マウスピュアな神経細胞懸濁液を300 Gで8分間遠心分離することから始めます。上清を穏やかに吸引し、ペレットを0.5 BSA溶液を含む80マイクロリットルのHBSSに再懸濁します。特異的抗体を添加した後、チューブを摂氏4度で10分間インキュベートします。
余分な抗体をHBSS-BSA溶液で洗浄し、遠心分離機で洗浄します。20マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズをペレットに加え、HBSS-BSAに再懸濁する。チューブを摂氏4度で10分間インキュベートします。
次に、7つのセルに10個ごとに0.5%BSA溶液を含む0.5ミリリットルのHBSSを追加します。0.5%BSA溶液を含む0.5ミリリットルのHBSSでカラムをすすぎます。滴下が止まったら、15ミリリットルのチューブをカラムの下に置き、0.5ミリリットルの細胞懸濁液をカラムに通します。
非特異的神経細胞を含む溶出液を回収し、0.5%BSAを含む0.5ミリリットルのHBSSを3回洗浄してカラムを洗浄します。次に、磁石からカラムを取り外し、新しい15ミリリットルのチューブに入れます。0.5%BSAを含む1ミリリットルのHBSSを追加し、プランジャーを使用して標的細胞を洗い流します。
遠心分離および上清吸引の後、ペレットを0.5ミリリットルのメッキ培地に再懸濁する。明視野顕微鏡下でノイバウアー計数チャンバー内の細胞をカウントします。調製した24ウェルプレートに、標的細胞をポジティブコントロールとして、非特異的細胞をネガティブコントロールとしてプレートします。
摂氏37度で12時間インキュベートします。LepR陽性ニューロンは48時間後に神経突起を形成し始めた。DIV4では、軸索伸展が進行し、樹状突起が現れ始めた。
DIV6では、ニューロンは十分に発達していた。免疫蛍光研究は、グリア細胞または他の非神経細胞が観察されないことを示した。細胞の神経細胞性を微小管関連タンパク質2染色により確認した。
DIV10では、LepR陽性細胞の30%がPOMCを発現した。シナプス結合性および機能性は、不均一な視床下部ニューロン集団を含む一般的な培養において観察された。
