単離した脳細胞懸濁液を300Gで8分間遠心分離することから始めます。ペレットを0.5%BSA溶液を含む80マイクロリットルのHBSSに再懸濁します。20マイクロリットルの非神経細胞ビオチン抗体カクテルを加えてインキュベートします。
0.5%BSAを含む2ミリリットルのHBSSで細胞を洗浄します。次に、遠心分離機ペレットを0.5%BSAを含む80マイクロリットルのHBSSに再懸濁します。次に、20マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズとピペットを加えて完全に混合します。
コールドインキュベーション後、0.5ミリリットルのHBSS BSA溶液を加える。0.5%BSAを含む0.5ミリリットルのHBSSでカラムをすすぐ前に、スタンドをセットアップします。次に、カラムの下に15ミリリットルのチューブを置き、0.5ミリリットルの細胞懸濁液をそれに通します。
残留神経細胞を捕捉するために、0.5%BSA溶液を含む0.5ミリリットルのHBSSで3回洗浄します。磁石からカラムを取り外し、新しい15ミリリットルのチューブの中に置きます。0.5%BSAを含む1ミリリットルのHBSSを追加し、プランジャーを使用して磁気標識された非神経細胞を収集します。
細胞を遠心分離した後、細胞を0.5%BSA溶液で1ミリリットルのHBSSに再懸濁します。明視野顕微鏡下でノイバウアー計数チャンバーで細胞をカウントします。LepR陽性ニューロンは48時間後に神経突起を形成し始めた。
DIV4では、軸索伸長が進行を示し、樹状突起が現れ始めた。DIV6では、ニューロンは十分に発達していた。免疫蛍光研究は、グリア細胞または他の非神経細胞が観察されないことを示した。
細胞の神経細胞性を微小管関連タンパク質2染色により確認した。DIV10では、LepR陽性細胞の30%がPOMCを発現した。シナプスの接続性と機能性は、不均一な視床下部ニューロン集団を含む一般的な培養で観察されました。
