します。酸素消費量が減少し始めたら、薬の注射を中止してください。
最後に、複合体Iには1ミリモルのロテノンを1マイクロリットル、複合体IIには5ミリモルの抗マイシンAを注入して、ミトコンドリアと残留酸素の消費量を区別します。信号が減少して安定するまで、酸素消費量を測定します。データ解析を実行するには、基質または阻害剤の注入後に相関する体積あたりの酸素フラックスが安定している領域を選択し、マークをクリックしてから統計ウィンドウをクリックし、データをエクスポートします。
精子細胞100万個あたり得られたデータを正規化し、すべての値からミトコンドリア以外の酸素消費量を差し引きます。これらの式を使用してインデックスを計算します。精液サンプルからの無傷の精子細胞の記録に成功し、青い線は酸素濃度を示し、赤い線は体積あたりの酸素流量の相関を表しています。
精子細胞数が少ないほど、ベースラインの酸素消費量が少なくなりました。さらに、ミトコンドリア複合体Iまたは複合体IIに特異的な酸素消費量曲線を、このプロトコルを用いて取得しました。
