ウマ骨格筋の高分解能蛍光呼吸測定

これらのプロトコルにより、研究者は単にミトコンドリアの酸素消費量を測定するだけでなく、主要なミトコンドリアの最終産物、ATP、活性酸素種の測定が可能になります。この技術の主な利点は、研究者が酸素消費速度を最終製品生産速度と直接比較することにより、ミトコンドリア効率を測定できることです。最終製品がATPか活性酸素か。

テクニックは、特に気泡を避けるために、細部に非常に注意深い注意を払う必要があります。呼吸室であろうと滴定注射器であろうと、気泡は測定の精度を低下させるため、敵です。骨格筋生検を取得した後。

呼吸計チャンバーをマグネシウムフリーの培地で満たし、インキュベーションチャンバーを密閉します。機器のインキュベーション温度を摂氏38度に設定して、馬の骨格筋の基礎温度を表します。呼吸法チャンバーの底部で回転する磁気攪拌を用いて呼吸媒体の混合を750rpmに設定した。

次に、蛍光センサーとの干渉を避けるためにチャンバー照明をオフにします。800ミリボルトの分極電圧で酸素電極に通電し、得られた信号を1のゲイン設定で増幅します。2秒ごとに酸素濃度を記録し、酸素フラックスを40秒間にわたる酸素測定の負の傾きとして計算します。

次に、メディアが室内の空気と平衡になるようにして、酸素センサーを調整します。高解像度呼吸計で測定した気圧と標準大気酸素濃度に基づいて、基準酸素分圧を計算します。緑色の蛍光センサーを使用して、呼吸室からの蛍光信号を定量化します。

400〜500ミリボルトでセンサーに通電すると、結果の信号が1〜1, 000のゲインで増幅されます。次に、ミトコンドリアを添加する前にTMRMを呼吸室に添加し、蛍光シグナルとミトコンドリア添加前の蛍光色素添加量の簡単な2点校正を用いて蛍光シグナルを較正します。呼吸滴定プロトコルの完了後、ミトコンドリア膜電位の完全な崩壊を示すTMRM蛍光シグナルのさらなる増加が観察されなくなるまで、脱共役剤の滴定を数回送達することにより、TMRMシグナルの最終較正を実行します。

青色蛍光センサーを使用して、呼吸室からの蛍光信号を定量化し、個々の機器に対してこれらのセンサーに電力を供給して、センサーの線形範囲内で予想される信号をキャプチャします。8マイクロリットルの2ミリモルEDTAを呼吸室に追加して、マグネシウムグリーンへの結合についてマグネシウムイオンと競合する陽イオンをキレートします。次に、4マイクロリットルの1ミリモルマグネシウムグリーンを呼吸室に加えます。

100ミリモルの塩化マグネシウムを10 x 2マイクロリットルの連続滴定で生の蛍光シグナルを校正し、滴定の間に1分間待って蛍光シグナルを安定させます。プロトコル全体にわたるATPの濃度の経時的な傾きであるATTP合成速度を決定します。緑色の蛍光センサーを使用して、呼吸室からの蛍光信号を定量化します。

300〜400ミリボルトでセンサーに通電します。そして、結果として生じる信号は、1〜1, 000のゲインで増幅されます。個々の計測器の特定の設定を最適化して、センサーの線形範囲内で予想される信号をキャプチャします。

ミトコンドリアを添加する前に、アンプレックスUltraRedアッセイの化学的セットアップと初期キャリブレーションを実行します。30マイクロモルのDTPAを加えて、反応を妨げる可能性のある陽イオンをキレートします。次に、スーパーオキシドジスムターゼまたはセラタスペルオキシダーゼとアンプレックスUltraRedを呼吸測定チャンバーに追加します。

蛍光シグナルが安定するまで待ちます。次に、0.2マイクロモルの過酸化水素を5分間隔で2回加えます。アッセイ全体で追加の2点キャリブレーションを実行して、研究者の裁量でこれらのキャリブレーションポイントの特定のタイミングで呼吸測定の化学的性質がアッセイ全体で変化するにつれて、アッセイの応答性を調整できるようにします。

均一なサンプル懸濁液を維持するためにサンプルをボルテックスし、15マイクロリットルの単離されたミトコンドリア懸濁液を各2ミリリットルのインキュベーションチャンバーに追加して、結果が18.75ミリグラムの筋肉のミトコンドリア収量を表すようにします。基質を添加する前に、残留酸素消費量を測定し、完了後の基質非共役阻害剤滴定またはSUITプロトコルの各ステップの酸素消費量値からこの値を差し引きます。馬の骨格筋ミトコンドリア機能の初期特性評価を可能にする汎用SUITを使用してください。

ピルビン酸、グルタミン酸、リンゴ酸塩を各チャンバーに順次滴定してニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生成し、複雑な1ベースのリークを介して酸化されたNADHによってサポートされる非リン酸化呼吸を刺激します。次にADPを追加して、複雑なものを介してリン酸化呼吸を刺激します リン酸化呼吸。コハク酸塩を追加して、複合体1と複合体2のリン酸化呼吸を組み合わせてリン酸化呼吸を生成します 複合体1をブロックするためにロテノンを追加します。

得られた酸素フラックスは、コハク酸塩単独の酸化によるミトコンドリア酸素消費を支持する複合体2の能力を表す。ウマ骨格筋ミトコンドリア呼吸および相対膜電位の高解像度呼吸測定トレースが示されている。TMRMでインキュベートしたミトコンドリアの呼吸値は、その蛍光色素の阻害効果により低くなります。

ミトコンドリア高含有タイプ1骨格筋線維を高い割合で含有し、安静時代謝に近い条件下でインキュベートしたウマ骨格筋のミトコンドリア呼吸およびATTP合成が示されている。ウマ骨格筋ミトコンドリア呼吸および過酸化水素産生の呼吸測定トレースが示されている。高解像度の肺活量測定には多くの忍耐が必要です。

アッセイを実行する人には、定常状態に達し、次のステップが発生する可能性があるかどうかについて判断を下す必要がある多くの時点があります。単一の滴定プロトコルのみを示しました。ミトコンドリア代謝に関する特定の質問に対処するために同じ方法で適用できるプロトコルはさらに数十あります。