新しいポンプフリーのマルチチャンネルフロー培養システムをセットアップするには、培地リザーバーモジュールまたはMRMを組み立てた後、チューブアセンブリをその中に挿入し、MRMをヒーターに入れます。ヒーターを所定の位置に固定した後、組織チャンバーアセンブリまたはTCAを灌流チャンバーモジュールまたはPCMに挿入します。TCA 挿入ツールを使用して、8 つの TCA を 1 つずつ PCM の穴に挿入します。
各チャンバーの周りのチューブスリーブの上部がPCMの穴を囲む表面に触れるまで、ツールでアダプターをしっかりと押してください。部分的に組み立てた PCM を、PCM ブレースと 6 本のネジと共に脇に置いておきます。エンクロージャーアセンブリの30分後、MRMが目的の温度に達した後、50ミリリットルのピペットを使用して、液体を側面に静かに分散させることにより、事前に平衡化した灌流液を予熱したMRMインサートに移します。
次に、PCM を MRM に配置するには、PCM の底部から出ている TCA 抵抗管を MRM インサートに MRM インサート (MRM ディバイダの両側に 4 本ずつ) を挿入します。配置したら、組織チャンバーが酸素検出器に対して載るようにモジュールの向きを合わせます。6本のネジと電動ドライバーを使用して、PCMをサポートブレースに固定します。
次に、付属のゴムバンドを使用してTCAをPCMサポートフィン内に固定し、ゴムガスケットの高さでフィンの周りに伸ばします。酸素検知器を検知器スタンドに置き、その面がPCMフィンに当たるようにします。検出器ホルダーの側面にセットされたネジを緩め、必要に応じて検出器の横方向のガイドを調整することにより、LED光検出器ペアを組織チャンバー内の酸素感受性色素に合わせます。
最後に、筐体の上に蓋を置きます。ティッシュをチャンバーにロードするには、培地レベルが上から0.5インチになるまで待ちます。採取した網膜またはRPE脈絡膜強膜を装填するには、細い点鉗子を使用して、網膜を各チャンバーに折りたまずに静かに配置します。
その間、ティッシュワイプを使用して、ティッシュチャンバーの液体が酸素センサーに滴り落ちるのを防ぎます。組織をFRETに向かって沈めます。トランズウェルメンブレンにRPE細胞をロードするには、調製した細胞を0.25%トリプシンEDTAで継代した後、孔径0.4 mmのポリエチレンテレフタレートトラックエッチングフィルターに播種します。
実験当日は、膜を3等幅の短冊状に切断し、鉗子を用いて組織室に装填する。網膜の酸素消費率(OCR)は、試験化合物が注入されている間一定であり、組織の健康と機能が安定していることを示し、方法の妥当性を裏付けています。網膜とRPE脈絡膜強膜の両方について従来の灌流法を使用して得られたデータと一致して、OCRはオリゴマイシンに反応して減少し、FCCPに反応して増加しました。.
観察された乳酸産生速度またはLPRの変化は、OCRで観察された変化とは逆でした。これまでフローシステムで分析されたことのないRPE細胞は、この方法を使用してRPE脈絡膜強膜と同様に応答しました。
