このプロトコルは、限られた数のミトコンドリアを含む小さな組織における困難な手順である単離されたミトコンドリアのパーセレーションによる神経内部のミトコンドリア機能の評価を可能にする。この技術は、保存されたミトコンドリアのin situにおいて、酸素消費やROS産生などのミトコンドリア機能を同時に解析する可能性を提供する。複数の基質、インヒビター、およびアンカプラ設計プロトコルを使用。
いくつかの疾患は、ミトコンドリア機能、特に2型糖尿病または化学療法によって誘発される神経障害を共有する。これらの疾患では、ミトコンドリア酸化的リン酸化の障害が疾患の発症を決定する唯一の徴候である。この方法は、ミトコンドリア疾患メカニズムの調査、ミトコンドリアブースターまたは改善された神経因性疼痛などの治療法の探索により、神経生物学、生化学、および薬理学への洞察を提供する。
まず、2.1ミリリットルのMRバッファーを各チャンバーにピペッティングして酸素センサーを校正します。ストッパーで閉じ、気泡が形成されるまでチャンバーに空気を吸い込みます。質量あたりの酸素流束が安定するまで、校正モードで37°Cで1時間攪拌します。
HRRソフトウェアを使用して、製造元の指示に従って、ポラログラフィック酸素センサーの空気校正を実行します。組織調製のために、坐骨神経をそれを覆うのに十分なTP緩衝液を含むペトリ皿に入れる。鉗子で神経の一方の端を保持し、別のペアの鉗子で神経束を水平に引き抜きます。
まず、表示された組織を、組織透過処理用の1ミリリットルのTPバッファーを含む小さな皿に移します。透過処理を開始するには、鉗子で組織を、1ミリリットルあたり50マイクログラムのサポニンを含む1ミリリットルのTPバッファーを含む別のディッシュに移します。プレートをマイクロプレートシェーカーに入れ、30分間穏やかにかき混ぜる。
次いで、鉗子で組織を1ミリリットルのMR緩衝液を含む新鮮な皿に移し、10分間穏やかに撹拌させる。鉗子で組織を較正されたHRRチャンバーに移す。HRRチャンバを2.1ミリリットルのMRバッファーで満たします。
Amplex Redおよびペルオキシダーゼを、それぞれ5マイクロモル、および1ミリリットルあたり2単位の最終濃度に加える。次に、透過性坐骨神経を追加します。機器の蛍光センサーを取り付けます。
次に、ソフトウェアのコントロールセクションのライトをオフにし、ソフトウェアのオキシグラフに接続「プロトコルの編集に進む」をクリックし、組織重量を挿入します。レイアウトに移動し、単位サンプルあたりの特定のフラックスを選択します"オプション。次に、酸素消費量の読み出し、および必要に応じて過酸化水素の生産に同時にアクセスするプロットを選択します。
約 10 分間待ちます。チャンバーの校正のために、過酸化水素の2つのパルスを、それぞれが260マイクロモルの最終濃度に注入する。ミトコンドリア複合体II基質であるコハク酸塩20マイクロリットルを注入し、ミトコンドリア電子伝達系を活性化する。
ATP合成を活性化するために20マイクロリットルのADPを加える。順番に、膜完全性の指標として5マイクロリットルのシトクロムcを加える。酸素消費量のさらなる減少が観察されなくなるまで、オリゴマイシン1ミリリットルあたり0.2マイクログラムのアリコートで滴定する。
酸素消費量のさらなる増加が観察されなくなるまで、ミトコンドリアアンカプラーであるFCCP当たり0.5マイクロモルのアリコートで滴定する。実験を終了するには、2マイクロリットルの抗マイシンAを注入し、5ミリモルの最終濃度を行い、流れが安定するのを待つ。コマンド バーに移動します。
ソフトウェアで多感覚"を検索します。コントロールをクリックしてから、ファイルを保存を押して切断します。保存したファイルを開き、質量トレイあたりの酸素フラックスを選択して、実験酸素消費量の結果を取得します。
注射とインジェクションの間のウィンドウを手動で選択するには、Shift キーとマウスの左ボタンを押します。マークに移動し、統計を選択して、基質、阻害剤、およびアンカプラプロトコルの各注入の結果を視覚化します。過酸化水素製造の場合、アンプスロープトレースで同様の手順を実行します。
ATPシターゼ活性によって促進される膜電位の低下は、酸素消費を加速した。外因性シトクロムCの添加は、呼吸の最小限の刺激のみを促進し、この調製物のミトコンドリア外膜完全性を証明した。絶対酸素流が記録され、呼吸において6.3%の増加のみが観察され、組織調製物の良好な品質を示した。
酸素消費量とROS生成を、電子輸送系に燃料を供給する異なる基質の存在下で同時に測定した。ミトコンドリア複合体に対するピルビン酸とリンゴ酸の添加は呼吸を増加させた。そして複合体IIに対するコハク酸塩のさらなる添加はまた、酸素消費を増加させる。
したがって、他の基板を試験することができた。ROSの生成も増加し、電子輸送系からの酸素の漏れを示している。飽和濃度にアデノシン二リン酸を添加すると、酸素消費量が増加し、ATP形成が促進され、ROS産生が減少した。
対照的に、オリゴ滴定は酸素消費量を減少させ、ROS産生を増加させた。これは、透過した坐骨神経がミトコンドリア生理学における標準的な関係を再現できることを示唆した。FCCPおよびレチノンの添加は、予想される酸素流束変化と整合し、ミトコンドリア生理学および生体エネルギープロファイルが透過した坐骨神経において保存されたことを確認する。
最も重要なステップは、組織切片を穏やかに調製し、すべてのチャンバー開口部が適切に洗浄されていることを確認することです。ミトコンドリア機能の変化は、機能不全またはミトコンドリア数の低下に起因する可能性がある。従って引用された合成酵素活性およびミトコンドリアDNA含量確認はPCRによる推奨される。
